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Biology

मेजबान संयंत्र वाष्पशील के लिए एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में electroantennographic bioassay

Published: May 6, 2012 doi: 10.3791/3931
Automatic Translation
1, 1, 1
1Plant Mycotoxin Research, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service

Summary

वयस्क नाभि orangeworm की electrophysiological प्रतिक्रिया (माप से तेजी से स्क्रीन मेजबान संयंत्र वाष्पशील एक विधि

Protocol

1. के वाष्पशील की तैयारी स्क्रीनिंग ईएजी के लिए किसी अन्य होस्ट संयंत्र से पता लगाया गया

  1. उपयुक्त और जीसी एमएस के माध्यम से सभी वाष्पशील की पहचान प्रमाणीकरण के बाद, प्रत्येक उपलब्ध अस्थिर की ईएजी कश विश्लेषण करते हैं. प्रारंभिक जांच स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रियाओं का एक कम दोहराने प्रत्येक सेक्स के लिए (एन = 3-5) संख्या के क्रम में समय की एक छोटी राशि (1 टेबल) में रिश्तेदार chemoreceptivity की एक संकेत प्राप्त करने के कर सकते हैं.
  2. एक 5 पैंटेन में मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता में एक अस्थिर के समाधान तैयार. कस सील और तत्काल उपयोग के लिए तैयार (जैसे, acetophenone, घनत्व = 1.03 ग्राम / एमएल, मात्रा = (.005 छ g/1.03 / एमएल) × एक हज़ार = 1.0 एमएल बड़ा फ्लास्क में 4.85 acetophenone की μL और पतला तक नमूना सर्द 1.0 एमएल पैंटेन साथ).
  3. ईएजी विश्लेषण करने से पहले परीक्षण किया जा वाष्पशील 5 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता युक्त शीशियों को हटाने और कमरे के तापमान पर गर्म होने की अनुमति देते हैं. इस बीच, के पाश्चर pipettes की उचित संख्या लेबलप्रत्येक के लिए परीक्षण किया जा अस्थिर के साथ सहसंबंधी, और विंदुक की नोक पर parafilm का एक छोटा सा टुकड़ा (ca. 15 × 15 मिमी) लपेटो. प्रारंभिक जांच 10 उत्तेजना pipettes के लिए (एन = 4 प्रत्येक पुरुष और महिला) के लिए एक बुरा प्रस्तुत करने या अन्य अप्रत्याशित बाधा की घटना में लोड कर रहे हैं.
  4. चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग, धीरे bioassay डिस्क आधे में गुना करने के लिए पिपेट में प्लेसमेंट की सुविधा है, तो आंशिक रूप से विंदुक के बड़े अंत में इतना है कि कैरियर के जोड़ डिस्क जगह. डिस्क के 2-3 मिमी उजागर कर रहे हैं. एक रैक धारक में लेबल और तैयार pipettes संरेखित करें.
  5. एक pipettor या सिरिंज का उपयोग कर, प्रत्येक डिस्क पर अस्थिर समाधान की 10 μL (50 μg) लोड और 2 मिनट के लिए अनुमति देने के लिए पूरी तरह के विंदुक में डिस्क डालने से पहले पारित. एक बार भरा हुआ, तुरंत parafilm (ca. 15 × 30 मिमी) के साथ विंदुक के अंत सील. अस्थिर प्रोत्साहन की राशि भरी हुई है और फूला हुआ सबसे अधिक संभावना कीड़े प्रजातियों के साथ अलग अलग होंगे.
  6. एक ही प्रोटोकॉल के बाद ऊपर नोट किया है पर नियंत्रण तैयारप्रत्येक विश्लेषण में शामिल हैं. नकारात्मक प्रत्येक डिस्क पर नियंत्रण लोड 10 बस पैंटेन के की μL के लिए, 2 मिनट प्रतीक्षा, लेबल पिपेट में लोड, और सील. नियंत्रण के लिए सकारात्मक है, डिस्क पर 10 μL (50 μg) लोड, 2 मिनट प्रतीक्षा, विंदुक में लेबल लोड, और parafilm साथ सील.
  7. कीट स्पर्शतंतु संबंधी प्रस्तुत करने की व्यवहार्यता की संभावना सबसे अधिक प्रजातियों के साथ अलग अलग होगा, लेकिन हमने पाया है कि Amyelois transitella एंटीना आमतौर पर छांटना के बाद 30 मिनट वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए सक्रिय और लगातार रहने. समय की यह राशि आम तौर पर 4-10 अस्थिर करने के लिए मूल्यांकन किया जाना नमूनों के लिए अनुमति देगा. तालिका 2 बार और दृश्यों का एक उदाहरण प्रदान करता है.

