Summary
النقل إلى الوراء من صبغة الفلورسنت تسميات فرعية السكان من الخلايا العصبية على أساس إسقاط التشريحية. المحاور صفت يمكن استهداف بصريا
Abstract
ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو لتسجيل استجابات حدة واحدة من مجموعة محددة من السكان من الخلايا العصبية. في التسجيلات الكهربية في الجسم الحي من الخلايا العصبية الفردية بالغة الأهمية بالنسبة لفهم كيفية عمل الدوائر العصبية في ظل الظروف الطبيعية. تقليديا، وقد أجريت هذه التسجيلات 'أعمى'، وهذا يعني هوية الخلية سجلت غير معروف في بداية التسجيل. يمكن تحديد هوية الخلوية في وقت لاحق عن طريق الخلايا 1، 2 juxtacellular أو فضفاضة التصحيح 3 الرحلان الشاردي من الصبغة، ولكن لا يمكن مسبقا استهدفت هذه التسجيلات إلى الخلايا العصبية في مناطق محددة وظيفيا مع أنواع الخلايا غير المتجانسة. ويمكن التعبير عن البروتينات الفلورية في A-نوع من الخلايا بطريقة معينة تسمح بصريا موجهة وحيدة الخلية الكهربية 4-6. ومع ذلك، هناك العديد من الأنظمة التي نموذجا لهذه الأدوات الجينية ليست متاحة. حتى في النظم نموذج يمكن الوصول إليها وراثيا، والمرغوب بروMOTER قد يكون غير معروف أو الخلايا العصبية المتجانسة وراثيا قد متفاوتة أنماط الإسقاط. وبالمثل، تم استخدام النواقل الفيروسية لتسمية مجموعات فرعية معينة من الخلايا العصبية الإسقاط 7، ولكن استخدام هذه الطريقة محدود بسبب السمية وعدم التحديد عبر متشابك. وبالتالي، هناك حاجة إلى تقنيات إضافية التي تقدم محدد التصور المسبق لتسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها واحد في الجسم الحي. قبل التصور من الخلايا العصبية المستهدفة هي مفيدة بشكل خاص لظروف التسجيل الصعبة، التي الكلاسيكية التسجيلات وحيدة الخلية غالبا ما تكون صعبة باهظة 8-11. أسلوب الرواية وصفها في هذه الورقة يستخدم النقل إلى الوراء من صبغة الفلورسنت مثبتة باستخدام الإبر التنغستن لبسرعة وبشكل انتقائي تسمية مجموعة فرعية معينة من الخلايا داخل منطقة الدماغ معينة على أساس توقعاتهم محور عصبي فريدة من نوعها، وبالتالي توفير مساعدة مرئية للحصول على التسجيلات الكهربية المستهدفة من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الدائرة سليمة داخلهاNA الفقاريات CNS.
النهوض رواية أهم طريقة لدينا هو استخدام العلامات الفلورية لاستهداف أنواع معينة من الخلايا في نظام نموذجي يمكن الوصول إليها غير وراثيا. الأسماك الكهربائية ضعيفة هي نظام نموذجا ممتازا لدراسة الدوائر العصبية في اليقظة، تتصرف الحيوانات 12. نحن تستخدم هذه التقنية لدراسة المعالجة الحسية عن طريق "خلايا صغيرة" في النواة exterolateral الأمامي (العلا) من الأسماك mormyrid الكهربائية ضعيفة. "خلايا صغيرة" وافترض أن يكون الوقت قد حان الخلايا العصبية مقارنة هامة للكشف عن الاختلافات submillisecond في أوقات وصول من المسامير قبل المشبكي 13. ومع ذلك، جعلت الخصائص التشريحية مثل المايلين الكثيفة، نقاط الاشتباك العصبي التي تجتاح، وأجسام الخلايا الصغيرة من الصعب للغاية لتسجيل من هذه الخلايا باستخدام الطرق التقليدية 11 و 14. هنا علينا أن نبرهن على طريقة رواية عن التسميات انتقائي هذه الخلايا في 28٪ من الاستعدادات، والسماح لموثوق بها، والتسجيلات قوية وشخصيتrization من الردود على التحفيز electrosensory.
Protocol
1. تعد الإبر صبغ المغلفة
- شحذ الكهربائي A 160 ميكرون قطر الأسلاك التنغستن 15. ينبغي إبرة النهائي بأقطار تتراوح من طرف ميكرون 5-50. عدد الإبر اللازمة يعتمد على حجم من وصمها المنطقة. نحن مستعدون 5 إبر للحقن 3-5 في نواة exterolateral الخلفي (ELP).
- في الليلة التي سبقت التجربة، وضع قطرة (<0.25 ميكرولتر) من 2 ملي ديكستران مترافق اليكسا فلور 10،000 ميغاواط صبغ على القاصي 100 ميكرون من كل إبرة.
- السماح للالإبر إلى الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة، وترك صبغ مركزة على الحافة. تخزين الإبر في 4 درجات مئوية في وعاء مظلم لحمايتها من الضوء.
2. إعداد الحيوان للجراحة
- لحث على التخدير العام عن طريق وضع الأسماك في حل من 300 ملغم / لتر MS-222 في خزان المياه.
