Electroantennographic Biotest som screeningmetod för flyktiga ämnen värdväxt

Summary

En metod för att snabbt växt skärmen värdceller flyktiga ämnen genom mätning av elektrofysiologiska svaret hos vuxna naveln orangeworm (

Abstract

Plantera flyktiga spelar en viktig roll i växt-insekt interaktioner. Växtätande insekter använder växter flyktiga, så kallade kairomoner, att hitta sin värdväxt. ^1,2 när en värdväxt är en viktig agronomisk handelsvara utfodring skada genom skadeinsekter kan orsaka allvarliga ekonomiska förluster för odlarna. Följaktligen kan kairomoner användas som attraherande för att locka eller förvirra dessa insekter och därmed erbjuda ett miljövänligt alternativ till bekämpningsmedel för insektsbekämpning. ³ Tyvärr kan växter avge en stort antal flyktiga med varierande kompositioner och nyckeltal för utsläpp beroende på fenologi av varan eller tiden på dagen. Detta gör identifiering av biologiskt aktiva komponenter eller blandningar av flyktiga komponenter en mödosam process. För att identifiera de bioaktiva komponenterna av flyktiga värd växt utsläpp vi använder laboratoriet-baserade electroantennography screening bioassay (EAG). EAG är ett effektivt verktyg för att utvärdera och RECORd elektrofysiologiskt lukt svaren från en insekt via sina antenn receptorer. Den EAG screening process kan bidra till att minska antalet flyktiga testas för att identifiera lovande bioaktiva komponenter. Men eag bioanalyser endast ger information om aktivering av receptorer. Det ger ingen information om vilken typ av insekt beteende förening framkallar, som kan vara som en attraherande, myggmedel eller annan typ av beteende svar. Flyktiga framkallar en betydande svar genom EAG, i förhållande till en lämplig positiv kontroll, vanligtvis tas vidare till ytterligare tester av beteendemässiga svar på skadeinsekt. Den experimentella designen presenteras kommer närmare den metod som används för att sålla mandel-baserade flyktiga värd växt ^4,5 genom mätning av elektrofysiologiska antenn svaren från en vuxen skadeinsekt naveln orangeworm (Amyelois transitella) till enskilda komponenter och enkla blandningar av komponenter via EAG bioassay. Metoden använder två exvilket utförs antenner placeras tvärs en "fork" elektrodhållare. Protokollet visade Här presenterar en snabb, hög kapacitet standardiserad metod för screening flyktiga ämnen. Varje flyktiga är en uppsättning, konstant mängd för att standardisera stimulans nivå och därmed ge antenn svar vara en indikation på den relativa chemoreceptivity. Den negativa kontrollen hjälper till att eliminera den elektrofysiologiska svar på både kvarvarande lösningsmedel och mekanisk kraft av bloss. Den positiva kontrollen (i detta fall acetofenon) är en enda förening som har framkallat en konsekvent reaktion från manliga och kvinnliga naveln orangeworm (NU) fjäril. En ytterligare semiokemikalie standard som ger konsekvent svar och används för bioanalys studier med den manliga NU mal är (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, en aldehyd-komponenten från den hon-producerade könsferomon. ^6-8