2. कीट एंटीना की bioassay ईएजी के लिए तैयार

  1. इस प्रयोग का ध्यान विश्लेषण ईएजी है, इस प्रकार, इस धारणा है कि प्रत्येक अन्वेषक उचित पाला कीड़ों के लिए उपयोग होगा.
  2. इस प्रयोग के लिए हम 3-4 दिन का अध्ययन किया जाएगा राजभाषाघ, mated करने पुरुष और महिला पतिंगे. व्यक्तिगत पतिंगे, lidded, प्लास्टिक कंटेनर के विश्लेषण के दिन में स्थानांतरित कर रहे हैं. तुरंत bioassay से पहले परीक्षण किया जा कीट सिर पहले एक होल्डिंग (यानी, विभिन्न प्लास्टिक pipettor युक्तियों से बनाया) उपकरण और पीछे से सुरक्षित में स्थानांतरित कर रहा है. कीट के हेरफेर के एक कम शक्ति - छांटना की सुविधा स्टीरियो खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है.
  3. एंटीना के तार इत्तला दे दी एक उपकरण का उपयोग कर बाहर छेड़ा जाता है. इलेक्ट्रोड जेल की एक छोटी सी फिल्म के साथ कांटा धारक, एंटीना के त्वरित हस्तांतरण के लिए करीब निकटता में रखा गया है. पहले ऐन्टेना सूक्ष्म कैंची का उपयोग excised है और कांटा पर रखा, एंटीना के आधार पर सुनिश्चित करने के गैर - लाल कांटा (उदासीन जमीन इलेक्ट्रोड) भाग पर रखा गया है. 10 मिनट के लिए एक टाइमर सेट शुरू कर दिया है और दूसरे एंटीना पर excised है और रखा कांटा का एक ही पक्ष पर दोनों अड्डों के साथ पहली ऐन्टेना करने के लिए अगले.
  4. वैकल्पिक रूप से, एंटीना holdin भीतर सुरक्षित छोड़ सकता हैजी ट्यूब, excised, तो धीरे ट्यूब और अंत पर जेल की एक थपका के साथ एक तार इत्तला दे दी उपकरण का उपयोग कीट के बीच से निकाल दिया.
  5. एंटीना आधार और टिप इलेक्ट्रोड जेल में डूब रहे हैं करने के लिए सुनिश्चित करें की जाँच कर रहे हैं और नहीं बुलबुले जेल में मौजूद हैं. समाप्त होता है / सुझावों के लिए इलेक्ट्रोड जेल में पूर्ण जोखिम की गारंटी करने के लिए छंटनी की जा सकती है. देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ऐन्टेना के शेष जेल कवर नहीं है, इस प्रकार अधिकतम antennal सतह क्षेत्र गारंटी है कश से संपर्क करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  6. तैयार कांटा तो पूर्व प्रवर्धक जांच में डाला जाता है और 10 मिनट का शेष समय प्रतीक्षा अवधि के लिए 200 एमएल / मिनट में humidified हवा के एक निरंतर प्रवाह के अंतर्गत रखा है. उत्पाद समय और दीक्षा बार ईएजी (तालिका 2) नोट कर रहे हैं और 30 प्रथम प्रोत्साहन कश से पहले सेकंड, सकारात्मक नियंत्रण वाले विंदुक और unsealed धारक में रखा है जो हवा / कश प्रवाह से 2-3 मिमी निर्देशित करने के लिए निकाला जाता है एंटीना तैयार.
  7. प्रत्येक अनुभव के बादiment, एक सूखी बर्फ वातावरण में परीक्षण पतिंगे euthanized हैं और ठीक से निपटाया.
  8. महिला पतिंगे संभोग स्थिति की जाँच करने के लिए विच्छेदित कर रहे हैं. Cohabitating पुरुषों के लिए mated है ग्रहण कर रहे हैं.