- تزن السمكة وقياس طول الشوكة (غيض من الخطم إلى شوكة من الزعنفة الذيلية)، وعمق الجسم (القصوى ظهراني ventraمسافة L في الطائرة عرضية). وينبغي لهذه القياسات تقع ضمن نطاقات مبين في الجدول 1 بحيث يناسب الأسماك داخل غرفة تسجيل صغيرة بما يكفي لوضع تحت المجهر الهدف الغمر بالمياه (الشكل 1).
- شل وإسكات كهربائيا الأسماك عن طريق حقن 100 ميكرولتر من 3 ملغ / مل flaxedil في عضلات الجسم الظهرية.
- ملء غرفة تسجيل (الشكل 1A) مع خزان المياه. ضع السمك في جانب بطني أسفل على منصة في وسط الدائرة (الشكل 1). تقديم حل الغازي من 100 ملغم / لتر MS-222 باستخدام طرف ماصة توضع في فم السمكة (1-2 مل / دقيقة). استقرار السمك مع قضبان ثابتة في الشمع وضعت على جانبي الجسم (الشكل 1C). رصد الصحة للأسماك عن طريق التحقق من تدفق الدم المستمر في الأوعية العين ولون الجسم العادية.
- وتناوب على منصة على طول محورها طويل وخفض نهاية الجزء الخلفي من platfمكتب إدارة السجلات بحيث جانب واحد من السطح الظهري للرأس السمكة يتعرض فوق الماء في حين أن بقية جسم السمكة لا تزال تغمرها المياه. ينبغي أن توضع قطعة صغيرة من Kimwipe على أي الجزء غير المغمور من الجلد لمنع جفاف.
3. الجراحة (الشكل 2)
راسخة في إجراء العمليات الجراحية الأساسية الوارد وصفها هنا واستخدامها بشكل موثوق للمكفوفين في الجسم الحي في التسجيلات mormyrids 16. لتطبيقات أخرى، كشف المناطق المطلوب لوصفها وتسجيل. المنطقة تحتوي على محطات محوار من الخلايا من الفائدة يجب أن تكون قابلة للوصول بواسطة إبرة صبغ المغلفة. المنطقة التي تحتوي على قطاعات أكثر القريبة من تلك المحاور نفسه يجب أن يكون مساحة كافية فوق الأنسجة لاستيعاب العمل عن بعد للعدسة الغمر بالمياه (2 ملم في حالتنا).
- تطبيق حل 0.4٪ من الليدوكائين إلى سطح مكشوف الرأس باستخدام Q-تلميح.
- باستخدام شفرة مشرط، وقطع محيط قطعة مستطيلة من الجلد. إزالة المستطيل باستخدام زوج من الملقط. فإن حجم المستطيل النطاق مع حجم الأسماك، ولكن يجب أن تكون تقريبا 3 مم × 5 مم لسم سمك 6.2 (الشكل 2A). يجب على الحافة الجانبية للمستطيل تتلاءم مع المركز للعين، وينبغي أن الحافة الأمامية من المستطيل تكون الخلفية فقط للعين، والحافة الإنسية من المستطيل ينبغي أن يكون مجرد الجانبي من خط الوسط للأسماك.
- توسيع المنطقة الجمجمة يتعرض anteromedially لفضح 2.5 ملم إضافية منطقة غير متداخلة مربع (الشكل 2B).
- مسح تماما ويجف السطح المعرض من الجمجمة باستخدام شفرة مشرط لكشط بعيدا أي نوع من الأنسجة وKimwipes الزائدة ودفع الهواء لتجفيف سطح (الشكل 2C).
- الغراء وظيفة المعدنية إلى المنطقة أمامي إنسي الجمجمة يتعرض باستخدام الغراء عظمى. الانتظار حتى يجف الغراء تماما (الشكل 2D). إزالة مستطيل من الجمجمة، ما يقرب من 2 مم X 4 مم لسم السمك 6.2. استخدام حفر الأسنان مع ~ 0.5 مم الكرة مطحنة كربيد تلميح لرقيقة محيط المستطيل. ثم، وذلك باستخدام مشرط وملقط، وقطع محيط المستطيل وقشر بعيدا لفضح الدماغ الكامنة. الحفر أو القطع مع مقص صغير إضافية قد تكون ضرورية للكشف تماما EL (2E الشكل). إذا كان النزيف يحدث في العضلات، ويمكن استخدام وحدة كهربي.
- قطع بعيدا كل من الأم الجافية (الصباغية) والأم الحنون (واضح) باستخدام مقص الربيع أو إبرة وإزالة الأجزاء قطع مع زوج من الملقط. الأجزاء الأمامية والخلفية من نواة exterolateral (EL) باتت الآن واضحة، وELP العلا، على التوالي (الشكل 3A).
4. وصفها الوراء من المحاور الهامة
- ضع تتلاعب مع إبرة صبغ المغلفة (صنع في الخطوة 1) فوق المنطقة المستهدفة التي تحتوي على محاور عصبية من ينتيريسر، في حالتنا ELP.
- إدراج الإبرة بسرعة ما يقرب من 25 ميكرومتر في الأنسجة. انتظر 15-30 ثانية، حتى لقد حان كل الصبغة حالا، ومن ثم سحب الإبرة.
- كرر مع الإبر الطازجة إضافية حسب الحاجة، ووضع كل واحد في مكان مختلف بحيث يتم توزيع الصبغة في جميع أنحاء المنطقة المستهدفة. استخدمنا 3-5 الإبر في التحضير.
