De hier gepresenteerde methode beschrijft een assay voor activering van RhoA specifieke GDP / GTP uitruilfactoren (GEFs) in gekweekte cellen volgen door gebruik te maken van een gemuteerde RhoA GST fusieproteïne dat een hoge affiniteit voor geactiveerd GEFs heeft. GEFs worden neergeslagen uit cellysaten, gedetecteerd door Western blotting en gekwantificeerd door densitometrie.
Eiwitten van de Rho familie van kleine GTPases staan centraal regulatoren van het cytoskelet, en controle een grote verscheidenheid van cellulaire processen, waaronder cel-migratie, genexpressie, voortgang van de celcyclus en celadhesie 1. Rho eiwitten zijn moleculaire schakelaars die actief zijn in GTP-gebonden en inactief in het BBP-gebonden toestand. Hun activatie wordt gemedieerd door een familie van guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) eiwitten. Rho-GEFs vormen een grote familie, met overlappende specifieke kenmerken 2. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij het identificeren van de GEFs geactiveerd door specifieke signalen, zijn er nog veel vragen bestaan rond de route-specifieke regulatie van deze eiwitten. Het aantal van Rho-GEFs hoger is dan 70, en elke cel drukt meer dan een GEF eiwit. Bovendien zijn veel van deze eiwitten te activeren niet alleen Rho, maar andere leden van de familie, bij te dragen naar aanleiding van de complexiteit van de regelgeving netwerken. Belangrijk is dat het verkennen vanhoe GEFs worden geregeld is een methode om de actieve pool van individuele GEFs volgen cellen geactiveerd door verschillende stimuli. Hier zorgen wij voor een stap-voor-stap protocol voor een methode die wordt gebruikt om te beoordelen en kwantificeren van de beschikbare actieve Rho-specifieke GEFs met behulp van een affiniteit neerslag test. Deze test werd een paar jaar geleden ontwikkeld in de Burridge lab 3,4 en we hebben gebruikt in de nier tubulaire cellijnen 5,6,7. De assay maakt gebruik van een "nucleotide vrij" mutant RhoA met een hoge affiniteit voor actieve GEFs. De mutatie (G17a) maakt het eiwit niet in staat om te binden het BBP of GTP en deze staat bootst de tussenliggende staat die is gebonden aan het GEF. Een GST-gelabeld versie van deze mutant eiwit tot expressie en gezuiverd uit E. coli, gebonden aan glutathion sefarosekorrels en gebruikt voor het neerslaan actieve GEFs van lysaten van onbehandelde en gestimuleerde cellen. Aangezien de meeste GEFs worden geactiveerd via posttranslationele modificaties of ontheffing van remmende banden, hun actieve toestandbewaard in cellysaten en kunnen worden gedetecteerd door deze test 8. Gevangen eiwitten kunnen worden gezocht heeft naar bekende GEFs door detectie met specifieke antilichamen met behulp van Western blotting, of geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie voor onbekende GEFs geactiveerd door bepaalde stimuli te identificeren.
De methode die hier gepresenteerd is de enige beschikbare niet-radioactieve activatie test voor GEFs dat de actieve pool van GEFs in cellen kan volgen. De test is vergelijkbaar met de precipitatie assays voor na activering van kleine GTPases en GEFs tegen Rac en Cdc42. Deze verschillende assays GST-gemerkte eiwitten en hebben geringe afwijkingen van de hier beschreven, maar de basisstappen zijn hetzelfde. Zo kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor andere kleine GTPase en GEF activatie assays.
De gepresenteerde GEF-test werd onlangs aangepast voor toepassing voor nucleaire fracties 9,10. Met andere wijzigingen kunnen testen van GEF activatie andere subcellulaire compartimenten ook mogelijk.
We maken gebruik van de gepresenteerde methode om de activering van GEFs in epitheliale cellijnen 5,6,7 te bestuderen. Bij sommige optimalisatie, moet deze test voldoende zijn om GEFs detecteren vanaf een cellijn. Wanneer adapting op een bepaald celtype, de meest optimale aantal cellen lysisbuffer volume en de detectie werkwijze voor het GEF te testen (een goede antilichaam voor Western blotting is belangrijk). Voor de eerste configuratie van de test is het raadzaam het gebruik van een stimulus waarvan bekend is dat het GEF van belang te activeren. Bij gebruik van een onbekende stimulus, gebruik dan altijd een positieve controle te controleren of uw test werkt. Deze test kan worden geactiveerd bekende GEFs detecteren door Western blotting. Het is echter ook voldoende te identificeren onbekende GEFs. Daartoe moeten gevangen GEFs van controle en gestimuleerd monsters worden geanalyseerd op een Coomassie-gekleurde gel. Bands die alleen verschijnen in gestimuleerd monsters kunnen bevatten geactiveerd GEFs en kan worden gestuurd voor identificatie met behulp van massaspectrometrie (bijv. 5).
Tot slot een kritische noot. De test is gebaseerd op de aanname dat de post-translationele modificaties waardoor GEFs actieve bewaard na cellyse. Inderdaad, dit is duidelijk de case een aantal GEFs, en omdat de inrichtingen is deze test gebruikt bij de diverse tot de activering van verschillende GEFs, zoals GEF-H1, p115RhoGEF en XPLN (bijvoorbeeld 5,11,12,13) detecteren. Behoud van de actieve toestand echter kan niet gebeuren bij alle GEFs en daarom is het denkbaar dat deze test niet werken voor alle GEFs. Het heeft ook te worden opgemerkt, dat veel GEFs activiteit uit te oefenen naar meer dan een kleine GTPases. Dus, als een specifieke GEF wordt bestudeerd, is het aan te raden om deze test te vullen met GEF neerslag assays voor andere kleine GTPases, maar ook functionele studies onderzoeken RhoA, Rac1 en Cdc42.
