Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

doi: 10.3791/3903 Published: May 11, 2012

Summary

Burada sıvı nitrojen dolu Dewar tanklardan numune alımı için düşük maliyetli, dayanıklı cryotolerant cihaz sunuyoruz. Inşaat ve cihaz modüler tasarım kolaylığı kriyojenik tanklarından numune alma işlemi güvenli ve kolay hale getirir.

Abstract

Sıvı nitrojen (-196 ° C) sıvı basıncı altında tutulması son derece soğuk, kokusuz, renksiz. Bu, genellikle kan, hücre ve doku 1,2 gibi biyolojik maddeler uzun süreli depolama için bir kriyojenik sıvısı olarak kullanılır. Sıvı azot kriyojenik doğası, numune korunması için ideal iken, kişi canlı dokuların hızlı dondurma neden olabilir - 'kriyojenik yanık' 2 olarak bilinen, yakın depolama ve Dewar numune alımı ilgili kişiler şiddetli soğuk yakmasına yol açabilir. Ayrıca sıvı azot buharlaşır gibi, havadaki oksijen konsantrasyonu azaltır ve özellikle kapalı alanlarda 2, asfiksi neden olabilir.

Laboratuvarlarımızda, biyolojik örnekler genellikle Dewar tankları 1 içinde paslanmaz çelik raflara yığılmış cryovials veya cryoboxes saklanır. Bu depolama rafları rafları dışarı kaymasını kutuları önlemek için uzun bir şaft ile ve dibine verilmektedirRutin kullanım sırasında Dewar. Tüm çok sık, ancak, değerli örnekleri ile kutular veya şişeleri dışarı kayma ve sıvı nitrojen dolu tankın dibine çöker. Bu gibi durumlarda, numuneler tediously yedek bir kap veya atmadan içine sıvı azot transfer sonra elde edilebilir. Kutuları ve şişeleri sonra nispeten güvenli boşalttı Dewar kurtarıldı olabilir. Ancak, sıvı azot, genişleme hızının kriyojenik doğa batık numune alma tehlikeli hale getirir. Genellikle numune alma tek bir kişi tarafından gerçekleştirilen asla bu Emniyet Müdürlükleri tarafından önerilir. Başka bir alternatif flakon 3 çıkarmak için piyasada bulunan serin gaspçı veya maşa kullanmaktır. Ancak, koyu sıvı dolu Dewar içinde sınırlı görünürlük kullanımı önemli bir sınırlama teşkil etmektedir.

Bu makalede, güvenli bir iki kriyojenik sıvılar içeren Dewar numune alma yapan bir Cryotolerant DIY alma cihazı, inşaat tarifnd kolay.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Cryoboxes Almak İçin Cryotolerant Cihaz Meclisi

  1. . Pense kullanarak, 3 taraflı güçlü bağı (Şekil 1A) yapmak için bir L şeklinde güçlü-kravat Şekil 1B gösterildiği Not bir tarafı düzeltmek: güçlü-kravat boyutları Dewar boyun çapına bağlı olarak seçilebilir .
  2. . Şekil 3 (AB) 'de gösterildiği gibi Cryoscoop temel teşkil Crown somun, pul ve vida kullanarak güçlü bir kravat-T kayışı (Şekil 2) Not böyle iki güçlü bağları Güvenli: İki güçlü bağları alınmasını sağlamak için kullanılır 5 ½ inç X 5 ½ inç cryoboxes.
  3. Bir oluklu levha (Şekil 4) kullanarak, oluklu levha bir ucunda yuvaları ile güçlü-kravat T kayışı yuvalara hizalayın ve Hillman somun ve cıvatalar (Şekil 5) yardımıyla birlikte iki sabitleyin. Not: Eğer oluklu levha ve güçlü bir bağ Kullanıcı birlikte değilBana önceden delinmiş delikleri ile, delik karbür matkap kullanılarak delinmiş sahip olmak zorunda kalacaktır.
  4. Şekil 6'da gösterildiği gibi, pense yardımı ile yarılmış plakanın diğer ucu bükülür. (Bu adım isteğe bağlıdır).
  5. Zaman sıvı azot içinde, Şekil 6'da gösterildiği gibi daha iyi cihazı kavramak için köpük ile sap kaydırılır. (Isteğe bağlı) Not: otoklav öncesinde köpük çıkarın.

