Метод, представленные здесь описывается анализ следовать активации RhoA конкретных ВВП / GTP Факторы биржи (GEFs) в культуре клеток путем использования мутантов RhoA стоимость гибридного белка, который имеет высокое сродство к активированный GEFs. GEFs осаждаются из клеточных лизатов, обнаруженные западными блоттинга и количественно денситометрии.
Белки семейства Rho малого GTPases являются центральными регуляторами цитоскелета, и контролировать большое количество разнообразных клеточных процессов, в том числе миграции клеток, экспрессия генов, прогрессию клеточного цикла и клеточной адгезии 1. Ро белки молекулярных переключателей, которые принимают активное участие в GTP-связанными и неактивны в ВВП связанном состоянии. Их активация опосредуется семьи Гуанин нуклеотидов бирже фактор (ГЭФ) белков. Ро-GEFs составляют большую семью, с перекрытием особенности 2. Несмотря на значительный прогресс был достигнут в выявлении GEFs активируются определенные сигналы, есть еще много вопросов, остающихся в отношении конкретных путей регулирования этих белков. Число Ро-GEFs превышает 70, и каждая клетка выражает более одного ГЭФ белка. Кроме того, многие из этих белков не только активировать Rho, но и других членов семьи, что способствует дальнейшему сложности регуляторных сетей. Важно отметить, что исследованиеКак GEFs регулируются требует метод следовать активного пула отдельных GEFs в клетках активируются различные стимулы. Здесь мы предлагаем шаг за шагом протокола метод, используемый для определения и количественной оценки имеющихся активных Rho конкретных GEFs с использованием анализа близости осадков. Этот тест был разработан несколько лет назад в лаборатории Burridge 3,4, и мы использовали его в почках трубчатых клеточных линиях 5,6,7. Анализ использует "нуклеотидных бесплатно" мутант RhoA, с высоким сродством к активной GEFs. Мутация (G17A) оказывает белок не в состоянии связать ВВП или ГТФ, и это состояние имитирует промежуточное состояние, связанное с ГЭФ. GST с тегами версии этого мутантного белка выражается и очищается от E. палочки, связанных с глутатион сефарозе бисером и использовали для осаждения активного GEFs из лизатов необработанных и стимулированных клеток. Как и большинство GEFs активируется через посттрансляционной модификации или освобождения от тормозных креплений, их активное состояниесохраняется в клеточных лизатов, и они могут быть обнаружены с помощью этого анализа 8. Захваченные белки могут быть проверены на наличие известных GEFs путем выявления специфических антител с использованием западных промокательной или проанализированы масс-спектрометрии для идентификации неизвестных GEFs активируются определенные стимулы.
Метод, представленные здесь, только нерадиоактивных активации тест для GEFs, которые могут следовать активного пула GEFs в клетках. Анализ похож на осадки анализов для следующей активации малых ГТФаз а также GEFs против Rac и Cdc42. Эти тесты используются различные GST-меченных белков и имеют незначительные отличия от описанной здесь, однако основные шаги, то же самое. Таким образом, этот протокол можно легко адаптировать для других малых ГТФ и анализы ГЭФ активации.
Представленный анализ ГЭФ был недавно модифицирован для приложений для ядерной фракции 9,10. С последующими изменениями, тестирование ГЭФ активации в других субклеточных отделения также может быть возможным.
Мы используем представлен метод для изучения активации GEFs в эпителиальных клеточных линий 5,6,7. С некоторой оптимизации этого анализа должны быть достаточными для обнаружения GEFs любой клеточной линии. Когда adaptiнг к определенному типу клетки, найти оптимальное количество клеток, объем лизис буфера, а метод обнаружения для ГЭФ для тестирования (хороший антител для западных промокательной важно). Для первоначальной настройки анализа целесообразно использовать стимул, который, как известно, активировать ГЭФ интерес. При использовании неизвестные стимулы, всегда использовать положительный контроль чтобы убедиться, что тест работает. Этот анализ может быть использован для обнаружения активации известно GEFs западными блоттинга. Тем не менее, это также адекватный для выявления неизвестных GEFs. Для этого, захваченные GEFs от управления и стимулировать пробы должны быть проанализированы на Кумасси окрашенного геля. Группы, которые появляются только при вынужденном образцы могут содержать активированный GEFs и могут быть отправлены для идентификации масс-спектрометрии (например, 5).
Наконец, предупреждение. Анализ основан на предположении, что посттрансляционной модификации оказание GEFs активных сохраняются после лизиса клеток. В самом деле, это, несомненно, является приблизительносебе в течение нескольких GEFs, и с момента его учреждения, этого анализа были использованы различные группы для выявления активации различных GEFs, в том числе ГЭФ-H1, p115RhoGEF и XPLN (например, 5,11,12,13). Сохранение в активное состояние, однако, не может произойти в случае всех GEFs и, следовательно, можно предположить, что этот анализ не будет работать для всех GEFs. Следует также отметить, что многие GEFs оказывать активность по отношению к более чем одной маленькой GTPases. Таким образом, когда конкретные ГЭФ изучается, рекомендуется дополнить этот анализ с ГЭФ осадков анализов для других малых ГТФаз, а также функциональных исследований по изучению RhoA, Rac1 и Cdc42.
Критические шаги в протоколе:
Колонии бактерий превращаются должны быть получены из свежего, должным образом подготовленные пластины для обеспечения адекватной выбор усилителей, хороший результат и выход. Преобразование условий для компетентных клеток, полученных из других источников, могут различаться и должны быть проведены консультации. </p>
Все шаги протокола белкового препарата (с шагом 2.3) и анализа (с шагом 3.2) следует проводить при температуре 4 ° C с охлаждением решений и центрифуг.
Бактериальные лизис (шаг 2.5) должно быть тщательным и полным для получения однородной суспензии. Когда лизировать бактерии, вихревые и пипетировать лизат поочередно, сохраняя его на 4 ° C и обеспечивает ультразвука происходит на льду для предотвращения денатурации белка. Если вы используете другую модель sonicator, условия, возможно, должны быть скорректированы. Инкубация разрушать ультразвуком с бисером всегда должно быть сделано при 4 ° С на поворотное устройство, чтобы обеспечить достаточное обязательным, и следует проявлять осторожность, чтобы сохранить времени последовательно.
GST-Ро мутантов несколько неустойчивой, выраженных в бактерии, поэтому лучше пользоваться готовыми бисером сразу или в течение нескольких дней.
Осадков анализа (Часть 3) время и чувствительны к температуре,активное GEFs можно легко потерять из ячейки лизат, поэтому шаги должны быть выполнены как можно быстрее.
Следующий раздел содержит некоторые неисправностей советы.
Нет или очень низкое количество мутантных Rho белка в конечном шарик подготовки: Это может быть вызвано неэффективной индукции, недостаточно лизис бактерий, или потеря белка в процессе приготовления или хранения. Для устранения некоторых из этих возможностей, образцы бактерий могут быть проанализированы до и после индукции. Если есть плохой индукции белка повторить этот процесс с помощью колонию из свежих прожилками плита или повторно преобразованы компетентных клеток. Различные концентрации и индукции IPTG раз должны быть проверены. Если лизис недостаточно (например, белок остается в осадке, а супернатант) различные соли и моющих средств концентрация в буфере для лизиса может быть судим. Альтернативные раз ультразвука иНастройки должны быть рассмотрены и образцов до и после обработки ультразвуком можно проверить с помощью микроскопа, чтобы определить эффективность лизиса.
Не осаждали ГЭФ, хотя GST-белок присутствует в бисер: Это может быть связано с техническими вопросами при анализе осадков, или реальное отсутствие активации изучаемого ГЭФ помощью раздражитель. Всегда используйте известный стимул в качестве положительного контроля, чтобы убедиться, что тест работает. Используйте подготовленную бисер в течение нескольких дней. Если осадков анализ фиксирует обнаружить количество ГЭФ учился в любых условиях, убедитесь, что ГЭФ является настоящим и хорошо прощупывается в супернатант после центрифугирования, который будет использоваться для анализа (шаг 3.3). Убедитесь, что все буферы и ингибиторы протеазы являются новыми, а также осуществлять все шаги на льду как можно быстрее. Увеличение количества входных белка (например, с помощью лизатов от 2 пластины / образец). Если анализ показывает, осадков базальной скачкоtation вашего ГЭФ, но разница видна между контролем и стимулировать образцов (рис. 4), начните диагностику с проверки того, что применяемые стимулы работает с использованием других известных эффектов (например, обнаружение активации других сигнальных путей). Рассмотрим изменения условий лечения и / или концентрации. Положитесь на литературные данные отчетности, как ваш стимул активирует Rho или другой сигнализации, чтобы предсказать, как будет время и концентрации. При оптимизации времени обработки, используйте короткие и длинные периоды времени, как ГЭФ активации может быть лучше обнаружить на момент времени до и обнаружить активацию Rho. Наконец, тот же раздражитель может привести к различной степени активации в связи с изменением в ячейке реакции вызваны пассаж, сотовые слияния и т.д.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансируется Канадским институтом медицинских исследований (CIHR) (СС-97 774) и естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC, грант NR: 480619). KS является получателем премии KRESCENT Новый следователь (совместная награда Почечный Фонд Канады, Канадского общества нефрологии и Канадский институт исследований в области здравоохранения) и раннего премии исследователь из Онтарио Министерство исследований и инноваций. FW поддерживается Шинг стипендию Ли Ка.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.