这里介绍的方法检测,按照激活RhoA的具体GDP / GTP交换因子(全环基金)在培养细胞中的突变RhoA的GST融合蛋白具有高亲和力激活全环基金的使用。全环基金沉淀的细胞裂解物,免疫印迹和密度定量检测。
Rho家族小GTP酶的蛋白质是细胞骨架的中央监管机构,并控制多种细胞过程,包括细胞迁移,基因表达,细胞周期进程和细胞粘附1。 RHO蛋白质是活跃的分子开关是在GTP结合,并在国内生产总值的束缚态无效。其激活介导的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的蛋白质家族。卢全环基金构成一个大家族,重叠的特殊性2。虽然已经有很大进步作出识别激活特定信号的全环基金,仍然有许多问题,其余有关的具体规定,这些蛋白质的途径。的Rho环基金的数量超过70,每个单元表示一个以上的全球环境基金的蛋白质。此外,许多这些蛋白质激活不仅RHO,但其他家庭成员,进一步促进监管网络的复杂性。重要的是,探索全环基金如何监管要求的方法,按照不同的刺激活化细胞活跃的个人全环基金池。在这里,我们提供的方法来评估和量化提供积极具体的Rho-环基金使用亲和沉淀法一步一步的协议。此法是几年前开发Burridge实验室3,4和我们用它在肾小管细胞株5,6,7。该法的“核苷酸自由”突变RhoA的优势,为活跃的全环基金的高亲和力。突变(G17A),使蛋白质无法结合GDP或GTP和这个国家模仿的中间状态,则势必对全球环境基金的。 GST标签的版本的这种突变蛋白表达和纯化从E.大肠杆菌 ,势必谷胱甘肽琼脂糖珠和沉淀活跃未处理和刺激细胞裂解全环基金。作为最全环基金被激活,通过翻译后修饰或释放抑制绑定,他们的活动状态被保留在细胞裂解物,他们可以通过检测此法8。捕获的蛋白质可以被探测已知的全环基金通过检测特异性抗体,用免疫印迹,或通过质谱分析,以确定某种刺激激活的未知全环基金。
这里介绍的方法是唯一可用的激活全环基金,可以按照细胞中环基金的积极池非放射性检测。该法是类似以下的小GTP酶的激活以及对Rac和Cdc42全环基金用于检测的降水。这些实验使用不同的GST标签蛋白,并从此处所述的略有差异,但基本步骤是相同的。因此,这个协议可以很容易地被改编为其他小GTPase和GEF激活检测。
最近提出的全球环境基金法修改为9,10核分数申请。随着进一步的修改,在细胞内的其他车厢的GEF激活的测试可能也是可能的。
我们使用该方法的研究激活上皮细胞系5,6,7全环基金。随着一些优化,此法应该是足够的,以检测任何细胞株的全环基金。当adapti吴到一个特定的细胞类型,找到最佳的细胞数量,裂解液量,为全球环境基金和检测方法进行测试(一个很好的抗体免疫印迹很重要)。检测的初始设置,最好是使用一个被称为激活全球环境基金的利息刺激。使用一个未知的刺激时,总是用阳性对照,以验证您的检测工作。此法可用于检测Western印迹称为全环基金的激活。然而,这也足以识别未知的全环基金。对于这一点,从控制和刺激的样本捕获的全环基金应在考马斯染色凝胶分析。只有在刺激的样本中出现的乐队可能包含激活的全环基金,可用于识别发送质谱(如5)。
最后,一个警示说明。该法的基础上,使全环基金活跃的翻译后修饰细胞裂解后保留的假设。事实上,这显然是CA本身为全环基金的数量,因为它的机构,此法已用于各组检测激活不同的全环基金,包括全球环境基金H1,p115RhoGEF和XPLN(如5,11,12,13)。保存的活跃状态,但是可能不会发生在所有全环基金的情况下,因此,可以想象的是,此法不适用于所有的全环基金。它也必须指出,许多环基金发挥对多个小GTP酶的活性。因此,当一个特定的全球环境基金研究,建议,以配合此法与其他小GTP酶,以及研究RhoA蛋白,Rac1和Cdc42功能研究全球环境基金沉淀检测。
在协议中的关键步骤:
转化细菌菌落应挑选新鲜,适当的准备板,放大器,良好的生长和产量,以确保足够的选择。从其他来源获得的细胞转化的条件可能会有所不同,应谘询。 </p>
在4°C水冷解决方案和离心机,应执行协议(从2.3步)的蛋白制备和检测(步骤3.2)的所有步骤。
为了获得均匀的悬浮细菌裂解(2.5步)应该全面和完整的。当裂解细菌,旋涡和吸取裂解交替,同时保持在4°C,并确保超声冰,以防止蛋白质变性。如果使用不同的sonicator模型,条件可能需要进行调整。超声粉碎的珠子孵化应始终在4°C,在肩,以确保足够的约束力,并应小心保持时序一致。
GST-RHO突变有些不稳定时,在细菌中表达,所以最好使用马上或在几天内准备珠。
沉淀法(第三部分)是时间和温度敏感,的主动全环基金可以很容易地从细胞裂解物丢失,这样的步骤,应尽快进行。
以下部分包含了一些故障排除技巧。
没有或突变,在最后的珠子准备RHO蛋白量非常低,这可能会造成低效的诱导,细菌裂解不足,或蛋白质的损失在筹备过程中或存储。为了帮助解决这些可能性,细菌样本进行分析诱导前后。如果是穷人诱导的蛋白质重复使用一个殖民地,从一个新鲜的条纹板或再能干细胞转化的过程。不同的IPTG浓度和诱导时间也应该进行测试。如果裂解不足(即蛋白质仍然代替上清丸)不同的裂解液中的盐和洗涤剂浓度可以尝试。替代超声倍和应考虑设置,前后超声的样品可以通过显微镜检查,以确定裂解效率。
无沉淀,全球环境基金,即使GST蛋白是目前珠:这可能是由于技术问题,在沉淀法,或缺乏真正的研究全球环境基金的使用施加的刺激激活。始终使用已知的刺激作为阳性对照,以验证您的检测工作。在几天之内准备的珠子。如果沉淀法捕捉不到全球环境基金的研究在各种条件下的金额,确认您的全球环境基金是目前是被用来检测(步骤3.3),离心后上清检测。确保所有缓冲区和蛋白酶抑制剂是新鲜的,和冰尽可能快地执行所有步骤。增加输入蛋白量(例如,通过使用从2板/样品的裂解)。如果沉淀实验结果显示,基底降水tation您的全球环境基金,但无明显差异之间的控制和刺激的样品( 图4),通过验证,应用的刺激工作使用其他已知的影响(例如通过检测的其他信号通路的激活)开始排除故障。考虑改变治疗条件和/或浓度。从文献报告的数据,如何刺激激活RHO或其他信号来预测可能的时间和浓度依赖。优化治疗时间时,使用短期和长期的时间点,作为全球环境基金的激活可能是最好的检测时间点之前以及检测RHO激活。最后,相同的刺激可能会导致不同程度的激活因在细胞反应的变化,引起通道数,细胞汇合,等
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由加拿大健康研究协会(CIHR)(澳门币97774),自然科学和工程研究理事会,加拿大(NSERC,批NR:480619)。 KS是新研究者奖1 KRESCENT(加拿大,加拿大肾脏病学会和加拿大卫生研究院的肾脏基金会联合奖)和安大略省的研究和创新,从早期的研究者奖的收件人。 fw是由李嘉诚奖学金支持。
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.