여기에 제시된 방법은 활성 GEFs에 대한 높은 친화력을 가진 돌연변이 RhoA GST 융합 단백질을 사용함으로써 교양 세포에서 RhoA 특정 GDP / GTP 교환 요인 (GEFs)의 활성화를 따르도록하는 분석에 대해 설명합니다. GEFs는 서양 모래 바닥과 densitometry에 의해 계량에 의해 감지 세포 lysates에서 시켰던됩니다.
작은 GTPases의 Rho 가족의 단백질은 cytoskeleton의 중앙 규제이며, 세포 마이 그 레이션, 유전자 발현, 세포주기의 진행과 세포 접착 일을 포함하여 세포 공정의 수많은 종류를 제어합니다. Rho 단백질은 GDP 바인딩된 상태에서 GTP 바인딩된 및 운영 중지로 활약하는 분자 스위치입니다. 그들의 정품 인증은 구아닌 – 염기 교환 팩터 (GEF) 단백질의 가족에 의해 매개된다. Rho-GEFs은 specificities에게 2를 중복으로 큰 가족을 구성합니다. 진보 많은이 특정 신호에 의해 활성화 GEFs을 확인하였습니다 있지만, 이러한 단백질의 통로가 특정 규제에 관한 나머지 많은 질문이 아직 없습니다. Rho-GEFs의 수가 70을 초과하고, 각 셀에 두 개 이상 GEF 단백질을 표현한다. 또한, 이러한 단백질의 대부분은 Rho뿐만 아니라 활성화하지만, 가족의 다른 구성원은 규제 네트워크의 복잡도에 더 기여. 중요한 것은, 탐험어떻게 GEFs이 규제되는 것은 다양한 자극에 의해 활성화된 세포에서 개별 GEFs의 활성 풀을 수행하는 방법을 필요로합니다. 여기 친화 강수량 분석을 사용하여 사용 가능한 활성 Rho 특정 GEFs을 평가하고 계량하는 데 사용하는 방법에 대한 단계별 절차를 제공합니다. 이 분석은 Burridge 실험실 3,4에서 몇 년 전에 개발된 우리는 신장 관형 셀 라인 5,6,7에 사용 하였다. 검정은 활성 GEFs에 대한 높은 친화력으로, "염기 무료"돌연변이 RhoA 활용합니다. 변이 (G17A)은 GDP 또는 GTP하고이 상태가 GEF에 바인딩되어 중간 상태를 모방한 것이었 묶어 단백질이없는 렌더링. 이 돌연변이 단백질의 GST 태그가 추가된 버전은 표현과 E.에서 정화되어 대장균, 글루타티온 세파 로스 비즈에 바인딩 및 치료와 자극을 세포 lysates에서 적극 GEFs을 침전하는 데 사용됩니다. 대부분의 GEFs은 억제 바인딩의 posttranslational 변경 또는 릴리스, 그들의 적극적인 상태로 활성화되면세포 lysates에 보존되고, 그들이 검정 8 시까지 감지가 가능하다. 캡처한 단백질은 서양의 모래 바닥을 사용하여 특정 항체로 검출하여 알려진 GEFs에 대한 탐지, 또는 특정 자극에 의해 활성화 미지 GEFs을 확인하기 위해 질량 분광법에 의해 분석됩니다.
여기에 제시된 방법은 세포의 GEFs의 활성 풀을 따라 GEFs 대한에서만 사용할 수 비 방사성 활성 분석이다. 분석은 다음과 같은 작은 GTPases의 활성화뿐만 아니라 RAC 및 Cdc42에 대한 GEFs 사용 강수량의 assays와 비슷합니다. 이러한 assays 다른 GST 태그가 추가된 단백질을 사용하고 여기에서 설명한 것과 약간 차이가 있지만 기본적인 단계는 동일합니다. 따라서이 프로토콜은 쉽게 다른 작은 GTPase와 GEF 활성화 assays에 대한 적응하실 수 있습니다.