3. व्यक्तिगत घटकों के लिए प्रोटोकॉल ईएजी

  1. Antennal प्रतिक्रियाओं AutoSpike Syntech ईएजी साधन के साथ शामिल सॉफ्टवेयर के माध्यम से दर्ज कर रहे हैं. ईएजी जांच के साथ चैनल के लिए AutoSpike गुण टैब में विन्यास 106.7 के एक नमूना दर, सं सुधारने के लिए, और 0-42 हर्ट्ज की एक फिल्टर में सेट कर दिया जाता है. फिल्टर टैब के लिए, ईएजी फिल्टर पर है और cutoff कम 0.1 हर्ट्ज के लिए सेट कर दिया जाता है.
  2. प्रोत्साहन कश अवधि में 1-2 सेकंड हैं. 1 मिनट के लिए सेट घड़ी हर कश के बाद शुरू होता है.
  3. अगले परीक्षण अस्थिर विंदुक unsealed और धारक में रखा. परीक्षण वाष्पशील, यादृच्छिक के बीच के अनुक्रम कोई परीक्षण यौगिकों लगातार एक और परीक्षण अस्थिर का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें चलाता है, तो पीछा किया है (उदाहरण के लिए, तालिका 2) ध्यान allowiएनजी कश के बीच 1 मिनट.
  4. ईएजी प्रतिक्रियाओं को पढ़ने में आसानी की सुविधा के लिए, शासकों के कुछ भागों कंप्यूटर स्क्रीन पर रखा जाता है और नीचे विक्षेपन संकेत के शीर्ष करने के लिए आधारभूत स्तर मिमी में मापा जाता है और एक डाटा शीट (यानी, 5 एम वी स्थापित करने के लिए, 33 मिमी पर लॉग इन = 2.5 एम वी). सॉफ्टवेयर के भविष्य के विश्लेषण के लिए बचाया रिकॉर्डिंग के प्लेबैक की क्षमता है. मिमी की या तो mV या μV के आयाम करने के लिए रूपांतरण बाद में डेटा विश्लेषण में किया जाता है.
  5. अंतिम सकारात्मक नियंत्रण कश के बाद प्रशासित किया जाता है (उदाहरण के लिए, रिकॉर्ड # 12), एंटीना हटा कर रहे हैं, कांटा एक इथेनॉल संतृप्त पोंछे से साफ किया जाता है और बाद में उपयोग करने से पहले सूखे की अनुमति दी.
  6. Assays के throughput बढ़ाने के लिए, एंटीना के अगले सेट के छांटना वर्तमान प्रयोग के अंत से पहले लगभग 10 मिनट एक दूसरे प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा शुरू किया जा सकता है चौथे कश के बाद, दूसरे टेस्ट के मौजूदा प्रयोग की अस्थिर टेबल प्रति के रूप में, 2. इस के लिए अनुमति देगाआर सीधे वर्तमान प्रयोग समाप्त होने के बाद अगले प्रयोग की शुरुआत.
  7. अनुकरण की उच्च संख्या अलग एंटीना पर ब्याज की यौगिकों पर आगे सांख्यिकीय मान्यता प्रदान किया जा सकता है.

4. मिश्रणों या अन्य मत्रिसस की ईएजी विश्लेषण का एक उदाहरण (तालिका 3)

  1. अगला, अनुपात और दो ​​तृतीयक मिश्रणों (3 घटक मिश्रण) के लिए संस्करणों के जानने वाष्पशील उच्च ईएजी प्रतिक्रियाओं (तालिका 4) के संयोजन का एक उदाहरण प्रदान करने के लिए गणना कर रहे हैं. 2 - undecanone: 2 - phenylethanol और फिर एक दूसरे मिश्रण 01:02:04 के अनुपात की तुलना गणना कुछ बुनियादी अनुपात, 01:01:01 α-humulene की दाढ़ अनुपात के लिए कर रहे हैं.
  2. इसी तरह प्रोटोकॉल का उपयोग वर्णित पहले मिश्रण तैयार कर रहे हैं और पाश्चर pipettes लेबल के साथ आवश्यक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ लोड कर रहे हैं.
  3. अस्थिर नमूने पुरुष और महिला एंटीना भर में में ख़ुदपसंद रहे हैं और प्रतिक्रियाओं को मापा और पर लॉग इन कर रहे हैंएक डाटा शीट (तालिका 3).

