El método aquí presentado describe un ensayo para seguir la activación de RhoA específicos PIB / GTP Factores de cambio (GEFS) en células cultivadas, haciendo uso de una proteína de fusión GST RhoA mutante que tiene una alta afinidad por GEFs activados. GEFs se precipitan a partir de lisados celulares, detectados por Western Blot y cuantificados por densitometría.
Las proteínas de la familia Rho de GTPasas pequeñas son reguladores centrales del citoesqueleto, y controlar una gran variedad de procesos celulares, incluyendo la migración celular, la expresión génica, la progresión del ciclo celular y el 1 de adhesión celular. Las proteínas Rho son los interruptores moleculares que actúan en GTP e inactivas en el PIB unido a Estado. Su activación está mediada por una familia de guanina-intercambio de nucleótidos de los factores (FMAM) de las proteínas. Rho-GEFs constituyen una gran familia, con la superposición de las especificidades 2. Aunque mucho progreso se ha hecho en la identificación de los GEFs activadas por señales específicas, todavía hay muchas preguntas pendientes acerca de la regulación de la vía específica de estas proteínas. El número de Rho-GEFs supera el 70, y cada célula expresa más de una proteína del FMAM. Además, muchas de estas proteínas no sólo activan Rho, pero otros miembros de la familia, contribuyendo además a la complejidad de las redes de regulación. Es importante destacar que, la exploración decómo GEFs están regulados requiere un método para seguir la piscina activa de GEFs individuales en las células activadas por estímulos diferentes. Aquí le ofrecemos un protocolo de paso a paso un método para evaluar y cuantificar los activos disponibles de Rho-específicas GEFs utilizando un ensayo de la precipitación de afinidad. Este ensayo fue desarrollado hace unos años en el laboratorio Burridge 3,4 y lo hemos utilizado en las líneas de células renales tubulares 5,6,7. El ensayo se aprovecha de un "nucleótido libre" mutante RhoA, con una alta afinidad por GEFs activos. La mutación (G17A) hace que la proteína incapaz de unirse PIB o el GTP y este estado imita el estado intermedio que se enlaza con el FMAM. Una versión GST-etiquetados de esta proteína mutante se expresa y se purificó a partir de E. coli, unidos a perlas de glutatión sefarosa y se utiliza para precipitar GEFs activos a partir de lisados de células no tratadas y estimulados. Como la mayoría de GEFs se activan a través de modificaciones postraduccionales o la liberación de los enlaces de inhibidores, su estado activose conserva en lisados de células, y pueden ser detectados por este ensayo 8. Proteínas capturadas se puede probar de GEFs conocidos por la detección de anticuerpos específicos mediante Western Blot, o analizados por espectrometría de masas para identificar GEFs desconocidos activados por ciertos estímulos.
El método que aquí se presenta es el único disponible no radiactivo ensayo de activación para GEFs que pueden seguir a la piscina activa de GEFs en las células. El ensayo es similar a los ensayos de precipitación se utilizan para la activación de las pequeñas GTPasas siguiente, así como contra GEFs Rac y Cdc42. Estos ensayos utilizan diferentes proteínas GST-etiquetados y tienen ligeras diferencias respecto a la que se describe aquí, sin embargo los pasos básicos son los mismos. Así, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para otros pequeños GTPasa y ensayos FMAM activación.
El ensayo presentado FMAM fue modificada recientemente para la aplicación de las fracciones nucleares 9,10. Con nuevas modificaciones, en las pruebas de la activación del FMAM en otros compartimentos subcelulares También podría ser posible.
Usamos el método que se presenta para estudiar la activación de GEFs en líneas de células epiteliales 5,6,7. Con algunos de optimización, este ensayo debe ser adecuada para detectar GEFs desde cualquier línea celular. Cuando adapting a un tipo específico de célula, encontrar el número de células óptima, el volumen de tampón de lisis, y el método de detección para el GEF a ensayar (un anticuerpo bueno para Western Blot es importante). Para la configuración inicial del ensayo, es aconsejable utilizar un estímulo que se conoce para activar el GEF de interés. Cuando se utiliza un estímulo desconocido, use siempre un control positivo para verificar que su ensayo está funcionando. Este ensayo se puede utilizar para detectar la activación de GEFs conocidos por Western Blot. Sin embargo, también es adecuada para identificar GEFs desconocidos. Para ello, GEFs capturados de control y las muestras estimuladas deben ser analizados en un gel de Coomassie manchado. Las bandas que aparecen sólo en las muestras estimuladas puede contener GEFs activados y pueden ser enviados para su identificación por espectrometría de masas (por ejemplo, 5).
Por último, una nota de advertencia. El ensayo se basa en la suposición de que las modificaciones post prestan GEFs activos se conservan después de la lisis celular. De hecho, este es claramente el case para un número de GEFs, y desde sus establecimientos, este ensayo ha sido utilizado por diversos grupos para detectar la activación de GEFs diferentes, incluyendo FMAM-H1, p115RhoGEF y XPLN (por ejemplo, 5,11,12,13). La preservación del estado activo sin embargo, no puede ocurrir en el caso de todos los GEFs, y por lo tanto, es concebible que este ensayo no funcionará para todos GEFs. También hay que señalar, que muchos GEFs ejercen actividad hacia más de un GTPasas pequeñas. Así, cuando un determinado FMAM se estudia, se recomienda complementar este análisis con los ensayos de precipitación del FMAM para otras GTPasas pequeñas, así como los estudios funcionales que examinan RhoA, Rac1 y Cdc42.