- شطف الصبغة الزائدة من تجويف مع حل المسابقة هيكمان و.
- انتظرت على الأقل 2 ساعة لامتصاص الصبغة والنقل.
5. التصور من المحاور الهامة
- وضع غرفة تسجيل، جنبا إلى جنب مع الأسماك، تحت هدف تستقيم، المجهر epifluorescent مرحلة ثابتة. كما جسد السمكة occludes اختراق الضوء، يجب على كل من الأبيض والفلورية مصادر الضوء يأتي من فوق. وضع دقيق من الألياف البصرية مصدر الضوء فوق تجويف الجمجمة يسمح الصور brightfield مرضية. لمشاهدة epifluorescence، مرشح مضانيجب أن تطابق المواصفات امتصاص / الانبعاثات الطيف للصباغة.
- التبديل التنفس لخزان المياه العذبة والمحافظة على معدل تدفق نفسه. وضع سلك الأرض في تجويف الدماغ المكشوفة والاتصال الأرضي من headstage تسجيل (انظر 6.3).
- وضع زوج من أقطاب تسجيل بجانب قاعدة الذيل والاتصال مكبر للصوت التفاضلية وجهاز تسجيل (على سبيل المثال رصد الصوت، الذبذبات، أو الكمبيوتر) لمراقبة الجهاز أمر التفريغ الكهربائي (EODC). بعد تعافي الأسماك من التخدير، وEODC يمكن استخدامها كمؤشر لحالة السمكة.
- إعداد رسم تخطيطي مصغرة من منطقة في الدماغ الاطلاع على تضخم منخفض. وتشمل الأوعية الدموية الرئيسية والمعالم (قد تختلف من الأسماك إلى الأسماك) لتحديد الموقع الدقيق لمحاور المسمى مرئية فقط تحت التكبير عالية (الشكل 3D).
- تأكد من وضع الصبغة. أول عرض الأنسجة كامل مع brightfield الإضاءة في التوجه (
- استخدام السفن والمعالم لتحديد العلا تحت التكبير عالية. تضيء مع ضوء الفلورسنت أثناء البحث عن محوار المسمى بالقرب من السطح. (الشكل 4).
6. سجل النشاط خارج الخلية
- سحب أقطاب تسجيل الشفط باستخدام 1 مم OD، 0.58 ملم معرف الزجاج الشعرية البورسليكات مع خيوط. سوف المثالي حجم غيض تعتمد على القطر من المحاور المستهدفة، والتي في حالتنا هو 0.1-0.2 ميكرومتر 17. لطلبنا، كانت أقطار طرف القطب 1.5 ± 0.4 ميكرومتر (المدى: 1،0-2،4 ميكرون) مع 5 مم طويل، عرقوب الضيقة من أجل الاقتراب المحاور صفت دون تحريك الأنسجة المحيطة المزدحمة بالسكان.
- ملء الإلكتروناتtrodes مع تصفيتها حل المسابقة هيكمان و. نهائي المقاومة غيض هو 45.2 ± 38.0 MΩ (المدى: 16-155 MΩ).
- وضع قطب كهربائي في حامل قطب كهربائي مع منفذ الضغط وتوصيله إلى مكبر للصوت headstage شنت على مناور. تشغيل خط الضغط من ميناء الضغط لإنهاء T-تقاطع في مقياس ضغط الدم وحقنة لرصد ومراقبة ضغط، على التوالي.
- ربط headstage إلى مكبر للصوت وجهاز اكتساب التناظرية إلى الرقمية.
- مع 30 م بار ضغط نحو الخارج في خط كهربائي، وضع قطب كهربائي بجانب محوار المسمى. ويتم استخدام كاميرا مستوى الإضاءة المنخفضة ربطه مع برامج التصوير لتصور ماصة التنسيب. تبدأ بالقرب من سطح الأنسجة وتقدم القطب نحو محور عصبي. وأنت تقترب من محور عصبي، ينبغي للضغط نحو الخارج تسبب حركة طفيفة، ولكن الملاحظ من محور عصبي.
- في حين أن القطب بجانب محور عصبي، (الشكل 4A، العلوي) تسجيل قويةالاتحاد العالمي للتعليم في القطب حين تقديم المحفزات الاختبار (في حالتنا، كنا 100 ميللي ثانية حيد الطور نبضات عرضية الإيجابية والسلبية في شدة من 20 بالسيارات / سم؛ الشكل 1A). لا ينبغي أن تراعى إمكانات العمل، على الرغم من أن قطعة أثرية الكهربائية يؤكد تسجيل صحيح / التحفيز (الشكل 4A، أسفل).
- الافراج عن الضغط الخارجي في القطب وتكرار التحفيز / تسجيل. مع ذلك ينبغي ألا احظ إمكانات العمل (الشكل 4B).
- تطبيق طفيفة (125 ± 25 م بار) شفط إلى القطب والتحفيز / تسجيل تكرار. وينبغي الآن أن يلاحظ إمكانات العمل ردا على التحفيز (الشكل 4C). قد يحدث أيضا النشاط العفوي. اذا لم يتم الالتزام إمكانات العمل، والإفراج عن الشفط، مسح القطب مع ضغط طفيف، تحرك القطب قليلا، وشفط محاولة مرة أخرى. مرة واحدة إمكانات العمل مرئية، إغلاق خط الضغط.
- تحفيز وتسجيل ماالمطلوب.