2. Cryovials Almak İçin Cryotolerant Cihaz Meclisi

Cryotolerant DIY alma cihazı da cryovials alımı için adapte edilebilir. Bu sıvı azot (Şekil 7) şişeleri dışarı karıştırıyordu değiştirilmiş gösterildiği gibi bir paslanmaz çelik süzgeç ile düz taban yerine içerir.

  1. Sökün Crown fındık ve oluklu levha için güçlü-kravat T kayışı takılarak civatalar.
  2. Oluklu levha paslanmaz çelik süzgeç takmadan önce, hafifçe boyun eğmek., bu kolay cihaz ile manevra yapacak süzgeç bir dudak gelirse, dudak aşağı eğmek için pense kullanın: Bir kepçe (Şekil 8) Not benzemek için bir açıyla yönlendirmek tabanına pense yardımı ile boşaltın.
  3. Oluklu plaka üzerinde delikler ile birlikte süzgeç sap üzerinde delik hizalayın ve Hillman fındık ve Şekil 8'de gösterildiği gibi cıvata yardımıyla Not süzgeci sabitleyin:. Süzgeç ön delikli gelmezse, size ihtiyacınız olacak karbür matkap ile delinmiş deliklere sahip düzenlemek.

3. Dewar itibaren Cryoboxes ve Cryovials alınıyor

  1. Başlamak için, kriyojenik eldiven takın ve manevra için oda izin Dewar 1 veya 2 Dondurucu rafları çıkarın.
  2. Yavaşça güçlü-kravat T taban kayışı (Şekil 5) ile donatılmış dik Cryotolerant DIY alma cihazı ile Dewar alt kısmındaki kazıyorum ve kutu falle toplamak, hemen bir ılımanlaştırma nesne ile temas üzerine Sıvı azot kaynar azot gazı (Leidenfrost etkisi) yalıtım nesnesi zarflama. Dewar tankı Not altına n. Örneklerin alma önce cihaza soğutmak için, yavaş yavaş Dewar içine batırmak cihazı ve sıvı azot yukarıda adım geçmeden önce yeterince cihazı soğutulur.
  3. Tankın dışına dondurucu kutusunun oymak için Dewar duvarları boyunca dik cihazı çekin.
  4. Dewar altına alınan kutu tut.
  5. Cryovials almak için, hafifçe bir süzgeç (Şekil 9) ile donatılmış cryoscoop ile Dewar alt kazıyın.
  6. Cryobox alma benzer, dik cihaz çekin ve süzgeç toplanan şişeleri yakala.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Gen çalışmaları büyük bir zorluk RNA kalitesini saklama koşullarına bağlı olduğunudondurulmuş doku örnekleri ve RNA 4 ayıklanır. Şekil 10 ikisi için toplam RNA bütünlüğü üzerine numune işleme etkisini gösterir. Aynı doku kaynağı (insan adipoz) toplam RNA farklı numune işleme tabi tutuldu. Önce deneme için, sağlam toplam RNA preperatı yaklaşık iki kat 18S rRNA bant (Şekil 10, hat 1) gibi yoğun olarak 28S rRNA bandı ile net 28S ve 18S rRNA bantları gösterir. 18S yoğunluk oranı 2:1 5 ayrılmaktadır: Bu, 2:1 oranında (28S: 18S) kısmen bozulmuş RNA yayma, ya da 28S olarak görünürken, RNA sağlam olduğunu bir göstergesidir. 3-4 Lanes önemli ölçüde bozulma ile RNA örnekleri gösteriyor. Bu RNA örnekleri böylece periyodik düşmüş şişeleri ve kutuları hatırlama (Şekil 10, Lane 3-4 gerekliliği nedeniyle boşaltılması ile uzun süreli depolama modelleme, Dewar (Yöntem A) kısa vadeli alımlar tarafından tekrar kısmi defreezing tabi tutuldu ). Bununla birlikte, örnekler Dewar servisli saklananDIY cihazı (Yöntem B) kullanılarak ve böylece herhangi bir kısmi defreezing, bozulmamış RNA (Şekil 10, Lane 2) içerir.