Protocol

1. Beredning av flyktiga ämnen detekteras från värdväxten för EAG Screening

1. Efter lämplig identifiering och autentisering av alla flyktiga via GC-MS, utföra EAG puff analys av varje tillgänglig volatila. Initial screening kan vara ett lågt kopia antal antenn svar (N = 3-5) för varje kön i syfte att uppnå en indikation av relativ chemoreceptivity på kort tid (tabell 1).
2. Framställ en lösning av varje flyktigt vid en 5 mg / ml koncentration i pentan. Tätt täta och kyla provet tills för omedelbar användning (t.ex. acetofenon, densitet = 1,03 g / ml, volym = (0,005 g/1.03 g / ml) × 1000 = 4,85 fil av acetofenon till en 1,0 ml mätkolv och späd till 1,0 ml med pentan).
3. Precis före EAG analys avlägsna flaskorna innehållande 5 mg / ml koncentration av flyktiga, som skall testas och låt värmas till rumstemperatur. Samtidigt märka rätt antal Pasteur pipetter för attmotsvarar varje flyktigt som skall testas, och linda en liten bit parafilm (ca 15 x 15 mm) över toppen av pipetten. För de första screening 10 stimulansåtgärder pipetter (= 4 N för varje manligt och kvinnligt) läggs i händelse av en dålig prep eller andra oförutsedda hinder.
4. Användning av en pincett, försiktigt viker bioanalysen skivan i halv för att underlätta placeringen i pipetten, därefter partiellt placera det vikta skiva i den stora änden av pipetten, så att ca. 2-3 mm av skivan utsätts för. Rikta de märkta och preparerade pipetter i ett rack hållare.
5. Med hjälp av en pipett eller spruta laddar 10 pl (50 ng) av flyktiga lösning på varje skiva och låt 2 minuter gå innan full sätter i en skiva i pipetten. Gång laddats omedelbart täta änden av pipetten med parafilm (ca 15 x 30 mm). Mängden flyktiga stimulans för att laddas och flåsade kommer sannolikt att variera med insekter arter.
6. Efter samma protokoll ovan förbereder kontrollerinnefattar i varje analys. För den negativa kontrollen belastning 10 pl bara pentan på varje skiva, vänta 2 minuter, ladda in den märkta pipett och tätning. För den positiva kontrollen, ladda 10 pl (50 pg) på skivan, vänta i 2 minuter, belastning till den märkta pipetten, och tätning med parafilm.
7. Den livskraft insekten antenn prep med största sannolikhet kommer att variera med arter, men vi har funnit att Amyelois transitella antennerna oftast vara aktiv och konsekvent under> 30 minuter efter excision med den beskrivna protokollet. Denna tid kommer i allmänhet att upp till 4-10 flyktiga prover som ska utvärderas. Tabell 2 ger ett exempel på tider och sekvenser.

2. Beredning av Insect antenner för EAG Bioassay

1. Fokus i detta experiment är EAG analys, alltså antagandet att varje utredare ska ha tillgång till lämpligt fötts insekter.
2. För detta experiment kommer vi att studera 3-4 dagars old, parade manliga och kvinnliga nattfjärilar. Individuella nattfjärilar överförs till en liten, lock, plastbehållare dagen för analysen. Omedelbart före bioanalysen är mal, som skall testas överföres huvudet först in en hållande anordning (dvs tillverkade av olika plastmaterial pipett spetsar) och säkrad bakifrån. Manipulering av insekten kan betraktas under ett lågeffekt-stereomikroskop för att underlätta ingrepp.
3. Antenner är benas ut med hjälp av en wire-spets verktyg. Gaffeln hållaren, med en liten film av elektrodgelen, placeras i omedelbar närhet för snabb överföring av antenner. Den första antennen skärs med användning av mikro sax och placerades på gaffeln, vilket säkerställer basen hos antennen är placerad på den icke-röda delen av gaffeln (den indifferenta jordelektroden). En timer uppsättning i 10 minuter startas och den andra antennen skärs ut och placeras intill den första antennen med båda baserna på samma sida av gaffeln.
4. Alternativt kan antennerna lämnas fäst i holding tub, skars sedan försiktigt bort från mellan röret och insekten hjälp av en tråd-spetsigt verktyg med en klick-gel på änden.
5. Antennerna kontrolleras för att säkerställa basen och spetsen är nedsänkta i elektrodgelen och inga bubblor är närvarande i gelén. Ändarna / tips kan trimmas för att garantera fullständig exponering för elektrodgelen. Försiktighet bör användas för att säkerställa att resten av varje antenn som inte är täckt med gel, vilket garanterar maximal antenn yta utsätts för puff.
6. Den prepped gaffeln sedan in sonden förförstärkaren och hålls under en konstant ström av fuktad luft vid 200 ml / min för den återstående tiden av 10 minuter väntetid. Punktskatteområdet tid och EAG initierings gånger ses (Tabell 2) och 30 sekunder före den första stimulus blosset, dras pipetten innehållande den positiva kontrollen oförseglad och placeras i hållaren, som är anpassad för att rikta luft / bloss flöde 2-3 mm från i prepped antenner.
7. Efter varje kompeiment är test-mal avlivades i ett torris miljö och kasseras.
8. Hona dissekeras för att se parning status. Sammanboende män antas ha parat.