7. إنهاء والتخلص
- مرة واحدة كل التسجيلات المطلوبة كاملة، والتحول إلى التنفس مع 100 ملغم / لتر MS-222 حتى توقف EODC. يجب أن يتم الكشف عن أي EODC لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- التخلص من الأسماك وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وبروتوكولات الرعاية الحيوانية المعتمدة.
8. ممثل النتائج
لطلبنا خاصة، ونحن مهتمون في دراسة التحفيز الترميز بواسطة الخلايا العصبية الحسية المركزية. التسجيلات الناجحة من المحاور وصفت تسمح تحليل الردود وحدة واحدة إلى التحفيز الحسي 18. يبين الشكل 5A إمكانات العمل ممثل حركها التحفيز electrosensory عرضية باستخدام أقطاب القطبين تقع على الدواخل من الجدران الأيسر والأيمن من غرفة تسجيل. ويمكن عرض الأوقات سبايك باعتبارها النقطية مؤامرة سنبلة (الشكل 5B). A 25 ميللي ثانية قبل التحفيز تسجيل الرياحيظهر آه انخفاض مستوى النشاط العفوي. هذا العلا خاصة "زنزانة صغيرة" هو طويل تمرير ضبطها لمدة التحفيز في شدة التحفيز من 6 بالسيارات / سم، وزيادة عدد السنابل في التكرار مع زيادة مدة التحفيز (الشكل 5C). يعني أول مسمار كمون هو 4.28 ± 0.16 ميللي ثانية، بما يتفق مع الكمون المتوقعة للخلايا الصغيرة في العلا 11.
الشكل 1. مواصفات لغرفة تسجيل التي يمكن أن تناسب تحت هدف المجهر epiflourescent المرحلة الثابتة. (A) على نطاق وللغرفة تسجيل مربعة مصنوعة من زجاج شبكي يظهر المشاهدات الأعلى، الجانب والظهر. مجموعات الاقتران من تحفيز أقطاب (النجمة) في محيط تسمح إما عرضية (الأحمر والأسود) أو طولية التحفيز (الأزرق والأصفر). قطعة إضافية من زجاج شبكي في الزاوية، مع وجود ثقب مبطنة المطاط في المركز (برتقالي)،حاصل على ماصة شفط التي تحافظ على منسوب المياه ثابت. وظيفتين الفولاذ المقاوم للصدأ العمودي ثمل في الجزء السفلي من الغرفة (الخضراء الصلبة) الاتصال المشاركات الفولاذ المقاوم للصدأ (المخطط الأخضر) تعلق على منصة دعم الأسماك (رمادي فاتح، المفصل في C) عن طريق المشابك قرص قابل للتعديل. ويرد صورة للغرفة تحت الرسم لواسعة. (ب) آراء فردية وتجميعها من التعميم المشابك القرص البلاستيكية المستخدمة لتأمين منصة للمشاركات العمودي. كل المشبك القرص يحتوي على الأخدود (الأخضر) لشغل وظيفة وثقب مركز لتشديد المسمار. المشابك أسطوانة استدارة حتى الأخاديد هي متعامدة مع بعضها البعض. تشديد المسمار (الحمراء) المشابك الوظائف في المكان لمنع المزيد من عمودي والحركة الدورانية للمنصة. (C) وجهات النظر الأمامية والجانبية لواسعة من منصة شبكي يستخدم للاحتفاظ الأسماك في المكان. وهي مغلفة منصة بطبقة من شمع البارافين (الازرق) الذي يحمل dowe خشبيةLS (أشرطة سوداء) في مكان لدعم الأسماك. أنابيب لrespirating الأسماك يمر عبر ثقب في 'اللوح الأمامي "من منصة وينتهي في طرف ماصة توضع في فم السمكة. وظيفة رئيس الفولاذ المقاوم للصدأ (شريط رمادي) يربط إلى منصة عبر كرة مشتركة مما يسمح للدوران 360 درجة. وثمل المشاركات الأفقي الفولاذ المقاوم للصدأ (الأخضر) إلى طرفي المنصة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. نظرة عامة التخطيطي لعملية جراحية غمط على السطح الظهري للرأس. (A) تقديم أربعة التخفيضات، حسب الترتيب المبين، لإزالة قطعة مستطيلة من الجلد (أحمر). (B) توسيع افتتاح anteromedially لإزالة قطعة مستطيلة إضافية من الجلد (الخضراء). (C) كشط أي الدهون المتبقية أو الأربطة من قبلتحريك شفرة مشرط كما يشير إليه السهم ويجف السطح تماما مع Kimwipes والهواء القسري. (D) الغراء آخر الفولاذ المقاوم للصدأ في الجمجمة باستخدام الغراء عظمى. شريط النطاق في ينطبق على م. (E) استخدام حفر الأسنان لتقديم أربعة التخفيضات، حسب الترتيب المبين، لإزالة قطعة مستطيلة من العظام (الأزرق)، وفضح نوى exterolateral الأمامي والخلفي (العلا وELP، على التوالي) . انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل (3). وضع العلامات الفلورية في نواة exterolateral الخلفي بعد 3 ساعات من حقن ديكستران مترافق اليكسا فلور 568. (أ) نوى exterolateral الأمامي والخلفي (العلا وELP، على التوالي) تصور مع إضاءة حقل مشرق من فوق. لاحظأن تكون الميالين مكثفة داخل العلا يعطيها مظهر مشرق نسبيا والتي يميزها عن ELP. (B) تصور نفس المنطقة باستخدام epifluorescence ينظر اليها من خلال مرشح TRITC. (C) A الصورة المدمجة باستخدام اللون الأزرق لA (brightfield) والأحمر للB (TRITC). (D) مثال على الرسم المحجمة من العلا وELP بما في ذلك الأوعية الدموية الرئيسية (الخطوط الحمراء) التي يمكن أن تستخدم المعالم لتحديد الموقع الدقيق لمحاور المسمى مرئية فقط تحت التكبير عالية (الموقع الدقيق للأوعية الدموية يختلف من الأسماك لصيد السمك). خط منقط يشير إلى الحدود بين العلا وELP. (E) المكتسبة عينة الصور باستخدام فلتر TRITC من 5 الاستعدادات المختلفة التي توضح مجموعة من أنماط وضع العلامات الناجحة من المحاور زنزانة صغيرة وSOMAS في العلا.