Şekil 1
Şekil 1.. A) 3 temel iki taraflı güçlü-kravat gösterilen boyutları oluşur. Her güçlü-kravat büyük bir önceden delinmiş delik (katı ok) ve her yüzünde birden fazla küçük delik (küçük ok) içerir. Bu somun ve civata ile bağlantı sağlamak için bir seçenek sağlar. Ayrıca küçük delikler numune alımı sırasında sıvı azot hızlı drenaj sağlar. B) güçlü-kravat her bir tarafı L şeklinde güçlü-kravat yapmak için pense yardımı ile doğruldu edilir.

Şekil 2
Şekil 2. Güçlü-kravat T kayışı birlikte güçlü bağları korumak için kullanılır. Güçlü-kravat gibi, T-kayışı büyük bir önceden delinmiş delik (katı ok) ve iki küçük delik (smal varHer köşesinde l ok). Somun ve cıvata kullanılarak Askı - Bu T uzunluğu boyunca güçlü bağları güvence sağlar. Ayrıca, yarıklı plakasına T-kayışı sabitleme sağlar.

Şekil 3
Şekil 3. A) Her bir güçlü-kravat) B. Taç cıvata somun, cıvata ve pullar kullanarak uzunluğu boyunca, T-kayışı bir köşesine bağlanır İki güçlü bağları 5 ½ inç X 5 ½ almak için birbirine bitişik güvenli cryoboxes inç. X 2 inç 2 gibi küçük cryoboxes için içeri, tek bir güçlü-kravat bir T-kemersiz oluklu levha doğrudan bağlanabilir.

Şekil 4
Şekil 4. Düz plaka kolu olarak kullanılır Oluklu. Oluklu plakası uzunluğu Dewar derinliği bağlıdır. Bu durumda, yarıklı plakanın 4 ayak kullanılmıştır. Oluklu levha kalınlığı kritik sDewar dolu sıvı azot örnekler alınırken ince oluklu levhalar (<14 ölçü) cihazı dayanıksız hale ince.

Şekil 5,
Şekil 5. Güçlü bağları ve T kayışı oluşan düz taban sonra oluklu levha bir ucunda sabitlenir. T kayışı kalan köşesinde büyük delik düz plaka üzerinde yuva ile uyumlu ve hex cıvata ve somun ile bağlanır. Bu cihaz şu anda Dewar gelen cryoboxes almak için de kullanılabilir.

Şekil 6
Şekil 6. Oluklu düz plaka bir ucu, pense ile bükülür ve özellikle de, bu durumda gösterilen derin Dewar, daha iyi kavrama sağlamak için köpük ile kaplıdır.

Şekil 7
Şekil 7. Tel örgü ve paslanmaz çelik saplı SüzgeçDewar gelen cryovials almak için kullanılır. Kolu yuvası ile sağlanan değilse, karbür matkap ucu ile delik delmek için gerekli olacaktır.

Şekil 8
Şekil 8. Cryovials alınmasını kolaylaştırmak için, süzgeç kepçe şeklindeki süzgeç almak için pense ile birlikte boyun bükülür. Süzgeç Bu durumda olduğu gibi dudağı sağlanmamışsa, bu pense bükmek için kullanılabilir. Bu süzgeç Dewar içinde yakalanmak değil sağlar.

Şekil 9
Şekil 9. Süzgeç altıgen somun ve cıvata kullanılarak bir ucunda oluklu düz plaka üzerine sabitlenir.

Şekil 10
10 Şekil. RNA örnek bütünlüğünü farklı numune alma şartlarına tabi. Keşfetmek için RNA kalite c işleme örnek tarafından nasıl etkilendiğinionditions, aynı kaynaktan RNA örnekleri arasında bir dizi handlings için iki yöntem tabi tutuldu. Yöntem A böylece DIY cihaz kullanarak örnek almasını tabi Dewar, hiçbir kısmi defreezing RNA depolama oluşuyordu. Yöntem B böylece periyodik düşmüş örnekleri almak için boşaltma ile uzun süreli depolama modelleme, Dewar kısa vadeli alımlar tarafından tekrar kısmi defreezing maruz Dewar RNA depolama oluşuyordu. Toplam RNA bütünlük sonra jel elektroforezi ile analiz edildi. Lane1: Örnek önce Dewar depolama; Lane 2: Yöntem A tarafından alınmalarını tabi Dewar örnek; Lane 3, 4: Yöntem B tarafından alınmalarını tabi Dewar örnek; M: 100 bp merdiveni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dewar tankın dibinden cryoboxes ve cryovials almak en yaygın yöntemlerden biri yedek bir kap içine sıvı azot boşaltacaktır ve şişede kalan veya dekante sıvı azot içinde yüzen örnekleri çekin etmektir. Ancak bu, sıvı azot buharı uzun süre maruz 2. nedeniyle kriyojenik yanıklara veya boğulmaya neden olabilecek güvenli olmayan bir uygulamadır. Düşmüş cryovials alımı Diğer yaygın yolu cryovial maşa 3 kullanımını gerektirir. Bununla birlikte, sıvı azot ile doldurulmuş tankının koyu boşluğu içinde sınırlı bir görüş bunların manevra kısıtlar.