5. प्रतिनिधि परिणाम

2 सेकंड कश, 10 सेकंड रिकॉर्डिंग बार, 10 दूसरी खिड़की, और 5 एम वी पैमाने: नाभि orangeworm महिला के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग किया जाता है. एक नकारात्मक विक्षेपन ठेठ प्रतिक्रिया है, अभी तक निरपेक्ष मान (उदाहरण के लिए, -3400 μV विक्षेपन ३४०० μV के रूप में दर्ज की गई है) दर्ज की गई है. सकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रस्तुत करने का एक अपेक्षाकृत कमजोर प्रतिक्रिया खारिज कर दिया है. चित्रा 1 नाभि के orangeworm से सकारात्मक नियंत्रण के लिए एक गरीब प्रतिक्रिया का एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्व प्रदान करता है.

एक गरीब नियंत्रण परिणाम का उदाहरण के लिए, औसत महिला acetophenone स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रिया आमतौर पर क्षमताओं. 2600 μV (चित्रा 2), अगर प्रस्तुत करने का केवल क्षमताओं के एक प्रतिक्रिया दी. 1300 यह μV और त्याग किया जाएगा एंटीना की एक और जोड़ी तैयार. इसी तरह, औसत के लिए पुरुष प्रतिक्रिया (जेड, जेड) -11,13 hexadecadienal typicall थावाई μV 3000, इस प्रकार, किसी भी प्रतिक्रिया कम 1500 से μV आम तौर पर खारिज किया गया था.

प्रत्येक प्रयोग के शुरू और अंत में सकारात्मक नियंत्रण भी एंटीना की हालत के बारे में जानकारी प्रदान करता है. अंगूठे का एक नियम है, हम तेजी से स्क्रीनिंग के लिए का पालन करें अगर बाद नियंत्रण (# 12 रिकॉर्ड, तालिका 2) के कश से स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रिया या तो एक पूर्व नियंत्रण के सेंट कश (# 1 रिकॉर्ड की कम से कम 75% है तालिका 2) या (# 2 रिकॉर्ड, तालिका 2) पूर्व नियंत्रण तो डेटा विश्लेषण में प्रयोग की वजह से प्रस्तुत करने की गिरावट संभव नहीं प्रयोग किया जाता है (चित्रा 3) के 2 एन डी कश से कम अंगूठे का पहला नियम का एक उदाहरण # 1 रिकॉर्ड होगा = 2730 μV और रिकॉर्ड 12 = +१६८० μV को, और अंगूठे के दूसरे नियम अगर इन मामलों में से प्रत्येक में 2 है = २,३५० μV और रिकॉर्ड # 12 = 1680 μV रिकॉर्ड, प्रस्तुत करने का और प्रयोग का परिणाम त्याग किया जाएगा.

एकईएजी प्रतिक्रिया के रूप में सकारात्मक नियंत्रित करने के लिए मापा मूल्यों को सही करने के प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में निम्नानुसार होगा.

# भागो ईएजी (μV) # भागो 2 ईएजी (μV) # 3 भागो ईएजी (μV)
(+) दबाएँ 2800 (+) दबाएँ 2420 (+) दबाएँ 3030
एक Cmpnd 3000 एक Cmpnd 2500 एक Cmpnd 3440
(-) दबाएँ 530 (-) दबाएँ 755 (-) दबाएँ 910
Cmpnd बी 2400 Cmpnd बी 2000 Cmpnd बी 2560
(+) दबाएँ 2770 (+) दबाएँ 2400 (+) सीटीआरएल 3020

एक एन = 3 प्रयोग के लिए ऊपर मूल्यों का प्रयोग, नकारात्मक प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रत्येक मान से प्रत्येक प्रयोग के भीतर धारणा है नकारात्मक नियंत्रण आधारभूत यांत्रिक कश और अवशिष्ट विलायक स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रिया के तहत घटाया जाता है.

# भागो 1 ईएजी (μV) # भागो 2 ईएजी (μV) # 3 भागो ईएजी (μV)
(+) दबाएँ 2270 (+) दबाएँ 1665 (+) दबाएँ 2120
एक Cmpnd 2470 एक Cmpnd 1745 एक Cmpnd 2530
(-) दबाएँ 0 (-) दबाएँ 0 (-) दबाएँ 0
Cmpnd बी 1870 Cmpnd बी 1245 Cmpnd बी 1650
(+) दबाएँ 2240 (+) दबाएँ 1645 (+) दबाएँ 2110

एक प्रयोग के लिए सकारात्मक नियंत्रण और फिर औसत जाएगा सही +१००० μV, अनुपात हज़ार μV के सुधार के लिए टिप्पण. एक डाटा शीट (जैसे, एक्सेल) आसानी से प्रयोग करने योग्य डेटा के लिए प्रतिक्रियाओं परिवर्तित करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है.

