Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt ein Assay zur spezifischen Aktivierung von RhoA GDP / GTP (GEFs) in kultivierten Zellen unter Verwendung eines mutierten RhoA GST-Fusionsprotein, das eine hohe Affinität für aktiviert GEFs hat folgen. GEFs aus Zelllysaten durch Western-Blotting und quantifiziert durch Densitometrie erkannt ausgefällt.
Die Proteine der Rho-Familie kleiner GTPasen sind zentrale Regulatoren des Zytoskeletts und steuern eine Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Zellwanderung, Genexpression, Zellzyklus-Progression und Zell-Adhäsion ein. Rho-Proteine sind molekulare Schalter, die aktiv sind in GTP-gebundenen und inaktiv im GDP-gebundenen Zustand. Ihre Aktivierung wird von einer Familie der Guanin-Nukleotid-Austausch-Faktor (GEF) vermittelt wird. Rho-GEFs bilden eine große Familie, mit überlappenden Spezifitäten 2. Obwohl viele Fortschritte bei der Identifizierung der GEFs durch bestimmte Signale aktiviert worden sind, gibt es noch viele Fragen in Bezug auf die restlichen Weg-spezifische Regulation dieser Proteine. Die Anzahl der Rho-GEFs über 70, und jede Zelle exprimiert mehrere GEF Protein. Zudem aktivieren viele dieser Proteine nicht nur Rho, aber andere Mitglieder der Familie und trägt zu der Komplexität der regulatorischen Netzwerke. Wichtig ist, erkundenwie GEFs geregelt erfordert eine Methode, um den aktiven Pool von einzelnen GEFs in Zellen durch verschiedene Stimuli aktiviert folgen. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für eine Methode verwendet, um zu bewerten und zu quantifizieren, die zur Verfügung stehenden aktive Rho-spezifischen GEFs mit einer Affinität Präzipitationsassay. Dieser Test wurde vor ein paar Jahren im Labor Burridge 3,4 entwickelt und wir haben es in der Niere röhrenförmigen Zelllinien 5,6,7 verwendet. Der Assay nutzt ein "Nukleotid frei" Mutante RhoA, mit einer hohen Affinität für aktive GEFs. Die Mutation (G17A) macht das Protein zu binden, nicht in der Lage GDP oder GTP und dieser Zustand ahmt den Zwischenzustand, die mit dem GEF gebunden ist. Ein GST-getaggte Version dieses mutierte Protein wird exprimiert und gereinigt aus E. coli, gebunden an Glutathion-Sepharose-Kügelchen und zur Fällung von aktiven GEFs aus Lysaten von unbehandelten und stimulierten Zellen. Da die meisten GEFs werden über posttranslationale Modifikationen oder Entlassung aus hemmenden Bindungen, ihren aktiven Zustand aktiviertwird in Zelllysaten erhalten, und sie können durch diesen Test 8 erkannt werden. Gefangen Proteine können für bekannte GEFs sondiert werden durch Detektion mit spezifischen Antikörpern unter Verwendung von Western-Blotting oder durch Massenspektrometrie analysiert, um unbekannte GEFs durch bestimmte Stimuli aktiviert zu identifizieren.
Die hier vorgestellte Methode ist die einzige verfügbare nicht-radioaktive Aktivierungs-Assay für GEFs, die den aktiven Pool von GEFs in Zellen folgen können. Der Test ist ähnlich wie die Ausfällung Assays für folgende Aktivierung der kleinen GTPasen sowie GEFs gegen Rac und Cdc42 verwendet. Diese Assays verwenden verschiedenen GST-markierte Proteine und leichte Unterschiede bei den hier beschriebenen, aber die grundlegenden Schritte sind die gleichen. Somit ist dieses Protokoll leicht für andere GTPase und GEF Aktivierungsassays angepasst werden.
Das vorgestellte GEF-Assay wurde kürzlich für den Antrag auf Kernfraktionen 9,10 geändert. Mit weiteren Modifikationen könnte Testen von GEF Aktivierung in anderen subzellulären Kompartimenten auch möglich.