제시 GEF 분석은 최근 핵 분수 9,10를위한 응용 프로그램으로 바뀌었습니다. 추가로 수정, 다른 subcellular 구획의 GEF 활성화의 테스트도 가능합니다 수도 있습니다.
우리는 상피 세포 라인 5,6,7의 GEFs의 활성화를 공부하는 표시 방법을 사용하십시오. 일부 최적화를 통해,이 분석은 모든 세포 라인에서 GEFs를 감지하는 적합해야합니다. 언제 adapti특정 세포 유형에 NG, 테스트해야하는 GEF를위한 최적의 휴대폰 번호, 용해 버퍼 볼륨, 및 검출 방법 (서양은 모래 바닥에 대한 좋은 항체를 중요)을 찾습니다. 분석의 초기 설정의 경우 그것은 관심 GEF을 활성화하는 것으로 알려져 자극을 사용하는 것이 좋습니다. 알 수없는 자극을 사용할 때, 항상 분석의 작동 여부를 확인하는 데 긍정적인 제어를 사용합니다. 이 분석은 서양의 모래 바닥으로 알려져 GEFs의 활성화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 알 수없는 GEFs를 파악하는 것도 충분한 것입니다. 이를 위해 통제와 자극 샘플에서 캡처한 GEFs는 Coomassie 묻은 겔에서 분석되어야한다. 오직 자극 표본에 나타나는 밴드 활성화 GEFs를 포함할 수도 있고 질량 분석법 (예 : 5)에 의해 식별을 위해 보낼 수 있습니다.
마지막으로, 경계의 메모. 검정은 활성 GEFs 렌더링 posttranslational 수정이 세포 용해 후 보존되었다는 가정하에 기반으로합니다. 실제로, 이것은 분명히 CA입니다GEFs의 번호 SE, 그 시설부터,이 분석은 GEF-H1, p115RhoGEF 및 XPLN (예 : 5,11,12,13)를 포함하여 다양한 GEFs의 활성화를 탐지하기 위해 여러 그룹에 의해 사용되었습니다. 활성 상태의 보존 그러나 모든 GEFs의 경우 발생하지 않을 수도, 따라서 그것이 분석은 모든 GEFs 목적에 부합되지 않는다는 것에 생각할 수있다. 그것은 또한 많은 GEFs 하나 이상의 작은 GTPases 향해 활동을 견딜수 것을 언급되어야한다. 따라서, 특정 GEF를 공부하면, 그것은 RhoA, Rac1 및 Cdc42를 검사 기타 소형 GTPases뿐만 아니라, 기능성 연구를위한 GEF의 강수량의 assays로이 분석을 보완하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 중요 단계 :
변형 박테리아의 식민지 앰프, 좋은 파생물 및 수확량에 의한 적절한 선택을 위해 신선하고 제대로 준비 접시에서 포착해야합니다. 다른 출처에서 얻은 유능한 세포에 대한 변환 조건이 다를 수와 협의하여야한다. </p>
단백질 준비 프로토콜 (단계 2.3부터) 및 분석 (단계 3.2에서)의 모든 단계 ° C 냉각 솔루션 및 원심 분리기와 4에서 수행해야합니다.
박테리아 용해 (단계 2.5) 균일한 현탁액을 얻기 위해 철저하고 완벽하게해야합니다. 박테리아, 와동을 lysing 4 ° C에서 그것을 유지하면서, 번갈아 lysate를 피펫과 sonication은 단백질 denaturing 방지하기 위해 얼음에서 수행되도록합니다. sonicator의 다른 모델을 사용하면 조건이 조정해야 할 수도 있습니다. 구슬로 sonicate의 인큐베이션 항상 충분한 구속력을 보장하기 위해 회전에서 4 ° C에서 이루어져야하고, 치료는 타이밍이 일관성을 유지하기 위해 이동해야합니다.