# भागो 1 औसत (μV) # भागो 2 औसत (μV) # 3 भागो औसत (μV)
(+) दबाएँ 2255 (+) दबाएँ 1655 (+) दबाएँ 2115
(+) Ctrl .. 1000 (0.443) (+) Ctrl .. 1000 (0.604) (+) Ctrl .. 1000 (0.473)

प्रत्येक प्रयोग भीतर सुधार अनुपात से गुणा, परिसर के लिए मूल्यों को एक और मिश्रित बी तो समायोजित कर रहे हैं.

# भागो 1 Adj. ईएजी (μV) # भागो 2 Adj. ईएजी (μV) # 3 भागो Adj. ईएजी (μV)
एक Cmpnd 1094 एक Cmpnd 1054 एक Cmpnd 1197
Cmpnd बी 828 Cmpnd बी 752 Cmpnd बी 780

प्रत्येक परिसर के लिए औसत (मतलब है) तो अन्य प्रासंगिक सांख्यिकीय परीक्षण यौगिकों के लिए और डेटा ईएजी प्रतिक्रियाओं के साथ साथ निर्धारित कर रहे हैं तो मूल्यांकन किया जा सकता हैआगे की जांच पड़ताल के लिए उम्मीदवारी के लिए.

यौगिक ईएजी (μV) सं रन, एन =
एक 1115 3
बी 787 3

चित्रा 1
चित्रा 1 पुरुष (1 सेंट सकारात्मक नियंत्रण कश) पूर्व नियंत्रण कि एंटीना सुनिश्चित करने के बाद गरीब स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रिया के कारण खारिज कर दिया होगा स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रिया (1,180 μV) के लिए प्रतिनिधि ईएजी जेल के साथ अच्छा संपर्क है. नीचे खिड़कियों में नीले सलाखों अस्थिर की दो दूसरी पफ का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2
> चित्रा 2 महिला के लिए स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रिया (३४०० μV) के लिए प्रतिनिधि ईएजी trong. 1 सेंट कश पूर्व नियंत्रण है कि उचित विचार किया जाएगा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3 के बाद नियंत्रण करने के लिए महिला स्पर्शतंतु संबंधी (1680 μV) प्रतिक्रिया (एक प्रयोग के लिए पिछले सकारात्मक नियंत्रण), कि गरीब पर विचार किया जाएगा और एंटीना गिरावट (<1 सेंट पूर्व नियंत्रण के 75% या विचारोत्तेजक के लिए प्रतिनिधि ईएजी. < पूर्व नियंत्रण के 2 एन डी कश मूल्य). इस उदाहरण के लिए 1 सेंट कश पूर्व नियंत्रण २७३० μV और 2 एन डी पूर्व नियंत्रण में कश 2350 μV थी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

सहायता "dflinebreak> चित्रा 4
चित्रा 4 महिला उम्मीदवार अस्थिर मिश्रण के कश स्पर्शतंतु संबंधी (3800 μV) प्रतिक्रिया और अधिकतम प्रारंभिक (3800 μV) विक्षेपन, कश अवधि के दौरान प्रारंभिक ढलान (के बाद माप के लिए ईएजी प्रतिनिधि एम वी 0.3 = s/1.2 0.25 / एस एम वी), और शेष कश अवधि के लिए ढाल (1.6 s/1.9 एम वी = 0.84 है / एम वी). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5 लघु संशोधित एक नमूना मैट्रिक्स और संबद्ध वाष्पशील युक्त पोत ए के पार जा ख़ुदपसंद transitella एंटीना.

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1 बेमसल (2007) बादाम और ईएजी प्रतिक्रियाओं Autospike कार्यक्रम में एक अलग और कम संवेदनशील विन्यास के द्वारा निर्धारित की स्वस्थानी अस्थिर उत्सर्जन में टेबल.

तालिका 2
तालिका 2 व्यक्ति अस्थिर उपकरणों के लिए पुरुष और महिला स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग के लिए एक फार्म का उदाहरण है.

तालिका 3
तालिका 3 अस्थिर मिश्रणों और / या गुलदस्ते के लिए पुरुष और महिला स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग के लिए एक फार्म का उदाहरण है.