Los pasos críticos en el protocolo:
Las colonias de bacterias transformadas deben ser recogidos a partir de placas frescas, preparadas adecuadamente para asegurar la selección adecuada de amperios, fruto bueno y el rendimiento. Las condiciones de transformación de células competentes obtenidas de otras fuentes puede variar y debe ser consultado. </p>
Todas las etapas del protocolo de preparación de proteína (del paso 2,3) y el ensayo (del paso 3,2) debe ser realizada a 4 ° C con soluciones enfriadas y centrífugas.
Lisis bacteriana (paso 2,5) debe ser exhaustiva y completa a fin de obtener una suspensión homogénea. Cuando la lisis de las bacterias, vórtice y pipetear el lisado alternativamente, mientras se mantiene a 4 ° C y asegurar sonicación se lleva a cabo en hielo para evitar la desnaturalización de la proteína. Si se utiliza un modelo diferente de sonicador, las condiciones pueden ser necesario ajustar. La incubación de sonicado con las perlas siempre debe hacerse a 4 ° C en un rotador para asegurar unión suficiente, y se debe tener cuidado de mantener la sincronización consistente.
GST-Rho mutantes son algo inestables cuando se expresa en las bacterias, así que lo mejor es utilizar cuentas de preparados de inmediato o en unos pocos días.
El ensayo de precipitación (Parte 3) es el tiempo y la temperatura sensible, uns GEFs activos pueden perderse fácilmente a partir del lisado de células, de modo que los pasos deben realizarse lo más rápidamente posible.
La siguiente sección contiene algunos consejos sobre cómo solucionar problemas.
No o muy baja cantidad de proteína mutante Rho en la preparación perla final: Esto puede ser causado por inducción ineficaz, insuficiente lisis de las bacterias, o una pérdida de la proteína durante el proceso de preparación o el almacenamiento. Para ayudar a solucionar algunas de estas posibilidades, las muestras de bacterias pueden ser analizados antes y después de la inducción. Si hay inducción pobre de la proteína repetir el proceso usando una colonia de una placa recién rayado o de la re-transformadas células competentes. Las diferentes concentraciones de IPTG y los tiempos de inducción también debe ser probado. Si la lisis es insuficiente (es decir, la proteína permanece en el sedimento en lugar del sobrenadante) variando las concentraciones de sal y detergente en el tampón de lisis puede ser tratado. Tiempos de sonicación y suplentesajustes deben ser considerados, y las muestras antes y después de la sonicación puede ser comprobado por microscopía para determinar la eficiencia de la lisis.
N precipitó FMAM, aunque el GST-proteína está presente en los granos: Esto puede ser debido a problemas técnicos durante el ensayo de precipitación, o por una ausencia real de activación de la FMAM estudiado utilizando el estímulo aplicado. Siempre use un estímulo conocido como un control positivo para verificar que su ensayo funciona. Utilizar las cuentas preparadas en pocos días. Si el ensayo de precipitación captura cantidades no detectables de la FMAM estudiados en todas las condiciones, compruebe que su FMAM está presente y es bien detectable en el sobrenadante después de centrifugación que se va a utilizar para el ensayo (paso 3,3). Asegúrese de que todos los tampones y los inhibidores de la proteasa son frescos, y realizar todos los pasos sobre el hielo lo más rápido posible. Aumentar la cantidad de proteína de entrada (por ejemplo, mediante el uso de lisados de 2 placas / muestra). Si el ensayo de precipitación muestra basal precipitaciónción de la FMAM, pero no hubo diferencia se ve entre el testigo y las muestras estimuladas (Fig. 4), inicie la solución de problemas mediante la verificación de que el estímulo aplicado trabajado con otros efectos conocidos (por ejemplo, mediante la detección de la activación de otras vías de señalización). Considere la posibilidad de cambiar las condiciones de tratamiento y / o concentraciones. Confíe en los datos de la presentación de informes la literatura como su estímulo activa Rho o la señalización de otros tiempos para predecir probables y las concentraciones. Al optimizar el tiempo de tratamiento, utilice los dos puntos de tiempo corto y largo plazo, como la activación del FMAM podría ser la mejor detectable en un punto de tiempo antes de la activación de Rho y detectable. Finalmente, el mismo estímulo podría resultar en un grado variable de activación debido a un cambio en la respuesta de las células causada por el número de pases, células confluencia, etc
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) (MOP-97774) y de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, subvención n º: 480619). KS es un receptor de un Premio al Investigador KRESCENT Nueva (un premio conjunto de la fundación del riñón de Canadá, canadiense de Nefrología Sociedad y el Instituto Canadiense de Investigación en Salud) y un premio de los primeros investigadores del Ministerio de Ontario de Investigación e Innovación. FW con el apoyo de una beca de Shing Li Ka.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.