GST-Rho의 돌연변이 박테리아로 표현하면 다소 불안정하므로 즉시 또는 몇 일 이내에 준비한 구슬을 사용하는 것이 그것이다.
강수량 분석 (파트 3), 시간 및 온도 구분의 활성 GEFs 쉽게 세포 lysate에서 손실될 수 있으므로 단계는 최대한 빨리 수행해야합니다.
다음 절에서는 몇 가지 문제 해결 팁을 포함하고 있습니다.
아니오 또는 최종 비드 준비 돌연변 Rho 단백질의 매우 낮은 금액 : 이것은 비효율적인 유도, 박테리아 부족 용해, 또는 준비 과정이나 보관 중에 단백질의 손실로 인한 수 없습니다. 이러한 가능성의 일부를 해결하기 위해 박테리아의 샘플은 유도 전후 분석할 수 있습니다. 단백질 갓 streaked 판이나 다시 변형 유능한 세포에서 식민지를 사용하는 과정을 반복에 가난한 유도가있다면. 다른 IPTG의 농도 및 유도 시간도 테스트해야합니다. 용해가 용해 버퍼에 소금과 세제 농도를 변화 (즉 단백질 대신 뜨는의 펠렛에 남아) 부족한 경우에는 재판을받을 수 있습니다. 대체 sonication 시간 및설정이 고려되어야하고, sonication 전후 샘플은 용해의 효율성을 결정하기 위해 현미경으로 확인하실 수 있습니다.
아니오 GST-단백질이 구슬에 존재하더라도, GEF를 시켰던 없음 : 이것은 강수량 분석 도중에 기술적인 문제로 인해, 또는 적용 자극을 사용하여 공부 GEF의 활성화 실제 부재가 있습니다. 항상 검정 작동하는지 확인하기 위해 긍정적인 제어로 알려진 자극을 사용합니다. 몇 일 이내에 준비된 비즈를 사용합니다. 강수량 분석은 모든 조건에서 공부 GEF의 탐지 금액을 캡처하는 경우, GEF가 존재하고 분석 (단계 3.3)에 사용하는 원심 분리 후 뜨는에서 잘 감지 있는지 확인합니다. 모든 버퍼와 프로 테아제 억제제가 신선이며, 가능한 빨리 얼음의 모든 단계를 수행하십시오. 입력 단백질 (2 접시 / 샘플에서 lysates를 사용하여 등)의 양을 늘립니다. 강수량 분석은 기저 precipi가 표시되면당신의 GEF의 tation지만 아무런 차이 제어 및 자극 샘플 (그림 4) 사이에 본 적이있다는 적용 자극이 다른 알려진 효과를 (다른 신호 전달 경로의 활성화를 감지하여 예)을 사용하여 일한다고 확인하여 문제 해결을 시작합니다. 치료 조건 및 / 또는 농도를 변경을 고려합니다. 귀하의 자극 가능성이 시간과 농도를 예측하는 Rho 또는 다른 신호를 활성화하는 방법 문헌보고의 데이터에 의존하고 있습니다. GEF 활성화가 잘 감지 Rho 활성화 이전 시점에 가장 잘 감지 수도로서 처리 시간을 최적화하면 모두 짧고 오랫동안 포인트를 사용합니다. 마지막으로, 동일한 자극 통과 번호에 의한 세포 반응의 변화로 인해 활성화의 변수 학위 confluency 세포 등을 초래할 수
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강 연구를위한 캐나다 연구소 (CIHR) (걸레-97774)과 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC 480,619, 그랜트 NR)에 의해 재정 지원되었다. KS는 KRESCENT 새로운 탐정 수상 (캐나다, 캐나다 신장학 사회와 건강 연구소의 캐나다 연구소의 신장 재단의 공동 수상)와 연구 및 혁신의 온타리오 교육부에서 조기 연구원 상을받는 사람입니다. FW는 리튬 카의 아성 장학금으로 지원됩니다.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.