3. EAG Protokoll för individuella komponenter

1. Antenn svar registreras via AutoSpike programvaran som medföljer Syntech EAG instrumentet. Konfigurationen i AutoSpike fliken Egenskaper för kanalen med EAG proben är inställd på en samplingsfrekvens på 106,7, NO att rätta, och ett filter av 0-42 Hz. För fliken Filter är EAG filter och låg cutoff är inställd på 0,1 Hz.
2. Stimulans puffar är 1-2 sekunder i längd. En timer på 1 minut startas efter varje bloss.
3. Nästa test flyktiga pipetten oförseglad och placeras i hållaren. Sekvensen av test flyktiga ämnen, randomiserade mellan körningarna för att se några testföreningar konsekvent följa ett annat test flyktiga, som sedan följs (t.ex. tabell 2) försiktigt allowing 1 minut mellan blossen.
4. För att underlätta enkel att läsa eag svar, är delar av härskare som släpps ut på datorskärmen och baslinjen nivå till toppen av den nedåtgående deformationen signalen mäts i mm och inloggad på ett datablad (dvs. för 5 mV inställningen, 33 mm = 2,5 mV). Programvaran har förmågan att uppspelning av sparade inspelningarna för framtida analys. Omvandling av mm till antingen mV eller μV amplitud utförs i senare analys av data.
5. Efter den sista positiva kontrollen puff (t.ex. Spela in # 12) administreras, antennerna tas bort, är gaffeln rengörs med en etanol-mättad torka och får torka före efterföljande användning.
6. För att öka genomströmningen av analyser, kan excision av nästa uppsättning av antenner sättas igång genom att en andra laboratoriepersonal ca 10 minuter före slutet av innevarande experiment - efter det fjärde blosset, det andra testet flyktiga av den aktuella experimentet enligt tabell 2. Detta kommer att tillåta for starten av nästa experiment direkt efter de aktuella experimentet avslutas.
7. Högre antal upprepningar (på olika antenner) kan utföras på föreningar av intresse att tillhandahålla ytterligare statistisk validering.

4. Ett exempel på EAG Analys av blandningar eller andra matriser (tabell 3)

1. Därefter är de nyckeltal och volymer för två tertiära blandningar (3-komponent blandningar) beräknas ge ett exempel på att kombinera flyktiga framkallar höga eag svar (tabell 4). Beräkningarna är för vissa basiska förhållanden, en 1:1:1 molar förhållande av α-humulene: 2-undekanon: 2-fenyletanol och sedan jämföra att en andra blandning förhållande av 01:02:04.
2. Med användning av liknande protokoll som beskrivits tidigare är de blandningar framställdes och märktes Pasteur-pipetter laddas tillsammans med de nödvändiga positiva och negativa kontroller.
3. De flyktiga Proverna uppblåsta över manligt och kvinnligt antenner och svaren mäts och inloggadatt en datablad (tabell 3).

5. Representativa resultat

För kvinnliga naveln orangeworm följande inställningar används: 2 andra puffar, 10 andra inspelningstider, 10 andra delen, och 5 mV skala. En negativ utböjning är den typiska svar, men det absoluta värdet registreras (t.ex. -3.400 μV böjningen redovisas som 3.400 μV). En relativt svag respons prep till den positiva kontrollen förkastas. Figur 1 ger en grafisk representation av ett dåligt svar på den positiva kontroll naveln orangeworm.

Exempelvis av en dålig kontroll resultat, är den genomsnittliga kvinnliga antenn som svar på acetofenon typiskt ca. 2600 μV (figur 2), om prep endast gav ett svar på ca. 1300 μV skulle kasseras och ett annat par av antenner prepped. Likaledes är det genomsnittliga bästa svaret (Z, Z) var -11,13-hexadecadienal typically 3.000 μV, alltså mindre något svar än 1.500 μV var normalt bort.

Den positiva kontrollen vid början och slutet av varje experiment ger dessutom information om tillståndet hos antennerna. En tumregel vi följer för snabb screening är om antenn svar på puff efterkontroll (Spela in # 12, tabell 2) är antingen mindre än 75% av den ¹ puff av pre-kontrollen (Spela in # 1 , tabell 2) eller mindre än den 2: ^a bloss av pre-kontroll (rad # 2, tabell 2) därefter experimentet inte används i dataanalysen beroende på möjlig nedbrytning av prep (figur 3). Ett exempel på den första tumregeln skulle vara Spela in # 1 = 2730 μV och spela # 12 = 1680 μV, och den andra tumregeln om Spela in # 2 = 2350 μV och spela # 12 = 1680 μV, i vart och ett av dessa fall skulle prep och experimentera resultat kasseras.

