Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Gør-det-selv enhed for inddrivelse af Kryopræserverede Prøver uheld faldt i Kryogene lagertanke

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Her præsenterer vi en lav pris, holdbar cryotolerant enhed til prøve hentning fra Dewar tanke fyldt med flydende nitrogen. Den lette konstruktion og modulopbygning af enheden gør processen med at prøve hentning fra kryogene tanke sikkert og nemt.

Abstract

Flydende nitrogen er farveløs, lugtfri, ekstremt koldt (-196 ° C) væske holdes under tryk. Det er almindeligt anvendt som et kryogent fluid til langtidsopbevaring af biologiske materialer, såsom blod, celler og væv 1,2. Den kryogene karakter af flydende nitrogen, mens ideel til prøve konservering, kan forårsage hurtig nedfrysning af levende væv på kontakt - kendt som 'kryogene brænde "2, hvilket kan føre til alvorlige forfrysninger i personer, der er tæt involveret i lagring og fremfinding af prøver fra dewarkar. Derudover, som flydende kvælstof fordamper det reducerer iltindholdet i luften og kan forårsage asfyksi, især i lukkede rum 2.

I laboratorier, er biologiske prøver opbevares ofte i kryoglas eller cryoboxes stablet i rustfrit stål stativer i dewar-karret tankene 1. Disse lagerreoler er forsynet med et langt skaft for at forhindre kasser i at glide ud fra stativerne og ind i bunden afDewarkar under rutinemæssig håndtering. Alt for ofte, dog kasser eller hætteglas med værdifulde prøver glider ud og synke til bunds i flydende nitrogen fyldt tank. I sådanne tilfælde kunne prøverne kedelig hentet efter overførsel af det flydende nitrogen ind i et ekstra beholder eller kassere den. De bokse og hætteglas kan derefter være relativt sikkert inddrives fra tømmes Dewar. Imidlertid kryogene arten af ​​flydende nitrogen og ekspansionshastigheden gør forsænket sample-hentning farligt. Det er almindeligt anbefalet af Safety Kontorer at prøve hentning aldrig skal udføres af en enkelt person. Et andet alternativ er at bruge kommercielt tilgængelige kølige grabbers eller tænger at trække sig ud hætteglassene 3. Dog begrænset synlighed inden for de mørke væskefyldte dewarkar udgør en væsentlig begrænsning i deres anvendelse.

I denne artikel beskriver vi konstruktionen af ​​en Cryotolerant DIY udtagningsindretningen, hvilket gør prøven hentning fra Dewar indeholder kryogene væsker både sikker ennd nemme.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Montering af Cryotolerant Anordning til hentning af Cryoboxes

  1. Hjælp af en tang, udjævne den ene side af tre sider Strong-Tie (figur 1A) til at foretage en L-formet Strong-Tie vist i figur 1B. Bemærk: Dimensionerne af Strong-Tie kan vælges afhængigt af diameteren af halsen af Dewar .
  2. Fastgør to så stærke-bånd med en Strong-Tie T-rem (fig. 2) ved hjælp Crown møtrik, skive og skrue til at danne Cryoscoop basen, som vist i figur 3 (AB). Bemærk: To stærke bånd bruges til at tillade hentning af 5 ½ in X 5 ½ in cryoboxes.
  3. Ved hjælp af en slidset plade (Figur 4), Juster rillerne på Strong-Tie T rem med slots i den ene ende af den rillede plade og sikre de to sammen med hjælp af Hillman møtrik og bolte (fig. 5). Bemærk: Hvis opslidset plade og stærk TIE'erne ikke comig med pre-borede huller, bliver du nødt til at have huller boret ved hjælp af hårdmetal bor.
  4. Bøje den anden ende af det opslidsede pladen ved hjælp af tænger som vist i figur 6. (Dette trin er valgfrit).
  5. Omvikles håndtaget med skum bedre forstå enheden i flydende nitrogen, som vist i figur 6. (Valgfrit) Bemærk: Fjern skummet før autoklavering.