Wir verwenden die Methode vorgestellt, um die Aktivierung von GEFs in epithelialen Zelllinien 5,6,7 studieren. Mit ein wenig Optimierung, sollte dieser Test ausreichend sein, um von einem beliebigen GEFs Zelllinie zu erkennen. Wenn adapting zu einem bestimmten Zelltyp, finden Sie die optimale Zellzahl, Volumen Lysepuffer und Nachweisverfahren für das GEF zu prüfen (eine gute Antikörper für Western-Blot ist wichtig). Bei der Ersteinrichtung des Assays ist es ratsam, einen Reiz, der bekanntlich die GEF von Interesse zu aktivieren verwenden. Bei Verwendung eines unbekannten Reiz, immer mit einem Positiv-Kontrolle zu überprüfen, ob Ihr Test funktioniert. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Aktivierung von bekannten GEFs durch Western-Blotting nachzuweisen. Es ist jedoch auch geeignet, um unbekannte GEFs identifizieren. Zu diesem Zweck sollte festgehalten GEFs von Kontrolle und stimulierten Proben auf einem mit Coomassie-gefärbten Gel analysiert werden. Bands, die nur in stimulierten Proben erscheinen, enthalten möglicherweise aktiviert GEFs und können für die Identifizierung durch Massenspektrometrie (zB 5) gesendet werden.
Schließlich wird ein Warnhinweis. Der Assay basiert auf der Annahme, dass die posttranslationale Modifikationen machen GEFs aktiv nach Zelllyse bleiben erhalten basiert. Tatsächlich ist dies eindeutig der ca.sich für eine Reihe von GEFs, und da die Betriebe, hat dieser Assay von verschiedenen Gruppen verwendet worden, um die Aktivierung unterschiedlicher GEFs, einschließlich GEF-H1, p115RhoGEF und XPLN (zB 5,11,12,13) zu erfassen. Die Erhaltung des aktiven Zustand jedoch möglicherweise nicht bei allen GEFs passieren, und daher ist es denkbar, dass dieser Test nicht für alle GEFs arbeiten. Es muss auch angemerkt werden, dass viele GEFs Aktivität auszuüben zu mehr als einem kleinen GTPasen. Wenn also eine spezifische GEF studiert wird, wird empfohlen, diesen Test mit GEF Niederschlag Assays für andere kleine GTPasen, sowie funktionelle Studien, RhoA, Rac1 und Cdc42 zu ergänzen.
Kritische Schritte in dem Protokoll:
Kolonien von transformierten Bakterien sollte aus frischen, gut vorbereitet Platten abgeholt werden, um eine angemessene Auswahl von Amp, gute Auswuchs und Ertrag zu gewährleisten. Voraussetzungen für die Transformation kompetenter Zellen von anderen Herstellern stammen können variieren und sollte konsultiert werden. </p>
Alle Schritte des Proteins Herstellung Protokoll (aus Schritt 2.3) und der Assay (aus Schritt 3.2) bei 4 ° C mit kalten Lösungen und Zentrifugen durchgeführt werden.
Bakterienlyse (Schritt 2.5) sollte gründlich und vollständig, um eine homogene Suspension zu erhalten. Wenn Lysieren der Bakterien, Wirbel und das Lysat pipettieren abwechselnd unter Halten desselben bei 4 ° C und sicherzustellen, Ultraschallbehandlung auf Eis zu verhindern Denaturierung des Proteins erfolgt. Wenn Sie ein anderes Modell des Ultraschallgeräts kann Bedingungen angepasst werden müssen. Die Inkubation von Sonifikat mit den Kügelchen sollten immer bei 4 ° C auf einem Rotator getan werden, um eine ausreichende Bindung zu gewährleisten, und darauf zu halten das Timing in Einklang gebracht werden.
GST-Rho-Mutanten sind etwas instabil, wenn sie in Bakterien exprimiert, so ist es am besten vorbereiteten Perlen sofort oder innerhalb weniger Tage zu verwenden.
Die Präzipitationsassay (Teil 3) ist an der Zeit und Temperatur empfindlich, einAktive GEFs leicht aus dem Zelllysat verloren, sollte so Schritte so schnell wie möglich durchgeführt werden.