Enrepresentativt exempel på att korrigera den externa rådgivande gruppens svar värden uppmätta med den positiva kontroll skulle vara följande.

Försök #	EAG (μV)	Försök # 2	EAG (μV)	Försök # 3	EAG (μV)
(+) Ctrl	2800	(+) Ctrl	2420	(+) Ctrl	3030
Cmpnd En	3000	Cmpnd En	2500	Cmpnd En	3440
(-) Ctrl	530	(-) Ctrl	755	(-) Ctrl	910
Cmpnd B	2400	Cmpnd B	2000	Cmpnd B	2560
(+) Ctrl	2770	(+) Ctrl	2400	(+) Ctrl	3020

Användning av värdena ovan för ett N = 3 experiment är den negativa kontrollen gensvar subtraheras från varje värde inom varje experiment under antagandet den negativa kontrollen är baslinjen antenn svar på den mekaniska bloss och kvarvarande lösningsmedel.

Försök # 1	EAG (μV)	Försök # 2	EAG (μV)	Försök # 3	EAG (μV)
(+) Ctrl	2270	(+) Ctrl	1665	(+) Ctrl	2120
Cmpnd En	2470	Cmpnd En	1745	Cmpnd En	2530
(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0
Cmpnd B	1870	Cmpnd B	1245	Cmpnd B	1650
(+) Ctrl	2240	(+) Ctrl	1645	(+) Ctrl	2110

De positiva kontroller för varje experiment skulle då medelvärdet och korrigeras till 1.000 μV, notera förhållandet för korrigering till 1.000 μV. En datablad (t.ex. Excel) kan lätt manipuleras för att omvandla svar på användbara data.

Försök # 1	AVG (μV)	Försök # 2	AVG (μV)	Försök # 3	AVG (μV)
(+) Ctrl	2255	(+) Ctrl	1655	(+) Ctrl	2115
(+) Ctrl adj.	1000 (0.443)	(+) Ctrl adj.	1000 (0.604)	(+) Ctrl adj.	1000 (0.473)

Multiplicera med korrektion förhållande inom varje experiment A och förening B är värdena för föreningen justeras sedan.

Försök # 1	Just. EAG (μV)	Försök # 2	Just. EAG (μV)	Försök # 3	Just. EAG (μV)
Cmpnd En	1094	Cmpnd En	1054	Cmpnd En	1197
Cmpnd B	828	Cmpnd B	752	Cmpnd B	780

Medelvärdena (medel) för varje förening bestäms sedan tillsammans med andra relevanta statistiska uppgifter och den externa rådgivande gruppens svar för de testade föreningarna kan sedan utvärderasför kandidatur för ytterligare utredning.

Förening	EAG (μV)	Nej Kör, N =
En	1115	3
B	787	3

Figur 1. Representant EAG för manlig antenn svar (1180 μV) till pre-kontroll (1 ^st positiv kontroll puff) som skulle förkastas på grund av dålig antenn svar efter att säkerställa antennerna har god kontakt med gel. Blå staplar i botten fönster representerar två sekunders pust av flyktiga. Klicka här för att visa en större bild .

Trong> Figur 2. representant EAG för den kvinnliga antenn svaret (3400 μV) till 1: ^a puff pre-kontroll som skulle vara lämplig. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Representant EAG för den kvinnliga antenn svaret (1680 μV) till efterkontroll (föregående positiv kontroll för varje experiment) som skulle anses dålig och tyder på antenner nedbrytning (<75% av 1: ^a pre-kontroll eller < 2: ^a puff värde av pre-kontroll). För detta exempel 1: ^a pre-kontroll puff var 2.730 μV och 2: ^a pre-kontroll puff var 2.350 μV. Klicka här för att visa en större bild .

dflinebreak ">
Figur 4. Representant EAG för den kvinnliga antenn svaret (3.800 μV) till puff av en kandidat flyktigt blandning och de efterföljande mätningar av den maximala initiala deformationen (3.800 μV), det första lutningen under blosset löptid (0,3 s/1.2 mV = 0,25 s / mV), och lutningen för den återstående puff löptid (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5. Liten modifierat kärl innehållande en provmatrisen och tillhörande flyktiga att pustade över A. transitella antenner.

ad/3931/3931table1.jpg "/>
Tabell 1. In situ flyktiga utsläpp Nonpareil mandel (2007) och eag svar bestäms av en annorlunda och mindre känslig konfiguration i Autospike programmet.