2. Montering af Cryotolerant Anordning til hentning af kryohætteglas

Den Cryotolerant DIY indfangningsanordning kan også være indrettet til hentning af kryoglas. Dette indebærer at substituere den flade bund med en rustfri si, som vist ændret til øse ud hætteglas fra flydende nitrogen (figur 7).

  1. Skrue kronen møtrikker og bolte, der er knyttet til Strong-Tie T rem til opslidsede pladen.
  2. Før du monterer rustfri si til opslidsede pladen, bøje forsigtigt halssien ved hjælp af tænger til at orientere basen i en vinkel til at ligne en grydeske (figur 8) Bemærk: Hvis sien kommer med en læbe, bruge en tang til at bøje læben ned, dette vil gøre at manøvrere med enheden nemmere..
  3. Juster hul på håndtag si sammen med hullerne på slidsede pladen og fastgør den si med hjælp af Hillman møtrikker og bolte som vist i figur 8. Bemærk: hvis filteret ikke kommer med pre-borede huller, skal du bruge at sørge for at få huller boret med hårdmetal bor.

3. Henter Cryoboxes og kryohætteglas Fra Dewar

  1. Til at begynde, sat på kryogene handsker og fjerne 1 eller 2 fryser racks fra Dewar at give plads til manøvrering.
  2. Forsigtigt skrabe langs bunden af Dewar med opretstående Cryotolerant DIY indfangningsanordning forsynet med Strong-Tie T rem base (fig. 5) og opsamles kassen fallen til bunden af Dewar tanken. Bemærk: Flydende nitrogen koger umiddelbart ved kontakt med en varmere objekt, omslutter genstanden i isolerende nitrogengas (Leidenfrost virkning). At afkøle enheden forud for udtagning af prøver, langsomt nedsænkes indretningen i Dewar og tillade flydende nitrogen for at afkøle indretningen tilstrækkeligt inden der fortsættes med det ovennævnte trin.
  3. Trække indretningen opretstående langs væggene af Dewar at score fryseren boksen ud af tanken.
  4. Fat kassen hentes fra bunden af ​​Dewar.
  5. Til hentning kryoglas, skrabes forsigtigt bunden af Dewar med cryoscoop forsynet med en si (figur 9).
  6. Svarende til cryobox søgning, skal du trække enheden oprejst og få fat hætteglassene opsamlet i filteret.

4. Repræsentative resultater

En stor udfordring i genekspressionsstudier er, at kvaliteten af ​​RNA afhænger opbevaringsbetingelserfor begge frosne vævsprøver og ekstraheret RNA 4. Figur 10 viser virkningen af prøvehåndtering af integriteten af totalt RNA. Totalt RNA fra det samme væv kilde (human fedt) blev underkastet anden håndtering af prøven. Forud for forsøget intakt total RNA preparate viser tydelige 28S og 18S rRNA-bånd med 28S rRNA båndet tilnærmelsesvis dobbelt så intens som den 18S rRNA-bånd (fig. 10, bane 1). Dette 2:1 (28S: 18S) er en indikation af, at RNA er intakt, medens delvist nedbrudt RNA vises som en udstrygning, eller 28S: 18S intensitetsforhold afviger fra 02:01 5. Banerne 3-4 viser RNA-prøver med betydelig nedbrydning. Disse RNA-prøver blev underkastet gentagen delvis defreezing af korte søgninger i Dewar (metode A), således at modellere langtidsopbevaring med periodisk dekantering grund nødvendigt for udlæsning af faldne hætteglas og æsker (figur 10, bane 3-4 ). Imidlertid prøverne opbevaret i Dewar serviceresanvendelse DIY anordning (metode B), og derfor ingen partiel defreezing indeholder intakt RNA (fig. 10, bane 2).

