La méthode présentée ici décrit un dosage de suivre l'activation de RhoA facteurs spécifiques de change GDP / GTP (GEF) dans les cellules cultivées en faisant usage d'une protéine mutante RhoA fusion GST qui a une forte affinité pour GEFs activés. GEF sont précipités à partir de lysats cellulaires, détectées par Western blot et quantifiée par densitométrie.
Les protéines de la famille Rho des petites GTPases sont des régulateurs centraux du cytosquelette, et de contrôler une grande variété de processus cellulaires, y compris la migration des cellules, l'expression des gènes, la progression du cycle cellulaire et 1 d'adhésion cellulaire. Protéines Rho sont des commutateurs moléculaires qui sont actives dans GTP et inactive dans le PIB lié Etat. Leur activation est médiée par une famille de guanine-nucleotide facteur d'échange (FEM) des protéines. Rho-GEF constituent une grande famille, avec des chevauchements spécificités 2. Bien que beaucoup de progrès ont été accomplis dans l'identification des GEFs activés par des signaux spécifiques, il existe encore de nombreuses questions subsistent sur la voie de la réglementation spécifique de ces protéines. Le nombre de Rho-GEF dépasse 70, et chaque cellule exprime plus d'une protéine du FEM. En outre, bon nombre de ces protéines Rho activer non seulement, mais d'autres membres de la famille, contribuant à la suite de la complexité des réseaux de régulation. Surtout, l'explorationcomment GEFs sont réglementées nécessite une méthode à suivre la piscine active de GEFs individuelles dans les cellules activées par des stimuli différents. Ici, nous fournir un protocole étape par étape pour une méthode utilisée pour évaluer et quantifier les actifs disponibles Rho-GEF spécifiques en utilisant un essai de précipitation par affinité. Ce test a été développé il ya quelques années dans le laboratoire Burridge 3,4 et nous l'avons utilisé dans les lignes de cellules rénales de tubulaires 5,6,7. Le test prend avantage d'un "nucléotide libre" mutant RhoA, avec une forte affinité pour les GEF actifs. La mutation (G17A) rend la protéine incapable de se lier PIB ou le GTP et cet état imite l'état intermédiaire qui est lié à la FEM. Une version TPS-étiqueté de cette protéine mutante est exprimée et purifiée à partir de E. coli, liés à des billes de sépharose glutathion et utilisé pour précipiter GEFs actifs à partir de lysats de cellules non traitées et stimulé. Comme la plupart des GEF sont activés via des modifications post-traductionnelles ou de la libération des liaisons inhibitrices, leur état actifest conservé dans les lysats cellulaires, et ils peuvent être détectés par ce test 8. Protéines capturées peuvent être sondé pour GEFs connus par la détection d'anticorps spécifiques à l'aide Western blot, ou analysés par spectrométrie de masse pour identifier GEFs inconnus activés par certains stimuli.
La méthode présentée ici est le dosage de l'activation uniquement disponible pour les non-radioactifs GEFs qui peuvent suivre la piscine active de GEF dans les cellules. Le test est similaire à des tests de précipitation utilisés pour l'activation suivante de petites GTPases ainsi que GEFs contre Rac et Cdc42. Ces tests utilisent différents TPS-protéines marquées et avoir de légères différences de celle décrite ici, mais les étapes de base sont les mêmes. Ainsi, ce protocole peut être facilement adapté pour d'autres petite GTPase et des dosages d'activation du FEM.
Le test présenté FEM a été récemment modifié pour l'application pour les fractions nucléaires 9,10. Avec d'autres modifications, les tests d'activation du FEM dans les autres compartiments subcellulaires pourrait également être possible.
Nous utilisons la méthode présentée pour étudier l'activation de GEF dans les lignées cellulaires épithéliales 5,6,7. Avec un peu d'optimisation, ce test devrait être suffisante pour détecter GEFs de toute lignée cellulaire. Lorsque adapting à un type cellulaire spécifique, trouver le numéro de cellulaire optimale, le volume de tampon de lyse, et la méthode de détection pour le FEM à être testé (un anticorps bon pour Western blot est important). Pour la configuration initiale de l'essai, il est conseillé d'utiliser un stimulus qui est connu pour activer le FEM d'intérêt. Lorsque vous utilisez un stimulus inconnu, toujours utiliser un contrôle positif afin de vérifier que votre dosage est de travailler. Ce test peut être utilisé pour détecter l'activation de la GEF connues par Western blot. Cependant, il est également adéquate pour identifier GEFs inconnus. Pour cela, GEFs capturés de contrôle et des échantillons stimulés doivent être analysés sur un gel teinté au bleu de Coomassie. Les bandes qui apparaissent uniquement dans des échantillons stimulés pourrait contenir GEFs activées et peuvent être envoyées à l'identification par spectrométrie de masse (par exemple 5).
Enfin, une note d'avertissement. Le test est basé sur l'hypothèse que les modifications post-traductionnelles rendant GEFs actifs sont conservés après lyse cellulaire. En effet, c'est clairement le casoi pour un certain nombre de GEF, et depuis ses établissements, ce test a été utilisé par divers groupes pour détecter l'activation des différents GEFs, notamment le FEM-H1, p115RhoGEF et XPLN (par exemple 5,11,12,13). Préservation de l'état actif mais pourrait ne pas arriver dans le cas de tous les GEF, et par conséquent il est concevable que ce test ne fonctionne pas pour tous les GEF. Il doit également être noté que de nombreux GEFs exercer une activité vers plus d'un petites GTPases. Ainsi, quand un particulier FEM est étudié, il est recommandé de compléter ce test avec les tests de précipitation du FEM pour les autres petites GTPases, ainsi que des études fonctionnelles examen RhoA, Rac1 et Cdc42.