Tabell 2. Exempel på ett formulär för registrering manliga och kvinnliga antenn svar på enskilda flyktiga komponenter.

Tabell 3. Exempel på ett formulär för registrering manliga och kvinnliga antenn svar på flyktiga blandningar och / eller buketter.

Tabell 4. Exempel på framställning av 10 ml av en 5 mg / ml lösning för två olika förhållanden av blandningar.

Tabell 5. Exempel på formulär för registrering av två på varandra följande puffar av enstaka flyktiga komponenter över manligt och kvinnligt antenner.

Discussion

Användning av electroantennogram inspelningar som en bioanalys för att bestämma chemoreception svar hos en målinsekt är ganska vanliga och talrika studier som använder EAG som en detektor för utflödet från ett gaskromatogram (GC-EAD) kan hittas i litteraturen. ^9,10 Metoden demonstreras kommer att ge en snabb screening av ekvivalenta mängder av flyktiga komponenter med höga replikationer för trygg tilldelning av den relativa respons. Det AutoSpike program i Syntech mjukvaran är ett bra program för screening av flyktiga eftersom det kan ge maximal signal deformationen amplitud från antennerna (figurerna 1-3), som vi presenterar här som "screening"-värdet. Dessutom kan andra grundläggande information för semi-avancerad användning (se figur 4) erhållas med AutoSpike beroende på konfigurationsinställningarna och vad forskaren vill komma från antenn svar. Den GcEAD eller EagPro Syntech program är apphållbarhet enligt mer avancerade experiment eller för forskarna känner till elektrofysiologiska svar då resulterande spår ger större detalj i tidsförloppet för antenn depolarisering svar.

Före screening process av föreningarna detekterade från en värdväxt är korrekt identifiering av flyktiga viktigt och bör följa strikta regler. Om möjligt bör två GC kolonner med olika polaritet (dvs, DB-Wax och DB-1) kan användas för inledande del identifiering via matchning av kvarhållande index (RIS, se tabell 1). Den bästa metoden är att kontrollera identiteten på varje flyktigt med en verifiering standard på två kolumner. ¹¹ Om identitet några av föreningarna inte är möjligt, kan klarlägga sin bioaktivitet fortfarande uppnås genom användning av GC-EAD. ¹² men , replikering av det biologiska testet kan vara begränsad beroende på den flyktiga insamlingsmetod, kommer mängden av analyten inte reaDily tillgänglig utan en inre standard, kommer föreningen identitet inte omedelbart är känt, och efterföljande testning i blandningar skulle inte vara möjlig.

Om förseglade ordentligt och kallt, kan lösningar av flyktiga ämnen i pentan normalt lagras i ca 1 vecka. Om de förseglade pipetter som innehåller laddade skivan placeras i en zip-lock påse och kylda de kan lagras i ca 24 timmar. Vi hittade dock det bäst att ladda skivor på morgonen den externa rådgivande gruppens analyser och kan kasta överblivna pipetter i slutet av dagen. Doser för de standardiserade puffar bör bestämmas experimentellt för varje insektsarter om litteratur är inte lätt tillgänglig.

Formulering av blandningar är typiskt en mödosam process. Visas här är några relativt enkla metoder, om än inte heltäckande. Forskare uppmuntras att göra vidare läsning om olika tekniker. Efter utvärdering av enskilda komponenter responses från flyktiga värd anläggningen har utförts, kan studier av blandningar skall genomföras. Ett exempel är att använda de flyktiga utveckla de högre relativa svaren från undersökningen. Andra exempel är:. Kombinationer av relativ släpps mängder förhållandet mellan relativa svar kontra relativa mängder, kvalitetssortering av klass av föreningar eller flyktiga skillnader i fenologiska stadier eller olika stadier av matriserna (skadat vs oskadad) ¹³

De visade blandningar är enkla kombinationer av dessa olika strategier. Den 01:01:01 är en tertiär blandning baserad på de relativa höga responser i den initiala screeningen, men också representerar olika klasser av föreningar. Humulene är en seskviterpen, är 2-undekanon en fettsyra nedbrytningsprodukt, och 2-fenyletanol är en bensenoid. Dessa föreningar representerar de huvudsakliga klasserna av flyktiga typiskt sett i växt-utsläpp. Den 01:02:04 förhållandet i den andra blandningen innefattar de relativa förhållandena av flyktiga detekterade during på GC-MS-analys. ⁴ Emellertid är användningen av SPME och GC-MS tillhandahålla endast relativa förhållanden och användning av GC-FID-analys jämförd med kalibreringskurvor för de klasser av föreningar rekommenderas för en mer exakt startpunkt för förhållanden baserat på detekterade flyktiga ämnen.

Gaffeln Elektroden EAG teknik är en av de mer enkla metoder som används i elektrofysiologiska experiment ^14. Läsaren uppmanas att utföra ytterligare litteratursökning för avancerade tillämpningar bortom denna metod. Dessutom kan screening av ex situ-matriser utföras med den metod som visat, men att använda små (60 ml) modifierade fartyg (Figur 5) innehåller växtdelar (t.ex. mandel). När du använder större behållare (t.ex. 120 ml lock fartyg med speciella adaptrar för användning med EAG Puffer) rekommenderas för att öka flödet för att säkerställa korrekt evakuering av behållaren. Ett experiment should genomföras då en positiv kontroll placeras i behållaren för att säkerställa en korrekt stimulering uppnås vid den nödvändiga flödeshastigheten. Användningen av två sekunders bloss för de enskilda komponenterna inte är absolut nödvändigt och bloss i storleksordningen 0,5 till 1,0 sekunder är mer typisk. Det gör det möjligt att lättare framtida jämförelser med puffar containertransport med flyktiga buketter eftersom dessa kräver normalt en längre puff vid högre flödeshastigheter. Våra laboratorier utnyttjar två sekunders puff för att jämföra enskilda komponenter och / eller svar blandning direkt till puffar med matriser i små kärl (se figur 5). De två andra puff på dessa små kärl säkerställer fullständig evakuering av behållaren när den lämpliga flödeshastigheten ställs in.

Vidare kan förvärva en andra bloss skall utföras, men den andra bloss är inte absolut nödvändigt för screening eftersom mängden av de förflyktigade komponenten inte längre hålls vid en strikt standard (<strong> Tabell 5). Emellertid kan denna information vara värdefull för eventuella dos-respons-försök. ¹⁵ A mycket lägre svar kan tyda på ett minskat svar till lägre koncentrationer medan en konsekvent reaktion kan tyda dosen är nära tröskeln för hög respons. Det bör noteras att det finns andra fysiologiska förklaringar till förändringen i svar ¹⁴ på den andra bloss, men den information som bidrar att vägledning för framtida experiment. Om hög genomströmning är inte absolut kritisk, kan användningen av en andra bloss av varje komponent vara informativ.

Om jungfruliga hona är riktade prov, NU larver i sista stadiet eller puppor kan könsbestämmas och hålls åtskilda ¹⁶ för att kvinnliga framväxten ske i separata behållare.

Justering av skalan kan vara nödvändiga för att rymma antenn svar om den överstiger den aktuella skalan. Skalorna på EAG programvara skärm can bistå med att fastställa hur många mm per μV svar. Andra insekter kan variera i sin känslighet.

Metoden visade gör det lätt att lära, snabb, tillförlitlig och hög-throughput screening protokoll för att minska antalet flyktiga för bioaktivitet vederlag enligt komplexa sammansättning av flyktiga ämnen värdväxt. Förutsatt att antenner av provet är lämpliga, kan gaffeln EAG metod för snabb bedömning av ett stort antal flyktiga komponenter eller blandningar av komponenter, och jämförelse av svaren till det av en standard. Ytterst är en bioassay som bedömer aktiviteten hos komponenten eller blandning av komponenter i ett fält miljö mest giltiga metoden. Men fältstudier är ofta mycket tids-och arbetskrävande, dyr och kräver flera månader att få rätt resultat.