الشكل 4. واحد وحدة تسجيل خارج الخليةمن محوار المسمى. (A) تسجيل القطب الكهربائي (رأس السهم) تحت ضغط إيجابي وضعت بالقرب من محور عصبي زنزانة صغيرة صفت في العلا (أعلى) السجلات فقط قطعة أثرية حافة (رؤساء السهم) ردا على 100 ميللي ثانية 20 بالسيارات / سم الطور، إيجابية المقابل، نبض مربع عرضية (القاع). (B) التخفيف من الضغط الخارج من القطب (رأس السهم) يتسبب في محور عصبي للتحرك قليلا نحو القطب (أعلى) ولكن لا تزال هناك استجابات لحافز (القاع). ( C) الضغط سلبي طفيف تسحب محوار إلى القطب (أعلى، رأس السهم) وإمكانات العمل في استجابة لظهور التحفيز هي الآن مرئية (أسفل، النجمة). الأجزاء السفلي من اللوحات الثلاث هي ردود مضافين إلى 20 التكرار من التحفيز.
الشكل 5. ممثل النتائج باستخدام هذه التقنية. (A) 5 آثار عينةتظهر إمكانات العمل التي حركها 0.1 ميللي ثانية 6 بالسيارات / سم الطور، إيجابية المقابل، عرضية مربع التحفيز نبض. (B) النقطية مؤامرة تظهر مرات ارتفاع خلال 20 التكرار من 75 ميللي ثانية نافذة تسجيل لنفس وحدة حفزت في الوقت 0 مع 6 بالسيارات / سم المحفزات في نطاق فترات المدرجة على اليمين. (C) المدة ضبط منحنى قياس الاستجابات المعروضة في النقطية كما المسامير في تكرار التحفيز.
| كتلة (ز) | شوكة طول (سم) | عمق الجسم (سم) | |
| متوسط | 2.42 | 6.20 | 1.14 |
| الانحراف المعياري | 0.64 | 0.52 | 0.18 |
| نطاق | 1،2-4،0 | 5،5-8،4 | 0.9-1.6 |
الجدول 1. الأمثلالوزن والطول ويتراوح عمق الجسم للأسماك. الوزن الأمثل، طول الشوكة (غيض من الخطم إلى شوكة من الزعنفة الذيلية)، وعمق الجسم (أقصى مسافة ظهراني بطني في الطائرة عرضية) يتراوح السماح الأسماك لتناسب في غرفة تسجيل هو موضح في الشكل 1. الأسماك التي هي صغيرة جدا قد تكون أقل عرضة للبقاء على قيد الحياة لعملية جراحية وسيكون لها ELP الصغيرة، مما يجعل التنسيب صبغ الصعبة. والأسماك التي هي كبيرة جدا لديها كبيرة، المخيخ خلال المدى من شأنها أن تقلل الوصول إلى العلا وELP، وربما منع خفض من قوة عالية، والهدف الغمر بالمياه قريبة بما فيه الكفاية للتركيز على العلا وELP.
| الموقع تطبيق | صبغ نوع | حاول الأسماك | التسمية في العلا | التسمية في ELP | حاول الوحدات | التسجيلات |
| ELل | فلور اليكسا حقن | 32 | 26 (81.2٪) | 19 (59.4٪) | 50 | 4 (8.0٪) |
| العلا | غارقة اليكسا فلور رقة الترشيح | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| العلا | دي-I في DMSO | 8 | 6 (75.0٪) | 0 | 0 | 0 |
| العلا | دي-O بلورات | 5 | 3 (60.0٪) | 2 (40.0٪) | 9 | 0 |
| ELP | الصلبة اليكسا فلور بلورات | 2 | 0 | 2 (100٪) | 0 | 0 |
| ELP | اليكسا فلور أسلاك التنغستن المغلفة | 43 | | 41 (95.3٪) | 119 | 26 (21.8٪) | |
الجدول 2. معدلات النجاح لكل طريقة حقن الصبغة. نسب النجاح لكل طريقة حقن الصبغة. وتنقسم أساليب استنادا إلى موقع الحقن ونوع الصبغة. لكل طريقة، حاول عدد من الأسماك ويظهر النسبة المئوية من هذه التجارب التي أسفرت عن وضع العلامات الناجحة في العلا وELP. لاحظ أن منطقة تسجيل المستهدف هو الآخر من موقع التطبيق (مربعات الغامق). لموقع الحقن، واعتبر امتصاص الصبغة ناجحة مع وضع العلامات من على حد سواء SOMAS ومحاور عصبية. في المقابل، في موقع التسجيل، احصي الاستعدادات فقط مع محاور وصفت بأنها التجارب الناجحة وضع العلامات. وتبين ايضا العدد الإجمالي للمحاولة وحدة ونسبة هذه الوحدات التي أسفرت عن تسجيلات ناجحة.