तालिका 4
4 टेबल एक 5 मिलीग्राम / मिश्रणों की दो अलग अलग अनुपात के लिए एमएल समाधान की 10 एमएल की तैयारी के उदाहरण हैं.

सारणी 5
5 टेबल पुरुष और महिला एंटीना भर एक अस्थिर घटकों के लगातार दो कश की रिकॉर्डिंग के लिए फार्म का उदाहरण है.

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Discussion

Bioassay लक्ष्य कीट chemoreception प्रतिक्रियाओं निर्धारित रूप में electroantennogram रिकॉर्डिंग के प्रयोग काफी आम है और कई गैस वर्णलेख (जीसी EAD) से प्रवाह के लिए एक डिटेक्टर के रूप में ईएजी का उपयोग अध्ययन साहित्य में पाया जा सकता है 9,10 विधि है. का प्रदर्शन सापेक्ष जवाबदेही का विश्वास काम के लिए उच्च अनुकरण साथ अस्थिर घटकों के बराबर मात्रा में एक तेजी से स्क्रीनिंग प्रदान करेगा. Syntech सॉफ्टवेयर में AutoSpike कार्यक्रम के स्क्रीनिंग वाष्पशील के लिए एक अच्छा कार्यक्रम है, क्योंकि यह अधिकतम विक्षेपन आयाम एंटीना से संकेत (1-3 आंकड़े), जो हम "स्क्रीनिंग" मूल्य के रूप में यहां उपस्थित प्रदान करने में सक्षम है. इसके अतिरिक्त, अर्द्ध उन्नत उपयोग के लिए अन्य बुनियादी जानकारी (चित्रा 4 देखें) AutoSpike विन्यास सेटिंग्स और क्या शोधकर्ता स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रिया से प्राप्त करना चाहता है पर निर्भर करता है के साथ प्राप्त किया जा सकता है. GcEAD या EagPro Syntech कार्यक्रम अनुप्रयोगअधिक उन्नत प्रयोगों के लिए या electrophysiological प्रतिक्रियाओं के साथ परिचित वैज्ञानिकों के लिए ropriate के बाद परिणामी निशान स्पर्शतंतु संबंधी विध्रुवण प्रतिक्रिया का समय पाठ्यक्रम का अधिक से अधिक विस्तार प्रदान करते हैं.

एक मेजबान संयंत्र से पता चला यौगिकों की जांच प्रक्रिया से पहले, वाष्पशील की उचित पहचान महत्वपूर्ण है और सख्त प्रोटोकॉल का पालन करना चाहिए. यदि संभव हो तो, दो polarity (यानी, DB वैक्स और DB-1) भिन्न जीसी कॉलम प्रतिधारण सूचकांक (आरआईएस, 1 टेबल देखें) के मिलान के माध्यम से प्रारंभिक घटक पहचान के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. सबसे अच्छा तरीका एक दो कॉलम पर मानक को प्रमाणित के साथ एक अस्थिर की पहचान सत्यापित करने के लिए है 11. यदि यौगिकों के कुछ की पहचान संभव नहीं है, उनके bioactivity की व्याख्या अभी भी जीसी EAD उपयोग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है 12 हालांकि. bioassay की प्रतिकृति अस्थिर संग्रह विधि के आधार पर सीमित किया जा सकता है, analyte की राशि वजह नहीं होगाdily एक आंतरिक मानक के बिना उपलब्ध है, यौगिक पहचान तुरंत जाना जाता है नहीं हो सकता है, और मिश्रणों में बाद में परीक्षण संभव नहीं होगा.

अगर ठीक से सील और प्रशीतित पैंटेन में वाष्पशील के समाधान आमतौर पर के बारे में 1 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है. अगर सील लोड डिस्क युक्त pipets एक ज़िप ताला बैग में रखा जाता है और प्रशीतित वे के बारे में 24 घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है. हालांकि, हम यह सबसे अच्छा पाया डिस्क ईएजी विश्लेषण की सुबह लोड और ठीक से दिन के अंत में बचे हुए pipets के निपटान. मानकीकृत कश के लिए dosages प्रत्येक कीट प्रजातियों के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए अगर संबंधित साहित्य आसानी से उपलब्ध नहीं है.

