Il metodo qui presentato descrive un saggio per seguire l'attivazione di specifici RhoA PIL / GTP Fattori di cambio (GEFs) in cellule coltivate facendo uso di una proteina di fusione GST RhoA mutante che ha un'elevata affinità per GEFs attivati. GEFs vengono precipitati da lisati cellulari, rilevati da Western blotting e quantificato mediante densitometria.
Le proteine della famiglia Rho delle piccole GTPasi sono regolatori centrali del citoscheletro, e controllare una grande varietà di processi cellulari, compresa la migrazione cellulare, l'espressione genica, la progressione del ciclo cellulare e l'adesione cellulare 1. Proteine Rho sono interruttori molecolari che sono attivi in GTP-bound e inattivo in termini di PIL-bound stato. La loro attivazione è mediata da una famiglia di guanina nucleotide cambio Factor (GEF) proteine. Rho-GEFs costituiscono una grande famiglia, con sovrapposizione di due specificità. Anche se molti progressi sono stati realizzati nella definizione delle GEFs attivati da segnali specifici, ci sono ancora molte domande in sospeso inerenti al via la regolamentazione specifica di queste proteine. Il numero di Rho-GEFs supera 70, e ciascuna cellula esprime più di una proteina GEF. Inoltre, molte di queste proteine Rho attivare non solo, ma altri membri della famiglia, contribuendo ulteriormente alla complessità delle reti di regolazione. È importante sottolineare che, esplorandocome sono regolati GEFs richiede un metodo per seguire la piscina attiva di GEFs singoli nelle cellule attivate da stimoli diversi. Qui noi forniamo un passo-passo protocollo per un metodo utilizzato per valutare e quantificare le attivi disponibili Rho-specifici GEFs utilizzando un saggio precipitazione affinità. Questo test è stato sviluppato alcuni anni fa nel laboratorio Burridge 3,4 e lo abbiamo utilizzato nelle linee di cellule tubulari renali 5,6,7. Il saggio si avvale di un "nucleotide libero" mutante RhoA, con una elevata affinità per GEFs attivi. La mutazione (G17A) rende la proteina in grado di legare PIL o GTP e questo stato imita lo stato intermedio, che è legato al GEF. Una versione GST-tag di questa proteina mutante è espressa e purificata da E. coli, legati al glutatione perline sepharose e utilizzato per far precipitare GEFs attivi da lisati di cellule non trattate e stimolata. Poiché la maggior parte GEFs vengono attivati attraverso modifiche post-traduzionali o il rilascio di associazioni inibitorie, il loro stato attivoè conservato in lisati cellulari, e possono essere rilevate da questo saggio 8. Proteine catturate possono essere sondato per GEFs noti dal rilevamento con anticorpi specifici utilizzando Western blotting, o analizzati mediante spettrometria di massa per identificare GEFs sconosciuti attivate da certi stimoli.
Il metodo qui presentato è l'unico disponibile non radioattivo test di attivazione per GEFs che possono seguire il pool attivo di GEFs nelle cellule. Il saggio è simile ai saggi utilizzati per precipitazione dopo l'attivazione delle piccole GTPasi nonché GEFs contro Rac e Cdc42. Quei saggi utilizzare diversi GST-tagged proteine e hanno lievi differenze da quella descritta qui, tuttavia i passaggi di base sono gli stessi. Così, questo protocollo può essere facilmente adattato per altre piccole GTPasi e saggi di attivazione GEF.
Il saggio presentato GEF è stato recentemente modificato per l'applicazione per le frazioni nucleari 9,10. Con ulteriori modifiche, il test di attivazione GEF in altri comparti subcellulari potrebbe anche essere possibile.
Si utilizza il metodo descritto per studiare l'attivazione di GEFs in linee cellulari epiteliali 5,6,7. Con un po 'ottimizzazione, questo test dovrebbe essere in grado di individuare GEFs da qualsiasi linea cellulare. Quando adapting a un tipo di cellula specifico, trovare il numero ottimale di cellule, il volume tampone di lisi, e metodo di rilevazione per GEF da testare (un anticorpo buona per Western blotting è importante). Per la configurazione iniziale del saggio è consigliabile utilizzare uno stimolo che è noto per attivare la GEF di interesse. Quando si utilizza uno stimolo sconosciuto, utilizzare sempre un controllo positivo per verificare che il test sta funzionando. Questa analisi può essere utilizzato per rilevare l'attivazione di GEFs noti Western blotting. Tuttavia, è anche adeguati per individuare GEFs sconosciute. Per questo, GEFs catturati dal controllo e stimolati campioni dovrebbero essere analizzati su un Coomassie macchiato di gel. Bands che appaiono solo nei campioni stimolati potrebbe contenere GEFs attivati e possono essere inviati per l'identificazione mediante spettrometria di massa (ad esempio 5).
Infine, una nota di cautela. Il saggio è basato sul presupposto che le modifiche post-traduzionali rendendo GEFs attivi vengano mantenute dopo lisi cellulare. In effetti, questo è chiaramente il case per una serie di GEFs, e poiché i suoi stabilimenti, questo test è stata utilizzata da vari gruppi per rilevare l'attivazione di GEFs diverse, tra cui GEF-H1, p115RhoGEF e XPLN (ad esempio, 5,11,12,13). Conservazione dello stato attivo, tuttavia, non potrebbe accadere in caso di tutti GEFs, e quindi è ipotizzabile che questo test non funziona per tutti i GEFs. Si deve anche notare che molti GEFs esercitano un'attività verso più di piccole GTPasi. Così, quando una specifica GEF si studia, si consiglia di completare questo test con analisi delle precipitazioni del GEF per altre piccole GTPasi, così come gli studi funzionali esame RhoA, Rac1 e Cdc42.