| # من حقن سيTES | متوسط الحجم في حقن (ميكرولتر) | مجموعة من وحدات التخزين في حقن (ميكرولتر) | متوسط حجم حقن مجموع (ميكرولتر) | مجموعة من إجمالي حجم الحقن (ميكرولتر) | |
| Microinjector مع هاميلتون | 3 أو 4 | 0.144 | ،091-0،91 | 0.516 | 0،378-0،669 |
| Nanoinjector مع الزجاج ماصة | 2-4 | 0.069 (ثابت) | حجم ثابت حقن 1-6 مرات | 0.621 | 0،414-0،966 |
| Microinjector مع الزجاج ماصة | 2-6 | 0.093 | 0،058-0،202 | 0.360 | 0،252-0،540 |
الجدول 3. كميات من الصبغة بطلب للحصول على كل من الطرق الثلاثة المستخدمة لحقن الإكساء فلور إلى كميات العلا من صبغ بطلب للحصول على كل من الطرق الثلاثة المستخدمة لحقن اليكسا فلور في العلا (الأسلوب الأول من الجدول 2). تم إجراء حقن صبغة في العلا مع كل من nanoinjector وmicroinjector سواء باستخدام مقياس هاميلتون 33 حقنة إبرة أو كوب سحبت ماصة الشعرية. نحن تباينت عدد من مواقع الحقن، وحجم في الحقن والحجم الكلي للحقن الصبغة.
Discussion
يتقن مرة واحدة، وسوف هذه التقنية تسمح لأحد لاستهداف الخلايا العصبية التي تم تحديدها، بما في ذلك محاور فردية، لفي التسجيلات الجسم الحي في كثير من النظم نموذج. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه التقنية واحدة لتسجيل موثوق خرج سنبلة من الخلايا العصبية ذات الخصائص التشريحية الفريدة التي تجعل التقليدية في أساليب تسجيل فيفو تحدي. لقد استخدمت هذه التقنية لتسجيل من العلا "خلايا صغيرة" في mormyrid الأسماك الكهربائية ضعيفة. وكانت المحاولات السابقة لدراسة خصائص ضبط من "خلايا صغيرة" غير ناجحة بسبب الظروف الصعبة تسجيل 11 و 14. الخصائص التشريحية مشابهة خلق الحواجز أمام الحصول على التسجيلات وحدة واحدة من العديد من الفقاريات المختلفة السمعية والخلايا العصبية electrosensory 8-10. للتغلب على هذه التحديات في نظامنا، اتخذنا الاستفادة من حقيقة أن "خلايا صغيرة" هي الخلايا الوحيدة في العلا هذا المشروع إلى ELP. وبالتالي، نقل إلى الوراء من صبغ وضعت في ELP يحد وضع العلامات في العلا ل"الصغيرةيسمح "SOMAS الخليوي ومحاور عصبية. الفلورسنت وصفها من محاور عصبية دقيقة وضع قطب كهربائي بجانب محاور المسمى، مما يجعل التسجيلات وحدة واحدة من الخلايا التي تم تحديدها ممكن رغم SOMAS لا يمكن الوصول إليها. لقد حاولنا تسجيلات الجسدية، ولكن لم تكلل بالنجاح، وربما يرجع ذلك إلى نقاط الاشتباك العصبي تجتاح المحيطة 11 ، 17. ومع ذلك، كان جسدية وضع العلامات واضحة للعيان مما يشير إلى أن هذه التقنية يمكن أن تستخدم لاستهداف تسجيلات الجسدية في أنواع الخلايا الأخرى والدوائر الأخرى. وقد استخدمت الفلورسنت وصفها من الخلايا العصبية من خلال النقل إلى الوراء في الجسم الحي لتوجيه التسجيلات المستهدفة في المختبر 19-21 . تم استخدام تقنية مماثلة لالمستهدفة في الجسم الحي تسجيلات من الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي الزرد 22. عملنا يمثل التوسع رواية من هذا النهج، الذي يتم القيام به على حد سواء وضع العلامات وتسجيل في الجسم الحي داخل الدماغ. يوضح طريقة لدينا أن في الجسم الحي وضع العلامات من المناطق CNS مع تي الوراءويمكن توسيع نطاق متسابق لدراسة الدوائر سليمة أخرى مع الخلايا العصبية الإسقاط الانتقائي بالمثل. على سبيل المثال، في المعالجة السمعية الثدييات، وأكيمة السفلي (IC) بمثابة مركز التتابع مهم للمدخلات من الهياكل rhombencephalic متعددة 23. أن حقن الصبغة في IC تسمية انتقائي الخلايا الإسقاط من كل من هذه النوى. أكيمة متفوقة (SC) يخدم وظيفة مماثلة لرؤية 24. هي مناسبة الاستعدادات الحبل الشوكي بشكل خاص لهذه التقنية، كما يتم الوصول إلى الحبل الشوكي بسهولة، يمكن أن يحدث حقن صبغة بعيدة عن موقع تسجيل، وأنها يمكن أن تكون مجتمعة مع تسجيل داخل الخلايا وملء الخلايا العصبية مختارة للحصول على معلومات أكثر تفصيلا التشريحية 25. وأخيرا، المسالك البحث عن المفقودين هي تقنية راسخة المستخدمة في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي لرسم الدوائر المعقدة 26. ويمكن استخدام طريقة لدينا لإضافة معلومات وظيفية لهذه الدراسات كما تم القيام به ثمؤشرات الكالسيوم الحساسة إيث في القط القشرة البصرية 27.