Yukarıda açıklanan Cryotolerant DIY alma cihazı sınırlı görünürlüğü ile derin şişe dibinden düşmüş cryoboxes ve cryovials almak için daha ucuz, daha güvenli ve kolay bir alternatif sunuyor. DIY alma cihazı taşıma kolaylığı alma öncesinde matara boşaltmak için ihtiyaç circumvents. Dahası, retyardımıyla cryovial arasında rieval cihaz tek bir kişi tarafından gerçekleştirilebilir belirtti. Buna ek olarak, DIY alma cihazının kullanımı büyük ölçüde böylece Örnek depolama koşulları 6,7 iyileştirilmesi, aynı ünite çevre sıcaklıklarında altında geçirmek saklanan zamanda diğer örnekleri arasında miktarda kısaltır.

Plastik, karbon çelik ve kauçuk gibi pek çok sık kullanılan malzemeler sıvı azot içinde kırılgan olmasına ve sık sık stres 8,9,10 altında kırılma. DIY cihazda kullanılan paslanmaz çelik veya galvanizli bileşenleri kriyojenik sıvılar sıfırın altındaki sıcaklıklardan zarar dayanıklıdır. Ayrıca, bu bileşenleri yerel donanım mağazalarında ve az $ 50.00 tutarındaki DIY cihazın yapımı ile düşük maliyet kolayca kullanılabilir. Uzun saplı örnek kurtarma sırasında sıvı nitrojen boşalmasını anlık izin kriyojenik sıvılar ve delikli taban ve süzgeç ile direkt temas operatörü önlemeye yardımcı olur. Hızlı retrieval numune alma, daha güvenli bir süreci sıvı nitrojen buharları, minimum poz veriyor. Modüler tasarım sayesinde, DIY alma cihazı kutu veya şişe ya için kullanılacak bir esnekliğe sahiptir. Bundan başka, tasarım basitlik cihazı kriyojenik sıvılarının diğer tipleri ile çalışmak için muhtemelen farklı şekiller ve boyutlar ve Dewar için adapte edilmesini sağlar. Bu cihazın kullanılması, bununla birlikte, düz dipli gerekmez kriyojenik tanklarının durumda sınırlandırılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

DIY kriyojenik alma cihazı projeler Kanser Araştırma programı, Fen Virginia Akademisi Mary Louise Andrews Ödülü sponsorluğunda "biyoinformatik ve moleküler yaklaşımlar kullanılarak ökaryotik hücrelerde Modelleme bakteriyel protein prenylation", "Plazma RNA Düzenleme Fizyolojik Anlam sırasında test edilmiştir Thomas F. Jeffress ve Kate Miller Jeffress Memorial Trust ve Devlet Sözleşme 16.740.11.0364 (Bilim ve Eğitim Bakanlığı, Rusya) tarafından desteklenen dendritik hücreler ". Biz RNA bütünlük deneyi için yardım Beth Eom teşekkür etmek istiyorum.

References

  1. Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. Springer. 41 (1996).
  2. Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. Plenum Press. New York. (1996).
  3. Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. National Academies Press. (2011).
  4. Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
  5. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  6. Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
  7. Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. 106-111 (2003).
  8. Crawford, R. J. Plastics Engineering. Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
  9. Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. University of New South Wales Press. (1996).
  10. Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. (2003).
KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).More

Mehta, R., Baranova, A., Birerdinc, A. Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks . J. Vis. Exp. (63), e3903, doi:10.3791/3903 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter