सक्रिय उपकला सेल lysates से जीएसटी टैग उत्परिवर्ती रो प्रोटीन (जीएसटी RhoA (G17A)) का उपयोग रो - GEFs आत्मीयता वर्षा
Summary
यहां प्रस्तुत पद्धति एक उत्परिवर्ती RhoA जीएसटी संलयन प्रोटीन है कि उच्च सक्रिय GEFs के लिए संबंध है का उपयोग करने द्वारा RhoA विशिष्ट सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी) / GTP संवर्धित कोशिकाओं में विनिमय कारक (GEFs) के सक्रियण का पालन करने के लिए एक परख का वर्णन करता है. GEFs सेल lysates, के पश्चिमी सोख्ता और densitometry द्वारा मात्रा से पता लगाया से उपजी है.
Abstract
Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell migration, gene expression, cell cycle progression and cell adhesion 1. Rho proteins are molecular switches that are active in GTP-bound and inactive in GDP-bound state. Their activation is mediated by a family of Guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) proteins. Rho-GEFs constitute a large family, with overlapping specificities 2. Although a lot of progress has been made in identifying the GEFs activated by specific signals, there are still many questions remaining regarding the pathway-specific regulation of these proteins. The number of Rho-GEFs exceeds 70, and each cell expresses more than one GEF protein. In addition, many of these proteins activate not only Rho, but other members of the family, contributing further to the complexity of the regulatory networks. Importantly, exploring how GEFs are regulated requires a method to follow the active pool of individual GEFs in cells activated by different stimuli. Here we provide a step-by-step protocol for a method used to assess and quantify the available active Rho-specific GEFs using an affinity precipitation assay. This assay was developed a few years ago in the Burridge lab 3,4 and we have used it in kidney tubular cell lines 5,6,7. The assay takes advantage of a “nucleotide free” mutant RhoA, with a high affinity for active GEFs. The mutation (G17A) renders the protein unable to bind GDP or GTP and this state mimics the intermediate state that is bound to the GEF. A GST-tagged version of this mutant protein is expressed and purified from E. coli, bound to glutathione sepharose beads and used to precipitate active GEFs from lysates of untreated and stimulated cells. As most GEFs are activated via posttranslational modifications or release from inhibitory bindings, their active state is preserved in cell lysates, and they can be detected by this assay8. Captured proteins can be probed for known GEFs by detection with specific antibodies using Western blotting, or analyzed by Mass Spectrometry to identify unknown GEFs activated by certain stimuli.
Protocol
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि केवल उपलब्ध गैर रेडियोधर्मी GEFs है कि कोशिकाओं में GEFs के सक्रिय पूल का पालन कर सकते हैं के लिए सक्रियण परख है. परख तेज़ी छोटे GTPases के निम्नलिखित सक्रियण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आरएसी और Cdc42 के खिलाफ GEFs के लिए इस्तेमाल किया assays के लिए इसी तरह की है. उन assays अलग जीएसटी टैग प्रोटीन का उपयोग करें और से यहाँ वर्णित एक मामूली अंतर है, लेकिन बुनियादी कदम वही कर रहे हैं. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य छोटे GTPase और जीईएफ सक्रियण assays के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
प्रस्तुत जीईएफ परख हाल ही में परमाणु 9,10 भिन्न के लिए आवेदन के लिए संशोधित किया गया था. आगे के संशोधनों के साथ, अन्य subcellular डिब्बों में जीईएफ सक्रियण के परीक्षण भी संभव हो सकता है.
हम प्रस्तुत करने के लिए उपकला कोशिका लाइनों में 5,6,7 GEFs के सक्रियण अध्ययन विधि का उपयोग करें. कुछ अनुकूलन के साथ, इस परख के लिए किसी भी कोशिका लाइन से GEFs का पता लगाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. जब adaptiएक विशेष सेल प्रकार, इष्टतम सेल संख्या, lysis बफर आयतन, और जीईएफ के लिए विधि का पता लगाने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए एनजी मिल (पश्चिमी सोख्ता लिए एक अच्छा प्रतिरक्षी महत्वपूर्ण है). परख की प्रारंभिक सेटअप के लिए यह एक प्रेरणा है कि ब्याज की जीईएफ को सक्रिय करने के लिए जाना जाता है का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है. जब एक अज्ञात प्रेरणा का उपयोग कर, हमेशा की एक सकारात्मक नियंत्रण के उपयोग के लिए सत्यापित करें कि आपके परख काम कर रहा है. इस परख पश्चिमी सोख्ता द्वारा ज्ञात GEFs के सक्रियण पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह भी पर्याप्त लिए अज्ञात GEFs की पहचान है. इस के लिए, नियंत्रण और प्रेरित नमूनों से कब्जा कर लिया GEFs Coomassie से सना हुआ एक जेल पर विश्लेषण किया जाना चाहिए. बैंड है कि केवल उत्तेजित नमूनों में दिखाई में सक्रिय GEFs हो और पहचान के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री (5 उदाहरण के लिए) द्वारा भेजा जा सकता है हो सकता है.
अंत में, एक सजग नोट. परख धारणा है कि posttranslational सक्रिय GEFs प्रतिपादन संशोधनों सेल के बाद संरक्षित कर रहे हैं पर आधारित है. दरअसल, यह स्पष्ट रूप से है क्षमताओंसे GEFs की एक संख्या के लिए, और अपने प्रतिष्ठानों के बाद से, इस परख विभिन्न समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है जीईएफ H1, p115RhoGEF और XPLN (जैसे 5,11,12,13) सहित विभिन्न GEFs के, की सक्रियता का पता लगाने. सक्रिय राज्य के संरक्षण लेकिन सभी GEFs के मामले में नहीं होता है, और इसलिए यह बोधगम्य है कि इस परख सभी GEFs के लिए काम नहीं करेगा हो सकता है. यह भी ध्यान दिया जाना है, कि कई GEFs एक से अधिक छोटे GTPases की ओर गतिविधि डालती है. इस प्रकार, जब एक विशिष्ट जीईएफ अध्ययन किया है, यह में जीईएफ अन्य छोटे GTPases, के रूप में के रूप में अच्छी तरह कार्यात्मक अध्ययन RhoA, Rac1 और Cdc42 की जांच के लिए तेज़ी assays के साथ इस परख पूरक की सिफारिश की है.
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम:
बदल बैक्टीरिया की कालोनियों ताजा, ठीक से तैयार प्लेट से उठाया amp, अच्छा परिणाम उपज और पर्याप्त चयन सुनिश्चित किया जाना चाहिए. सक्षम अन्य स्रोतों से प्राप्त कोशिकाओं के लिए परिवर्तन की स्थिति भिन्न है और परामर्श किया जाना चाहिए सकता है. </p>
प्रोटीन तैयारी (2.3 कदम से) प्रोटोकॉल और परख (3.2 कदम से) के सभी चरणों ° ठंडा समाधान और centrifuges के साथ सी 4 बजे किया जाना चाहिए.
बैक्टीरियल सेल (2.5 कदम) व्यापक और पूर्ण आदेश में एक सजातीय निलंबन प्राप्त करना चाहिए. जब बैक्टीरिया lysing भंवर, और lysate एकांतर पिपेट, जबकि यह 4 ° सेल्सियस पर बनाए रखने और सुनिश्चित sonication प्रोटीन denaturing रोकने के लिए बर्फ पर किया जाता है. यदि sonicator की एक अलग मॉडल का उपयोग कर, स्थितियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. मोतियों के साथ sonicate की ऊष्मायन हमेशा एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जा करने के लिए पर्याप्त बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए, और देखभाल करने के लिए लगातार समय रखने के लिए लिया जाना चाहिए.
जीएसटी – रो म्यूटेंट को कुछ हद तक अस्थिर कर रहे हैं जब बैक्टीरिया में व्यक्त की, तो यह सबसे अच्छा है सही दूर या कुछ दिनों के भीतर तैयार मोती का उपयोग करें.
तेज़ी परख (भाग 3) समय और तापमान संवेदनशील है,सक्रिय GEFs आसानी सेल lysate से खो किया जा सकता है, तो चरण में जल्दी के रूप में के रूप में संभव है किया जाना चाहिए.
निम्न खंड कुछ मुसीबत शूटिंग युक्तियाँ शामिल हैं.