मिश्रणों के निर्माण आम तौर पर एक कठिन प्रक्रिया है. यहाँ दिखाया नहीं व्यापक हालांकि कुछ अपेक्षाकृत सरल दृष्टिकोण हैं. शोधकर्ताओं के लिए विभिन्न तकनीकों के बारे में आगे पढ़ने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है. व्यक्तिगत घटक respons के मूल्यांकन के बादमेजबान संयंत्र वाष्पशील से तों किया गया है, मिश्रणों का अध्ययन किया जा सकता है. एक उदाहरण स्क्रीनिंग से उच्च सापेक्ष प्रतिक्रिया eliciting वाष्पशील उपयोग कर रहा है. अन्य उदाहरण हैं: 13 रिश्तेदार मात्रा में उत्सर्जित द्वारा संयोजन, सापेक्ष प्रतिक्रियाओं रिश्तेदार मात्रा बनाम, यौगिकों के वर्ग द्वारा छँटाई, या फलाद्गमिकी संबंधी चरणों या matrices के विभिन्न राज्यों (क्षतिग्रस्त बनाम undamaged) में अस्थिर मतभेद के अनुपात.

प्रदर्शन मिश्रणों इन विभिन्न दृष्टिकोण के सरल संयोजन कर रहे हैं. 01:01:01 तृतीयक प्रारंभिक जांच में रिश्तेदार उच्च प्रतिक्रियाओं पर आधारित मिश्रण है, लेकिन यह भी यौगिकों के विभिन्न वर्गों का प्रतिनिधित्व करता है. 2 - undecanone, humulene एक sesquiterpene है एक फैटी एसिड टूटने उत्पाद है, और 2 - phenylethanol एक benzenoid है. इन यौगिकों आम तौर पर संयंत्र के उत्सर्जन में देखा वाष्पशील की प्रमुख वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं. दूसरे मिश्रण में 01:02:04 अनुपात डु पता चला वाष्पशील के सापेक्ष अनुपात शामिलजीसी - एमएस विश्लेषण की अंगूठी 4 हालांकि, SPME के और जीसी - एमएस का उपयोग केवल रिश्तेदार अनुपात और यौगिकों के वर्गों के अंशांकन घटता के साथ संयोजन के रूप में जीसी खूंटी विश्लेषण के उपयोग के लिए सिफारिश की है एक और अधिक सटीक अनुपात के लिए प्रारंभ बिंदु प्रदान करते हैं. पता चला वाष्पशील पर आधारित है.

कांटा इलेक्ट्रोड ईएजी तकनीक एक अधिक सरल electrophysiological प्रयोग में नियोजित तरीके से 14 पाठक को इस विधि से परे उन्नत अनुप्रयोगों के लिए आगे साहित्य अनुसंधान करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है. इसके अतिरिक्त, पूर्व स्वस्थानी matrices की स्क्रीनिंग प्रदर्शन विधि का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन छोटे (60 एमएल) संशोधित वाहिकाओं (चित्रा 5) संयंत्र भागों (जैसे, जमीन बादाम) युक्त का उपयोग. जब बड़े कंटेनर (उदाहरण के लिए, ईएजी puffer के साथ प्रयोग के लिए 120 एमएल विशेष एडाप्टर के साथ lidded पोत) का उपयोग कर यह प्रवाह दर को बढ़ाने के लिए कंटेनर की उचित निकासी सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है. एक प्रयोग shoulघ जहां एक सकारात्मक नियंत्रण कंटेनर में रखा जाता है उचित उत्तेजना आवश्यक प्रवाह दर पर हासिल की है करने के लिए सुनिश्चित किया जाना है. एक दो अलग - अलग घटकों के लिए दूसरे कश का उपयोग बिल्कुल आवश्यक और कश 0.5 से 1.0 सेकंड के आदेश पर अधिक विशिष्ट नहीं है. हालांकि, यह आसान इन आम तौर पर उच्च प्रवाह दरों में एक लंबी कश की आवश्यकता के बाद से कंटेनरीकृत अस्थिर गुलदस्ते के कश के साथ भविष्य की तुलना के लिए अनुमति है. हमारे प्रयोगशालाओं दो दूसरी कश का उपयोग करने के छोटे जहाजों में matrices के (चित्रा 5) का उपयोग कर कश के लिए एक घटक है और / या मिश्रण प्रतिक्रियाओं सीधे तुलना. दो इन छोटे जहाजों पर दूसरे कश कंटेनर जब उचित प्रवाह दर सेट कर दिया जाता है की पूरी निकासी सुनिश्चित करता है.