الجراحة، والتي هي راسخة وموثوقة، وتستخدم بانتظام للمكفوفين في الجسم الحي تسجيلات 16، يجب أن تكتمل مع الحد الأدنى من النزيف وأي ضرر للسطح الدماغ للسماح للحيوان والأنسجة من أجل البقاء. مع الممارسة، ويمكن الانتهاء من تطبيق الجراحة وصبغ في 30-45 دقيقة. نحن صفت بنجاح "زنزانة صغيرة" محاور عصبية في 67٪ من الاستعدادات. معظم التحضيرات لديك فقط 1 أو 2 مرئية محاور المسمى، ولكن بعضها ما يصل الى 8. الوحدات المسمى 119 حاولت، حصلنا على تسجيلات وحدة واحدة من 26 وحدة موزعة على 12 التحضيرات (الجدول 2). وهكذا، تم جمع بيانات من 41٪ من الاستعدادات مع محاور عصبية وصفت لنسبة النجاح الإجمالية 28٪.
على الجانب الحاسم من تطبيق صبغ ووصفها العمق. سوف الإدراج الضحلة من سلك التنغستن يؤدي إلى صبغ يجري غسلها AWAY. ومع ذلك، إذا تغلغل عميق جدا، محاور عصبية المسمى لن يكون لاستهداف مرئية. علاوة على ذلك، بعض الأضرار الميكانيكية إلى الخلية يجب أن يحدث لصبغ الواجب اتخاذها على نحو كاف حتى 25، 28. ومع ذلك، فإن الكثير من الضرر قتل الخلايا. حاولنا وضع العلامات مع الأصباغ وغيرها من الطرق الأخرى (الجدول 2)، بما في ذلك وضع العلامات تقدمي من خلال حقن صبغة في العلا يقترن تسجيل من المحاور صفت في ELP (الجدول 3). نحن نفترض أن وضع العلامات تقدمي لم يكن ناجحا بسبب وضع العلامات اقتصر على الخلايا مع الأضرار الجسدية، مما يجعلها لا تستجيب. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون منزعجة محطات ما قبل متشابك. على النقيض من ذلك، ووضع العلامات الوراء يقلل كلا من هذه المخاوف. كمية ومكان تطبيق صبغ يمكن تعديلها وفقا لدائرة معينة تجري دراستها. يحدث وضع العلامات القصوى مع أكبر تركيز الصبغة، التي حققنا باستخدام أسلاك التنغستن المغلفة. ومع ذلك، لوصفها محاور عصبية مع ديتوقعات EP، صبغ قد تؤتي ثمارها إبرة التنغستن كما هو المتقدم. في هذه الحالات، فإن حقن الضغط سيكون أكثر ملاءمة. امتصاص الصبغة والنقل والسريع، مع محاور المسمى في إعداد وجودنا مرئية في أقرب وقت 2 ساعة بعد الحقن وصفت محاور إضافية تظهر في وقت متأخر من 6 ساعات بعد الحقن. وهكذا، ووضع العلامات والتسجيل يمكن أن تتم في يوم واحد، والقضاء على الصعوبات التقنية المرتبطة جراحة البقاء على قيد الحياة. سوف تختلف توقيت لكل تطبيق اعتمادا على المسافة اللازمة لنقل الصبغة.
جانب آخر بالغ الأهمية هو وضع قطب كهربائي. فمن المهم للدخول إلى إغلاق الأنسجة إلى موقع محوار المسمى لمنع انسداد طرف. لالأنسجة الكثيفة مثل في العلا، لذلك، ساق طويلة رقيقة على القطب تسجيل يقلل من الحركة الزائدة من الأنسجة المحيطة. إذا لم يتم التوصل إلى تسجيل نجاح في المحاولة الأولى، كرر مع أقطاب جديدة حتى يتم الحصول على تسجيل أو TISSتعطل UE إلى النقطة التي محوار لم تعد مرئية. ومع ذلك، فمن المهم أيضا أن تضع بسرعة القطب بجانب محور عصبي لتقليل كمية من التعرض فلوري، الذي يمكن أن يسبب الضيائية والتبييض ويمكن أن تؤثر الخصائص الفيزيولوجية للخلية 29-31.
مرة واحدة يتم شفط قطعة من محور عصبي بنجاح في القطب تسجيل، ويمكن الحصول على تسجيلات لعدة ساعات. إذا فقدت وحدة باستمرار في أقل من 1 ساعة، والنظر في جعل نصائح أصغر الكهربائي لمنع اكسون من الانزلاق خارج. من ناحية أخرى، صغيرة جدا من تلميح قد يؤدي إلى انسداد، وانخفاض إشارة إلى الضوضاء، أو الأضرار التي لحقت محور عصبي. انخفاض مطرد في ارتفاع السعة و 'العودة' وحدة مع شفط إضافية هو إشارة إلى أن الطرف كبير جدا. الكثير شفط قد تسبب ضررا لا يمكن إصلاحه لمحور عصبي. حل واحد هو السماح لتسرب صغير في خط الهواء وبالتالي فإن الضغط يعود ببطء إلى الصفر. التعادل بسرعة الوضغط ه يؤدي إلى عابر نسبي-الخارج 'دفع' والذي قد طرد محور عصبي.