Figur 1
Figur 1. A) Bunden består af to 3 sidede Strong-Tie af viste dimensioner. Hver Strong-Tie indeholder en stor forboret hul (udfyldt pil), og flere mindre huller (lille pil) på hver flade. Dette giver en mulighed for at tillade fastgørelse med møtrik og bolte. Også de mindre huller tillade hurtig dræning af flydende nitrogen i sample-hentning. B) Den ene side af hver af Strong-Tie rettes ved hjælp af tænger til at L-formet Strong-Tie.

Figur 2
Figur 2. Strong-Tie T rem anvendes til at fastgøre den stærke bånd sammen. Ligesom Strong-Tie, har T-strop et stort forboret hul (udfyldt pil), og to mindre huller (SmaIl pil) på hvert hjørne. Dette tillader fastgørelse stærk-bånd langs længden af ​​T - rem med møtrikker og bolte. Det giver også mulighed for fastgørelse af T-rem til opslidsede pladen.

Figur 3
Figur 3. A) hver Strong-Tie er fastgjort til et hjørne af T-rem, langs dens længde ved hjælp af krone bolt møtrikker, bolte og skiver. B) To stærke-bånd er fastgjort ved siden af hinanden for at hjælpe hente 5 ½ i. X 5 ½ i. cryoboxes. For mindre cryoboxes såsom 2 tommer x 2 tommer, kan en enkelt Strong-Tie fastgøres direkte til den opslidsede pladen uden en T-rem.

Figur 4
Figur 4. Slidset flad plade anvendes som håndtag. Længden af ​​den slidsede pladen afhænger dybden af ​​Dewar. I dette tilfælde blev 4 fod opslidsede plader anvendes. Tykkelsen af ​​opslidsede plader er kritisk siden tynde aflange plader (<14 gauges) gør enheden spinkle under hentning af prøver fra flydende nitrogen fyldt Dewar.

Figur 5
Figur 5. Den flade bund bestående af stærke-bånd og T strop derefter fastgjort ved den ene ende af det opslidsede pladen. Jo større hul på den resterende hjørnet af T rem flugter med stikket på den flade plade og fastgøres ved hjælp af hex bolt og møtrik. Denne enhed kan nu bruges til at hente cryoboxes fra Dewar.

Figur 6
Figur 6. Ene ende af det opslidsede flade plade bukkes ved hjælp af tænger og dækket med skum for at tilvejebringe bedre greb især dybe dewarkar, som vist i dette tilfælde.

Figur 7
Figur 7. Si med trådnet og rustfrit stålbenyttes til at hente kryoglas fra Dewar. Hvis håndtaget ikke er forsynet med en slids til at bore med hårdmetal bit vil være påkrævet til at bore et hul.

Figur 8
Figur 8. At lette genfinding af kryohætteglas, er si bøjet langs halsen hjælp af en tang til at få øse formet si. Hvis si er forsynet med læbe, som i dette tilfælde kan tænger anvendes til at bøje dem. Dette sikrer si ikke bliver fanget i Dewar.

Figur 9
Figur 9. Si er fastgjort til den opslidsede flade plade ved den ene ende ved hjælp af møtrikken og bolten.

Figur 10
Figur 10. Prøve integriteten af total RNA udsættes for forskellige prøvehåndtering vilkår. At undersøge, hvordan RNA kvalitet påvirkes af prøvehåndtering cETINGELSER, blev et sæt af RNA-prøver fra samme kilde underkastet to metoder håndteringer. Metode A bestod af lagring af RNA i Dewar underkastes prøven søgninger under anvendelse DIY enhed, således ingen partiel defreezing. Metode B bestod af opbevaring af RNA i Dewar udsættes for gentagen partiel defreezing af kortsigtede søgninger fra Dewar og dermed modellering langtidsopbevaring med periodisk dekantering for at hente faldne prøver. Total RNA-integritet blev derefter analyseret ved gelelektroforese. Lane1: Prøve før lagring i Dewar, bane 2: Prøve fra Dewar underkastet selektion med metode A, bane 3, 4: Prøve fra Dewar underkastet selektion ved metode B; M: 100 bp stige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En af de mest almindelige metoder til hentning cryoboxes og kryoglas fra bunden af ​​Dewar tanken er at dekantere flydende nitrogen i en ekstra beholder og træk prøverne tilbage i kolben eller flydende i den dekanterede væske nitrogen. Dette er dog en usikker praksis, der kan forårsage kryogeniske forbrændinger eller kvælningsrisiko som følge af langvarig udsættelse for flydende nitrogen dampe 2. Andre almindelige måde at hente de faldne kryohætteglas indebærer brug af cryovial tænger 3. Imidlertid begrænset synlighed i det mørke rum i beholderen fyldt med flydende nitrogen begrænser deres manøvreevne.