इसके अलावा, एक दूसरे कश के अधिग्रहण, प्रदर्शन किया जा सकता है लेकिन दूसरी कश बिल्कुल volatilized घटक की राशि के बाद से स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक नहीं है अब और नहीं एक सख्त (मानक पर रखा <मजबूत> 5 तालिका). हालांकि, इस जानकारी के बाद किसी भी खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों के लिए मूल्यवान हो सकता है 15 एक बहुत कम प्रतिक्रिया कम सांद्रता कम प्रतिक्रिया से संकेत मिलता है जबकि एक सुसंगत प्रतिक्रिया खुराक एक उच्च प्रतिक्रिया के लिए सीमा के निकट है का संकेत हो सकता है हो सकता है हो सकता है. यह ध्यान दिया जाना दूसरे कश से 14 प्रतिक्रियाओं में बदलाव के लिए अन्य मनोवैज्ञानिक व्याख्या कर रहे हैं, लेकिन जानकारी भविष्य प्रयोगों के लिए मार्गदर्शन में सहायता करता है. यदि उच्च throughput बिल्कुल महत्वपूर्ण नहीं है, प्रत्येक घटक के एक दूसरे कश का उपयोग जानकारीपूर्ण किया जा सकता है.

यदि कुंवारी महिला पतिंगे लक्षित नमूना हैं, अब पिछले instar या pupae में लार्वा और sexed किया जा सकता है 16 अलग अलग कंटेनर में हो महिला उद्भव की अनुमति है.

पैमाने का समायोजन आवश्यक हो सकता है अगर यह वर्तमान पैमाने से अधिक स्पर्शतंतु संबंधी प्रतिक्रिया को समायोजित कर सकते हैं. ईएजी सॉफ्टवेयर स्क्रीन क्षमताओं तराजू परn μV प्रतिक्रिया के प्रति कैसे कई मिमी का निर्धारण करने में सहायता करते हैं. अन्य कीड़ों को अपनी संवेदनशीलता में भिन्न हो सकते हैं.

प्रदर्शन विधि जानने के लिए एक आसान, तेजी से, विश्वसनीय, और उच्च throughput प्रदर्शन के प्रोटोकॉल प्रदान करता है लिए मेजबान संयंत्र वाष्पशील की जटिल संरचना से bioactivity विचार के लिए वाष्पशील की संख्या को कम करने के लिए. नमूना के एंटीना प्रदान उपयुक्त हैं, कांटा ईएजी विधि कई अस्थिर उपकरणों या घटकों के मिश्रणों, और प्रतिक्रियाओं का एक मानक की तुलना के त्वरित आकलन के लिए अनुमति देता है. अंत में, एक bioassay कि घटक या एक क्षेत्र की स्थापना में घटकों के मिश्रण की गतिविधि का आकलन सबसे अधिक मान्य तरीका है. हालांकि, क्षेत्र अध्ययन अक्सर बहुत समय और श्रम लेने, महंगी हैं, और कई महीनों की आवश्यकता के लिए उचित परिणाम प्राप्त.

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Disclosures

लेखक एक मौजूदा सहकारी अनुसंधान और पैरामाउंट खेती कंपनी, Suterra LLC के संबंधों के साथ एक कंपनी के साथ विकास समझौते है.

Acknowledgments

इस अनुसंधान USDA-ARS क्रिस 5325-42000-037-00D परियोजना के तहत और 58 3K95-7-1198 CRADA और TFCA 58-5325-8-419 से परिणाम के साथ आयोजित किया गया. लेखक का उपहार के लिए कृतज्ञता Suterra स्वीकार करते हैं (जेड, जेड) -11,13 - hexadecadienal, बी Higbee उत्पादक विचार - विमर्श के लिए, और तकनीकी सहायता के लिए जे बेकर.

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प्लांट बायोलॉजी 63 अंक bioassay chemoreception electroantennography में electrophysiological प्रतिक्रिया उच्च throughput मेजबान संयंत्र वाष्पशील नाभि orangeworm के स्क्रीनिंग उपकरण
मेजबान संयंत्र वाष्पशील के लिए एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में electroantennographic bioassay
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Beck, J. J., Light, D. M., Gee, W.… More

Beck, J. J., Light, D. M., Gee, W. S. Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles. J. Vis. Exp. (63), e3931, doi:10.3791/3931 (2012).

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