على الرغم من أن هذه التقنية تمثل ميزة كبيرة للحصول على تسجيلات المستهدفة من الخلايا العصبية التي تم تحديدها الإسقاط، فإنه لن يكون من المفيد للتمييز interneurons المحلية، كما ستتخذ صبغ من قبل جميع أنواع الخلايا في موقع الحقن. نظريا، قد يكون استخدام fluorophores متعددة مع مواقع حقن منفصلة تسمح هذه الطريقة لتوسيعها. على سبيل المثال، مقارنة أحادية مزدوجة مقابل وضع العلامات يمكن أن تستخدم لتمييز interneurons من الخلايا العصبية الإسقاط بعد الحقن المزدوج عند نقطتين في الدائرة 32. وبالمثل، يمكن الجمع بين استشفاف الوراء مع غيرها من التقنيات المتقدمة والتصوير، مثل اثنين من الفوتون التصوير، كما حدث مؤخرا في زيبرا فينش عالية مركز الصوتية (HVC) 32. أيضا، مناطق تسجيل تقتصر على تلك القريبة من السطح عند استخدام المجاهر epifluorescence، كما كنا فقط قادرة على حل 1 &مو؛ الهياكل م ضمن 30 ميكرون الأول من الأنسجة. ومع ذلك، يمكن تمديد هذا العمق من خلال استخدام تقنيات الفحص المجهري الأخرى، مثل اثنين من الفوتون المجهري 33 أو الهدف يقترن مستو المجهري إضاءة 34. وعموما، هذا الأسلوب يمثل تقدما هاما في دراسة الدوائر العصبية في الجسم الحي لأنه يمكن استخدامها لتسجيل واحد من الخلايا العصبية في كثير من دوائر مختلفة في مجموعة متنوعة من النظم نموذج - بما في ذلك تلك التي لا يمكن الوصول إليها نسبيا.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
التمويل المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (IOS-1050701 لBAC)، والمعاهد الوطنية للصحة (NS54174 إلى SM وF30DC0111907 إلى AML-W.)، ومؤسسة أوهارا التذكارية والجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (G2205 إلى TK ). نشكر ميكس جوليان لدعمه وتوجيهات حول موضوع التسجيلات محور عصبي خارج الخلية. نشكر كارل هوبكنز لتوفير غرفة تسجيل النموذج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine Methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Gallamine Triethiodide | Sigma-Aldrich | G8134 | Flaxedil |
| Lidocaine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | |
| Hickman’s Ringer Solution | NA | NA | NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l) |
| Peristaltic Pump | Gilson or Rainin | Minipulse 3 Model 312; RP-1 | 10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter |
| Dissection Microscope | Nikon | SM2645 | |
| Super Glue | Super Glue Corporation | SGH2 | 2g tube |
| Omni Drill 35 | World Precision Instruments | 503-598 | |
| Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | 0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) |
| Low Temp Cautery Kit | World Precision Instruments | 500391 | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Dextran Conjugated Alexa Fluor 568 | Invitrogen | D-22912 | 2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings |
| Epifluorescent Microscope | Nikon | E600 FN | A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths |
| Low Power Objective | Nikon | 93182 | CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm |
| High Power Objective | Nikon | 93148 | CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm |
| White Light Source | Dolan-Jenner | Model 190 | Fiber Optic Illuminator |
| Fluorescent Light Source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | |
| Low-light Level Camera | Photometrics | CoolSnap ES | |
| Digital Manometer | Omega Engineering | HHP-201 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV-7B | Axon Instruments |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | Axon Instruments |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Axon Instruments |
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ’0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament |
| Pipette Glass | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) |
References
- Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus. J. Physiol. 566, 425-441 (2005).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).
- Margrie, T. W. Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo. Neuron. 39, 911-918 (2003).
- Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, e6099 (2009).
- Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons. J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).
- Lehman, M. N. Herpes simplex virus as a transneuronal tracer. Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).
- Joris, P. X. A dogged pursuit of coincidence. J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).
- Heiligenberg, W., Rose, G. Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia. J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).
- Morales, E. Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS. Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).
- Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish. J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).
- Hitschfeld, ÉM., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish. ILAR. J. 50, 361-372 (2009).
- Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish. J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).
- Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior. J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).
- Carlson, B. A. Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior. J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).
- Mugnaini, E., Maler, L. Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis. Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).
- Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection. J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).
- Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system. Brain Res. 486, 334-339 (1989).
- Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature. 310, 498-500 (1984).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457, 1133-1136 (2009).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. Dissecting the circuitry of the auditory system. Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).
- Wurtz, R. H., Albano, J. E. Visual-motor function of the primate superior colliculus. Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).
- O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques. Methods. 30, 49-63 (2003).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Gahtan, E., O'Malley, D. M. Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish. J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J. Physiol. 550, 159-167 (2003).
- Mennerick, S. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).
- Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons. J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).
- Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning. Nature. 463, 948-952 (2010).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