Den Cryotolerant DIY indfangningsanordning beskrevet ovenfor tilvejebringer en billigere, mere sikker og lettere alternativ til hentning faldne cryoboxes og kryoglas fra bunden af ​​dybe kolber med begrænset synlighed. Den lette håndtering af DIY indfangningsanordningen omgår behovet for at tømme kolberne før udtagning. Endvidere RETrieval af kryoglas ved hjælp af indretningen kan udføres af en enkelt person. Derudover anvendelsen af DIY udtagningsindretning væsentligt forkorter den mængde af tid andre prøver opbevaret i samme enhed bruger under omgivelsestemperatur, og derved forbedre prøve opbevaringsbetingelser 6,7.

Mange almindeligt anvendte materialer, såsom plast, stål og gummi bliver skør i flydende nitrogen, og ofte brud under stress 8,9,10. De rustfrit stål eller galvaniseret komponenter, der anvendes i DIY enheden er modstandsdygtige over for skader fra temperaturer omkring frysepunktet af kryogene væsker. Desuden er disse komponenter er let tilgængelige i lokale isenkræmmere og lave omkostninger med opførelsen af ​​DIY-enhed svarende til mindre end $ 50,00. Den lange håndtag hjælper med at forhindre operatøren i direkte kontakt med kryogene væsker og perforeret bund og si tillader øjeblikkelig tømning af flydende nitrogen under prøve opsving. Den hurtige retrieval giver minimum udsættelse for flydende nitrogen dampe gør prøve hentning en mere sikker proces. På grund af det modulære design gør det selv indfangningsanordningen har fleksibiliteten til at blive anvendt til enten kasser eller hætteglas. Yderligere, enkle design gør enheden til at blive tilpasset for dewarkar af varierende former og størrelser og eventuelt til at arbejde med andre typer af kryogene væsker. Anvendelse af denne anordning kan imidlertid være begrænset i tilfælde af kryogene tanke, der ikke har en flad bund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

DIY kryogene udtagningsindretningen var blevet testet i løbet af de projekter, "Modeling bakterielt protein prenylering i eukaryote celler ved hjælp af bioinformatik og molekylære metoder" sponsoreret af Mary Louise Andrews Award for Cancer Research program, Virginia Academy of Science, "fysiologisk Betydning af RNA redigering i Plasma dendritiske celler "sponsoreret af The Thomas F. Jeffress og Kate Miller Jeffress Memorial Trust og stat Kontrakt 16.740.11.0364 (Ministeriet for videnskab og uddannelse, Rusland). Vi vil gerne takke Beth Eom for at få hjælp med RNA integritet eksperimentet.

References

  1. Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. Springer. 41 (1996).
  2. Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. Plenum Press. New York. (1996).
  3. Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. National Academies Press. (2011).
  4. Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
  5. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  6. Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
  7. Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. 106-111 (2003).
  8. Crawford, R. J. Plastics Engineering. Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
  9. Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. University of New South Wales Press. (1996).
  10. Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. (2003).
Gør-det-selv enhed for inddrivelse af Kryopræserverede Prøver uheld faldt i Kryogene lagertanke
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter