O método aqui apresentado descreve um ensaio para seguir a activação de factores específicos RhoA GDP / GTP Câmbio (GEFs) em células de cultura, fazendo uso de uma proteína de fusão GST mutante RhoA que tem elevada afinidade para GEFs activados. GEFs são precipitados a partir de lisados celulares, detectadas por Western blotting e quantificada por densitometria.
As proteínas da família Rho de GTPases pequenas são reguladores centrais do citoesqueleto, e controlar uma grande variedade de processos celulares, incluindo a migração de células, a expressão do gene, a progressão do ciclo celular e adesão celular 1. Proteínas Rho são interruptores moleculares que estão ativos no GTP-bound e inativos do PIB-bound estado. A sua activação é mediada por uma família de guanina-nucleotídicas de Câmbio Fator (GEF) proteínas. Rho-GEFs constituem uma grande família, com sobreposição de especificidades 2. Embora muito progresso tem sido feito na identificação dos GEFs ativados por sinais específicos, existem ainda muitas questões pendentes relativas ao regulação da via específica dessas proteínas. O número de Rho-GEFs excede 70, e cada célula expressa mais do que uma proteína GEF. Além disso, muitas destas proteínas activar não só Rho, mas outros membros da família, contribuindo ainda mais a complexidade das redes de regulação. Importante, explorandocomo GEFs são regulados requer um método de seguir a piscina activa de GEFs individuais em células activadas por estímulos diferentes. Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo para um método utilizado para avaliar e quantificar as disponíveis activas Rho-específicos GEFs usando um ensaio de precipitação de afinidade. Este ensaio foi desenvolvido há alguns anos no laboratório Burridge 3,4 e nós tê-lo usado em linhas de células renais tubulares 5,6,7. O ensaio de tira proveito de um "nucleótido livre" mutante RhoA, com uma elevada afinidade para GEFs activas. A mutação (G17A) torna a proteína incapaz de se ligar PIB ou GTP e este estado imita o estado intermediário que é ligado ao GEF. Uma versão GST-etiquetados desta proteína mutante é expressa e purificada a partir de E. coli, ligada a esferas de glutationa Sepharose e usado para precipitar GEFs activas a partir de lisados de células não tratadas e estimulada. Como a maioria dos GEFs são ativados através de modificações pós-tradução ou versão de ligações inibitórias, seu estado ativoé preservada em lisados de células, e eles podem ser detectadas por este ensaio 8. Proteínas capturados podem ser sondado para GEFs conhecidos pela detecção de anticorpos específicos utilizando Western blot, ou analisados por espectrometria de massa para identificar GEFs desconhecidos ativados por estímulos certos.
O método aqui apresentado é o ensaio de ativação só está disponível para não-radioativo GEFs que pode seguir a piscina activa de GEFs nas células. O ensaio é semelhante para os ensaios de precipitação utilizados para a activação seguinte de GTPases pequenas, bem como contra GEFs Rac e Cdc42. Esses ensaios de usar diferentes proteínas GST-etiquetados e têm ligeiras diferenças de a descrita aqui, no entanto os passos básicos são os mesmos. Assim, este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros GTPase pequeno e ensaios de activação do GEF.
O ensaio apresentado GEF foi recentemente modificado para pedido de frações nucleares 9,10. Com alterações posteriores, os testes de ativação GEF em outros compartimentos celulares também poderia ser possível.
Nós utilizamos o método apresentado para estudar a activação de GEFs em linhas de células epiteliais 5,6,7. Com algum optimização, neste ensaio devem ser adequados para detectar GEFs a partir de qualquer linha de células. Quando adapting a um tipo específico de célula, localizar o número de células óptima, o volume de tampão de lise, e método de detecção para o GEF a ser testado (um anticorpo bom para Western blotting é importante). Para a configuração inicial do ensaio, é aconselhável utilizar um estímulo que é conhecido para activar o GEF de interesse. Ao usar um estímulo desconhecido, sempre usar um controle positivo para verificar se o ensaio está funcionando. Este ensaio pode ser usado para detectar a activação de GEFs conhecidos por Western blotting. No entanto, também é adequado para identificar GEFs desconhecidos. Para isso, GEFs capturados de controlo e as amostras estimuladas devem ser analisados num gel de Coomassie-coradas. Bandas que aparecem apenas em amostras estimuladas pode conter GEFs ativados e podem ser enviados para identificação por espectrometria de massa (por exemplo, 5).
Finalmente, uma nota de advertência. O ensaio é baseado na suposição de que as modificações pós-tradução que tornam GEFs activas são preservadas após lise celular. Na verdade, este é claramente o caSE para um número de GEFs, e desde que os seus estabelecimentos, este ensaio foi utilizada por vários grupos para detectar a activação de GEFs diferentes, incluindo GEF-H1, p115RhoGEF e XPLN (por exemplo, 5,11,12,13). Preservação do estado ativo, contudo, não pode acontecer no caso de todos os GEFs e, portanto, é concebível que este teste não vai funcionar para todos os GEFs. Tem também a ser observado, que muitos GEFs exercer atividade para mais de um GTPases pequenas. Assim, quando um GEF específica é estudada, é recomendado para complementar este ensaio com os ensaios de precipitação GEF para outros GTPases pequenas, bem como estudos funcionais examinando RhoA, Rac1 e Cdc42.
Etapas críticas do protocolo:
Colônias de bactérias transformadas devem ser colhidos a partir frescas, pratos preparados adequadamente para garantir a adequada seleção de Amp, crescimento bom e produção. Condições de transformação de células competentes obtidos de outras fontes pode variar e deve ser consultado. </p>
Todos os passos do protocolo de preparação de proteína (a partir do passo 2.3) eo ensaio (a partir do passo 3.2) deve ser realizado a 4 ° C com soluções arrefecidas e centrífugas.
A lise bacteriana (passo 2,5) deve ser minuciosa e completa, a fim de obter uma suspensão homogénea. Quando a lise bactérias vórtice, e pipetar o lisado alternadamente, mantendo ao mesmo tempo que a 4 ° C e assegurar sonicação é feito em gelo para evitar a desnaturação da proteína. Se estiver usando um modelo diferente de sonicador, as condições podem ter de ser ajustada. A incubação de sonicado com as esferas devem sempre ser feito a 4 ° C num rotor de ligação para assegurar suficiente, e deve ser tomado cuidado para manter a temporização consistente.
GST-Rho mutantes são um pouco instável quando expresso em bactérias, por isso o melhor é usar contas preparadas imediatamente ou dentro de poucos dias.
O ensaio de precipitação (Parte 3) é o tempo e sensível a temperatura, umaGEFs s activas podem ser facilmente perdido a partir do lisado celular, de modo que os passos deve ser realizado tão rapidamente quanto possível.
A seção seguinte contém algumas dicas de resolução de problemas.
Não ou quantidade muito baixa de proteína mutante Rho na preparação final do grânulo: Isto pode ser causado por indução ineficiente, a lise das bactérias insuficiente, ou uma perda da proteína durante o processo de preparação ou de armazenamento. Para ajudar a resolver algumas dessas possibilidades, as amostras de bactérias podem ser analisada antes e após a indução. Se houver indução pobre da proteína repetir o processo usando uma colónia de uma placa de recém-listradas ou a partir de re-transformadas células competentes. As concentrações IPTG diferentes e tempos de indução também devem ser testados. Se a lise é insuficiente (isto é, a proteína permanece no pelete em vez do sobrenadante) variando de sal e de detergente concentrações no tampão de lise pode ser tentado. Alternados vezes sonicação econfigurações devem ser considerados, e as amostras antes e depois de sonicação pode ser verificada por microscopia para determinar a eficiência de lise.
N precipitado GEF, mesmo que a proteína GST-, está presente nas pérolas: Isto pode ser devido a problemas técnicos durante o ensaio de precipitação, ou por uma ausência real de activação do GEF estudada utilizando o estímulo aplicado. Usar sempre um estímulo conhecido como um controlo positivo para verificar que o seu ensaio funciona. Use as esferas preparadas dentro de poucos dias. Se o ensaio de precipitação captura quantidades indetectáveis de o GEF estudados em todas as condições, verificar que o seu GEF está presente e é bem detectável no sobrenadante após a centrifugação que está a ser utilizado para o ensaio (passo 3.3). Certifique-se de todos os tampões e os inibidores da protease são frescos, e realizar todos os passos sobre o gelo o mais rápido possível. Aumentar a quantidade de proteína de entrada (por exemplo, utilizando lisados a partir de 2 placas / amostra). Se o ensaio de precipitação mostra precipitação basalção do seu GEF, mas nenhuma diferença é observada entre o controle e amostras estimuladas (fig. 4), começar a solucionar por meio da verificação de que o estímulo aplicado funcionou usando outros efeitos conhecidos (por exemplo, detectar a ativação de outras vias de sinalização). Considere alterar as condições de tratamento e / ou concentrações. Conte com os dados do relatório da literatura como o seu estímulo ativa Rho ou sinalização outras vezes para prever prováveis e concentrações. Quando optimizar o tempo de tratamento, utilizar ambos os pontos de tempo curto e longo, tal como a activação GEF pode ser melhor detectável a um ponto de tempo antes da activação bem detectável Rho. Finalmente, o mesmo estímulo pode resultar em um grau variável de activação devido a uma mudança na capacidade de resposta de células causada por número de passagens, a célula de confluência, etc
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Canadian Institute for Health Research (CIHR) (MOP-97774) e Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada (NSERC, concessão nr: 480619). KS é um receptor de um Investigator Award KRESCENT Novo (um prêmio de conjunto da Kidney Foundation of Canada, Canadian Society Nephrology e Canadian Institute of Health Research) e um Prêmio Pesquisador precoce do Ministério de Ontário de Investigação e Inovação. FW é suportado por uma bolsa de Li Ka Shing.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.