Les étapes critiques dans le protocole:
Les colonies de bactéries transformées doivent être ramassés à partir de plaques de frais, bien préparés pour assurer une sélection adéquate par Amp, l'excroissance et de rendement. Conditions de transformation des cellules compétentes obtenus à partir d'autres sources peut varier et doit être consulté. </p>
Toutes les étapes du protocole de préparation de protéines (de l'étape 2.3) et le dosage (à partir de l'étape 3.2) doit être effectuée à 4 ° C avec des solutions refroidies et les centrifugeuses.
Lyse bactérienne (étape 2.5) devrait être approfondie et complète afin d'obtenir une suspension homogène. Lorsque la lyse de la bactérie, de tourbillon, et pipeter le lysat alternativement, tout en le maintenant à 4 ° C et à assurer la sonication est effectuée sur de la glace pour empêcher la dénaturation de la protéine. Si vous utilisez un modèle différent de sonicateur, les conditions peuvent avoir besoin d'être ajustée. L'incubation de sonicat avec les perles devrait toujours être faite à 4 ° C sur un agitateur pour assurer une liaison suffisante, et les soins devraient être prises pour maintenir le calendrier cohérent.
TPS-Rho mutants sont quelque peu instables lorsqu'elles sont exprimées dans des bactéries, il est donc préférable d'utiliser des billes préparées tout de suite ou dans quelques jours.
Le test de précipitation (Partie 3) est le temps et sensible de température, uns GEFs actifs peuvent facilement être perdus à partir du lysat cellulaire, de sorte que des mesures devraient être effectuées aussi rapidement que possible.
La section suivante contient quelques conseils de dépannage.
Pas ou très faible quantité de protéines Rho mutant dans la préparation finale perle: Cela peut être causé par induction inefficace, lyse insuffisante des bactéries, ou une perte de la protéine au cours du processus de préparation ou de stockage. Pour vous aider à résoudre certaines de ces possibilités, des échantillons de bactéries peuvent être analysés avant et après l'induction. Si il ya induction pauvres de la protéine répéter le processus à l'aide d'une colonie d'une plaque fraîchement striée ou de re-transformé des cellules compétentes. Concentrations différentes IPTG et temps d'induction devraient également être testés. Si la lyse est insuffisante (c.-à-la protéine reste dans le culot au lieu de le surnageant) des concentrations variables de sel et de détergent dans le tampon de lyse peut être essayé. Autres temps de sonication etparamètres doivent être pris en considération, et les échantillons avant et après sonication peut être vérifiée par microscopie afin de déterminer l'efficacité de la lyse.
Aucun précipité du FEM, même si la TPS-protéine est présente sur les perles: Cela peut être dû à des problèmes techniques pendant le test de précipitation, ou par une absence réelle de l'activation de l'étude du FEM en utilisant le stimulus appliqué. Toujours utiliser un stimulus connu comme un contrôle positif pour vérifier que votre test fonctionne. Utilisez les perles préparées en quelques jours. Si l'essai de précipitation capture des quantités indétectables de la FEM étudiés dans toutes les conditions, vérifier que votre FEM est présent et il est bien détectable dans le surnageant après centrifugation qui doit être utilisé pour le dosage (étape 3.3). Assurez-vous que tous les tampons et les inhibiteurs de protéase sont fraîches, et effectuer toutes les étapes sur la glace aussi vite que possible. Augmenter la quantité de protéines d'entrée (par exemple en utilisant des lysats de 2 plaques / échantillon). Si l'essai de précipitation montre basale précipitationstion de votre FEM, mais aucune différence n'est observée entre le contrôle et les échantillons stimulés (figure 4), commencer le dépannage en vérifiant que le stimulus appliqué travaillé à l'aide d'autres effets connus (par exemple en détectant l'activation d'autres voies de signalisation). Pensez à changer les conditions de traitement et / ou concentrations. S'appuyer sur les données de la déclaration la littérature comment votre relance activent Rho ou de signalisation autres prédire le temps et les concentrations susceptibles. Lors de l'optimisation du temps de traitement, utiliser les deux points dans le temps court et long terme, que l'activation du FEM pourrait être la meilleure détectable à un moment avant l'activation de Rho ainsi détectable. Enfin, le même stimulus pourrait se traduire par un degré variable d'activation due à un changement dans la sensibilité des cellules causés par le nombre de passages, de cellules de confluence, etc
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par l'Institut canadien de recherche en santé (IRSC) (RdP-97 774) et en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG, subvention n °: 480619). KS est un bénéficiaire d'une bourse de nouveau chercheur KRESCENT (un prix conjoint de la Fondation canadienne du rein, du Canada Société de néphrologie et l'Institut canadien de recherche en santé) et une bourse de nouveau chercheur du ministère ontarien de la recherche et l'innovation. FW est soutenu par une bourse Li Ka Shing.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.