नहीं या अंतिम मनका तैयारी में उत्परिवर्ती रो प्रोटीन की बहुत कम राशि: यह अक्षम प्रेरण, बैक्टीरिया की अपर्याप्त lysis, या तैयार करने की प्रक्रिया या भंडारण के दौरान प्रोटीन का एक नुकसान के कारण हो सकता है. इन संभावनाओं के कुछ समस्या निवारण में मदद करने के लिए, बैक्टीरिया के नमूने से पहले और बाद में शामिल विश्लेषण किया जा सकता है. अगर वहाँ प्रोटीन एक नया रेखादार थाली से या फिर बदल सक्षम कोशिकाओं से एक कॉलोनी का उपयोग इस प्रक्रिया को दोहराने के गरीब शामिल है. अलग IPTG सांद्रता और प्रेरण बार भी परीक्षण किया जाना चाहिए. अगर सेल (यानी प्रोटीन सतह पर तैरनेवाला के बजाय गोली में रहता है) अपर्याप्त lysis बफर में नमक और डिटर्जेंट के अलग सांद्रता है की कोशिश की जा सकती है. वैकल्पिक sonication बार औरसेटिंग्स, विचार किया जाना चाहिए और सेल की क्षमता निर्धारित करने के लिए पहले और बाद sonication नमूनों माइक्रोस्कोपी द्वारा जाँच की जा सकती है.
नहीं जीईएफ उपजी है, भले ही जीएसटी प्रोटीन मनकों पर मौजूद है: यह तेज़ी परख के दौरान तकनीकी मुद्दों के कारण हो सकता है, हो सकता है या अध्ययन जीईएफ की सक्रियण लागू प्रेरणा का उपयोग का एक वास्तविक अनुपस्थिति द्वारा. हमेशा सत्यापित करें कि आपके परख काम करता है के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में जाना जाता है उत्तेजना का उपयोग करें. कुछ दिनों के भीतर तैयार मोतियों का प्रयोग करें. यदि तेज़ी परख जीईएफ की undetectable मात्रा में सभी परिस्थितियों में अध्ययन कब्जा, सत्यापित करें कि आपके जीईएफ मौजूद और centrifugation कि परख (3.3 कदम) के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है के बाद अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला में detectable है. सुनिश्चित करें कि सभी buffers और protease inhibitors के ताजा कर रहे हैं, और संभव के रूप में उपवास के रूप में बर्फ पर सभी चरणों का पालन करें. इनपुट प्रोटीन (2 प्लेटें / नमूना से lysates का उपयोग करके जैसे) की मात्रा बढ़ाएँ. है यदि वर्षण परख बेसल precipi से पता चलता हैआपके जीईएफ tation, लेकिन नियंत्रण और उत्तेजित नमूने (चित्र 4) के बीच कोई अंतर नहीं देखा है, पुष्टि है कि लागू उत्तेजना अन्य ज्ञात प्रभाव (अन्य संकेत दे रास्ते की सक्रियता का पता लगाने के द्वारा उदाहरण के लिए) का उपयोग कर काम कर समस्या निवारण शुरू करते हैं. उपचार शर्तों और / या सांद्रता को बदलने पर विचार करें. डेटा साहित्य रिपोर्टिंग से आपके प्रोत्साहन रो या अन्य संकेतन सक्रिय करने की संभावना समय और सांद्रता भविष्यवाणी पर भरोसा करते हैं. जब इलाज समय अनुकूलन, दोनों कम और लंबे समय के अंक का उपयोग करने के लिए, के रूप में जीईएफ सक्रियण एक समय अच्छी तरह से detectable रो सक्रियण से पहले बिंदु पर सबसे अच्छा detectable हो सकता है. अंत में, एक ही उत्तेजना बीतने संख्या की वजह से सेल प्रतिक्रिया में परिवर्तन की वजह से सक्रियण के एक चर डिग्री, confluency सेल, आदि में परिणाम सकता है
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा संस्थान (CIHR) (एमओपी 97,774) और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा (480,619 NSERC अनुदान एन.आर.) द्वारा वित्त पोषित किया गया. एस एक KRESCENT नई अन्वेषक पुरस्कार (कनाडा, कनाडा के नेफ्रोलोजी सोसायटी और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान की किडनी फाउंडेशन के संयुक्त पुरस्कार) और ओंटारियो मंत्रालय के अनुसंधान और अभिनव से एक प्रारंभिक शोधक पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है. परिवार कल्याण ली का शिंग छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
| DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
| SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
| LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
| Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
| Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
| Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
| Hepes | SIGMA | H4034 | |
| NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
| MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
| TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
| PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
| Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
| Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
| Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
| Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
| Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
| Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
| BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
| Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
| Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
| Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
| Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
| Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.
References
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