Kritische stappen in het protocol:
Kolonies van getransformeerde bacteriën moeten worden opgehaald van verse, goed voorbereid platen om een adequate selectie door Amp, een goede uitgroei en opbrengst te garanderen. Transformatie voorwaarden voor competente cellen verkregen uit andere bronnen kan variëren en moet worden geraadpleegd. </p>
Alle stappen van de eiwitpreparaat protocol (van stap 2.3) en de assay (van stap 3.2) worden uitgevoerd bij 4 ° C gekoeld met oplossingen centrifuges.
Bacteriële lysis (stap 2.5) moet grondig en volledig om een homogene suspensie te verkrijgen. Wanneer het lyseren van de bacteriën, vortex afwisselend pipetteren het lysaat met behoud het op 4 ° C en zorgen sonicatie gebeurt op ijs voorkomen denaturering van de proteïne. Als u een ander model van ultrasoonapparaat kunnen er voorwaarden moeten worden aangepast. Incubatie van ultrasone trillingen met de kralen moet altijd worden gedaan bij 4 ° C op een rotator om voldoende binding te waarborgen, en zorg moeten worden genomen om de timing consistent.
GST-Rho mutanten zijn enigszins instabiel, uitgedrukt in bacteriën, dus het is het beste om voorbereid kralen te gebruiken direct of binnen een paar dagen.
De neerslag assay (deel 3) is het tijd en temperatuur gevoelig is, eenactieve GEFs gemakkelijk verloren het cellysaat, moet dus stappen worden uitgevoerd zo snel mogelijk.
De volgende sectie bevat enkele het oplossen van problemen tips.
Geen of zeer kleine hoeveelheid mutant Rho eiwit in de uiteindelijke korrel preparaat: Dit kan worden veroorzaakt door inefficiënte inductie onvoldoende lysis van de bacteriën of een verlies van het eiwit tijdens het bereidingsproces of opslag. Om problemen enkele van deze mogelijkheden kunnen monsters bacteriën worden onderzocht voor en na inductie. Als er slechte inductie van het eiwit herhaal het proces met behulp van een kolonie van een vers strepen plaat of van re-getransformeerde competente cellen. Verschillende IPTG concentraties en inductie tijden moeten ook worden getest. Als de lysis onvoldoende is (dat wil zeggen het eiwit blijft in de pellet in plaats van de supernatant) wisselende zout en afwasmiddel concentraties in de lysis buffer kan worden geprobeerd. Alternatieve sonicatie tijden eninstellingen moeten worden onderzocht, en monsters voor en na sonicatie kan worden gecontroleerd door middel van microscopisch om de efficiëntie van lysis te bepalen.
Nr. neergeslagen GEF, terwijl de GST-eiwit aanwezig op de korrels: Dit kan vanwege technische problemen tijdens de precipitatie assay of een echte afwezigheid van activering van de onderzochte GEF met toegepaste stimulus. Gebruik altijd een bekende stimulus als een positieve controle om te controleren of uw test werkt. Gebruik de voorbereide kralen binnen een paar dagen. Als de test neerslag vangt detecteerbare hoeveelheden van de GEF onderzocht onder alle omstandigheden, controleert de GEF aanwezig is en goed detecteerbaar in de supernatant na centrifugeren die worden gebruikt voor de assay (stap 3.3). Zorg ervoor dat alle buffers en proteaseremmers vers zijn, en het uitvoeren van alle stappen op ijs zo snel mogelijk. Verhoog de hoeveelheid van de input-eiwit (bijvoorbeeld door gebruik te maken lysaten van 2 platen / monster). Als het neerslaan assay geeft basale neerslaguitvoering van de GEF, maar geen verschil wordt gezien tussen de controle en gestimuleerd monsters (afb. 4), start het oplossen van problemen door te controleren of de toegepaste prikkel gewerkt met behulp van andere bekende effecten (bijvoorbeeld door het detecteren van activatie van andere signaalwegen). Denk aan het veranderen van de behandeling voorwaarden en / of concentraties. Vertrouw op gegevens uit de literatuur rapportage hoe uw prikkel Rho of andere signalen activeert om te voorspellen waarschijnlijk tijden en concentraties. Bij het optimaliseren van de behandeling de tijd, gebruik maken van zowel korte als lange tijd punten, zoals GEF activering kan het best waarneembaar zijn op een tijdstip voorafgaand aan goed waarneembaar Rho activering. Tenslotte kan dezelfde stimulus tot een variabele mate van geactiveerd door een verandering in cel reactiviteit door passage nummer cel confluentie, etc.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Instituut voor Gezondheidsonderzoek (CIHR) (MOP-97774) en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC, subsidie nr: 480619). KS is een ontvanger van een KRESCENT New Investigator Award (een gezamenlijke gunning van de Nierstichting van Canada, de Canadese Nefrologie Society en Canadese Institute of Health Research) en een vroege Onderzoeker Award van de Ontario ministerie van Onderzoek en Innovatie. FW wordt ondersteund door een Li Ka Shing beurs.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.