Der folgende Abschnitt enthält einige Hinweise zur Fehlersuche.
Keine oder nur sehr geringe Menge des mutierten Proteins Rho in der endgültigen Herstellung Wulst: Dies kann durch eine ineffiziente Induktion, unzureichend Lyse der Bakterien, oder ein Verlust des Proteins während des Herstellungsverfahrens oder Lagerung verursacht werden. Zur Behebung einiger dieser Möglichkeiten können Proben von Bakterien vor und nach der Induktion analysiert werden. Wenn es schlechte Induktion des Proteins wiederholen Sie den Vorgang mit einer Kolonie von einer frisch ausgestrichenen Platte oder aus Re-transformierte kompetente Zellen. Verschiedene IPTG-Konzentrationen und Induktionszeiten sollte auch getestet werden. Wenn die Lyse unzureichend ist (dh das Protein bleibt in der Pellet anstelle der Überstand) Variieren Salz und Detergenzkonzentrationen im Lysepuffer versucht werden. Alternate Beschallung Zeiten undEinstellungen sollten berücksichtigt werden, und die Proben vor und nach der Beschallung kann mittels Mikroskopie überprüft werden, um die Effizienz der Lyse zu bestimmen.
Nr. ausgefällt GEF, obwohl das GST-Protein, das auf den Kügelchen ist: Dies kann aufgrund von technischen Problemen während der Fällung Assay oder durch eine reale Abwesenheit der Aktivierung des untersuchten GEF mit dem Stimulus. Verwenden Sie immer ein Stimulus bekannt als Positiv-Kontrolle zu überprüfen, ob Ihr Test funktioniert. Verwenden Sie die vorbereiteten Perlen innerhalb von wenigen Tagen. Wenn der Niederschlag Assay erfasst nicht nachweisbare Mengen des GEF unter allen Bedingungen untersucht, ob Ihr GEF vorhanden ist, und ist gut erkennbar in der Überstand nach Zentrifugation, die für den Test (Schritt 3.3) verwendet werden soll. Achten Sie darauf, alle Puffer und Protease-Inhibitoren sind frisch, und alle Schritte auf dem Eis so schnell wie möglich. Erhöhen Sie die Menge an Protein-Eingang (zB durch Verwendung von Lysaten von 2 Platten / Probe). Wenn der Niederschlag Assay zeigt basalen Niederschlägenzung Ihrer GEF, aber keinen Unterschied zwischen der Kontrolle und stimulierten Proben (Abb. 4) zu sehen, starten Fehlersuche durch die Überprüfung, dass die eingesetzten Stimulus mit anderen bekannten Effekte (z. B. durch den Nachweis Aktivierung anderer Signalwege) gearbeitet. Erwägung ziehen, den Behandlungsbedingungen und / oder Konzentrationen. Verlassen Sie sich auf Daten aus der Literatur, wie Ihre Berichterstattung Stimulus Rho oder andere Signalisierung aktiviert, um wahrscheinlich Zeiten und Konzentrationen vorherzusagen. Bei der Optimierung der Behandlungszeit, verwenden sowohl kurze und lange Zeit Punkte, wie GEF Aktivierung wahrscheinlich das Beste, nachweisbar zu einem Zeitpunkt vor gut nachweisbar Rho-Aktivierung. Schließlich könnte der gleiche Reiz in einem variablen Grad der Aktivierung aufgrund einer Änderung in Zelle Reaktionsfähigkeit durch den Durchgang Nummer verursacht, Zellkonfluenz, etc. führen
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom kanadischen Institut für Gesundheitsforschung (CIHR) (MOP-97774) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada (: 480619 NSERC, Zuschuss nr) finanziert. KS ist ein Empfänger einer KRESCENT New Investigator Award (ein Joint Verleihung des Kidney Foundation von Kanada, kanadische Gesellschaft Nephrologie und kanadischen Institute of Health Research) und einer frühen Researcher Award von der Ontario Ministerium für Forschung und Innovation. FW wird von einem Li Ka Shing Stipendium unterstützt.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.