Passaggi critici del protocollo:
Le colonie di batteri trasformati devono essere prelevate da fresche, piatti adeguatamente preparati ad assicurarne la selezione adeguato da Amp, outgrowth buona e la resa. Condizioni di trasformazione per cellule competenti provenienti da altre fonti possono variare e dovrebbe essere consultato. </p>
Tutte le fasi del protocollo preparazione proteica (dal punto 2,3) e il saggio (dal punto 3.2) deve essere eseguita a 4 ° C con soluzioni raffreddate e centrifughe.
Lisi batterica (passo 2,5) dovrebbe essere approfondita e completa per ottenere una sospensione omogenea. Quando la lisi, batteri vortice e pipettare il lisato alternativamente, pur mantenendo a 4 ° C e garantire sonicazione è fatto su ghiaccio per impedire la denaturazione proteica. Se si utilizza un diverso modello di ultrasuoni, le condizioni possono essere necessario un aggiustamento. L'incubazione di ultrasuoni con le perle devono essere sempre fatto a 4 ° C su un agitatore per assicurare vincolante sufficiente, e occorre prestare attenzione a mantenere la tempistica coerente.
GST-Rho mutanti sono un po 'instabile quando espressa in batteri, quindi è meglio usare perline preparati immediatamente o entro pochi giorni.
Il saggio di precipitazioni (parte 3) è il tempo e sensibile alla temperatura, uns GEFs attivi possono essere facilmente perso dal lisato cellulare, così procedura deve essere eseguita più rapidamente possibile.
La seguente sezione contiene alcuni suggerimenti sulla risoluzione dei problemi.
Nessuna o quantità molto bassa di proteina mutante Rho nella preparazione finale tallone: Questo può essere causato da induzione inefficiente, insufficiente lisi dei batteri, o una perdita della proteina durante il processo di preparazione o di stoccaggio. Per risolvere alcune di queste possibilità, campioni di batteri possono essere analizzati prima e dopo l'induzione. Se vi è scarsa induzione della proteina ripetere il processo usando una colonia da una piastra appena striature o da re-trasformate cellule competenti. Concentrazioni di IPTG e tempi diversi induzione dovrebbe anche essere testato. Se la lisi è insufficiente (cioè la proteina rimane nel pellet invece del surnatante) variando le concentrazioni di sale e detersivo nel tampone di lisi può essere provato. Alternativi e tempi di sonicazioneimpostazioni dovrebbe essere considerato, e campioni prima e dopo sonicazione può essere controllato mediante microscopia per determinare l'efficienza di lisi.
No precipitato GEF, anche se la GST-proteina è presente sulle perle: Ciò può essere dovuto a problemi tecnici durante il saggio precipitazione, o da una reale assenza di attivazione del GEF studiata utilizzando lo stimolo applicato. Usare sempre uno stimolo conosciuto come un controllo positivo per verificare che il test funziona. Utilizzare le perline preparate in pochi giorni. Se il saggio precipitazione cattura quantità rilevabili di GEF studiati in tutte le condizioni, verificare che il GEF è presente ed è ben rilevabile nel supernatante dopo centrifugazione che deve essere usato per il saggio (passo 3.3). Assicurarsi che tutti i buffer e inibitori della proteasi sono freschi, ed eseguire tutti i passaggi su ghiaccio il più velocemente possibile. Aumentare la quantità di proteine di input (ad esempio utilizzando lisati da 2 piastre / campione). Se il saggio di precipitazione mostra basale precipitazionezione del GEF, ma nessuna differenza si vede tra il controllo e dei campioni stimolati (Fig. 4), avviare la risoluzione dei problemi verificando che lo stimolo applicato lavorato con altri noti effetti (ad esempio rilevando l'attivazione di altre vie di segnalazione). Si consiglia di modificare le condizioni di trattamento e / o concentrazioni. Si basano sui dati della letteratura di riferimento come il vostro stimolo attiva Rho o di segnalazione di altri per predire i tempi probabili e concentrazioni. Quando ottimizzando i tempi di trattamento, utilizzare entrambi i punti di tempo breve e lungo, come l'attivazione GEF potrebbe essere meglio rilevabile in un punto temporale precedente a ben rilevabile l'attivazione Rho. Infine, lo stesso stimolo potrebbe comportare un grado variabile di attivazione a causa di un cambiamento in risposta delle cellule causata dal numero di passaggio, cellule confluenza, ecc
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institute for Health Research (CIHR) (MOP-97774) e le scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (NSERC, concessione nr: 480.619). KS è destinatario di un New Investigator Award KRESCENT (un riconoscimento comune della Kidney Foundation of Canada, Canadian Society Nefrologia e Canadian Institute of Health Research) e un premio ricercatore alle prime armi grazie al Ministero della ricerca e dell'innovazione. FW è supportato da una borsa di studio Li Ka Shing.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.