Den metod som presenteras här beskriver en analys för att följa aktivering av RhoA specifika GDP / GTP Exchange Faktorer (GEFs) i odlade celler genom att använda en mutant RhoA GST-fusionsprotein som har hög affinitet för aktiverade GEFs. GEFs fälls ut från cellysat, påvisades med Western blotting och kvantifieras genom densitometri.
Proteiner i Rho familj av små GTPases är centrala regulatorer av cytoskelettet, och styra ett stort utbud av cellulära processer, inklusive cell migration, genuttryck, cellcykelprogression och celladhesion 1. Rho proteiner är molekylära switchar som är aktiva i GTP-bunden och inaktiv i BNP-bundet tillstånd. Deras aktivering medieras av en familj av guanin-nukleotid (GEF) Exchange Faktor proteiner. Rho-GEFs utgör en stor familj, med överlappande särdrag 2. Även om en hel del framsteg har gjorts för att identifiera de GEFs aktiveras av specifika signaler, finns det fortfarande många frågor återstår om vägen-regleringen av dessa proteiner. Antalet Rho-GEFs överstiger 70, och varje cell uttrycker mer än en GEF proteinet. Dessutom är många av dessa proteiner aktiveras inte bara Rho, men andra medlemmar av familjen, bidrar ytterligare till komplexiteten i de regulatoriska nätverk. Viktigt att utforskahur GEFs regleras kräver en metod för att följa den aktiva poolen av individuella GEFs i celler som aktiveras av olika stimuli. Här erbjuder vi en steg-för-steg protokoll för en metod som används för att bedöma och kvantifiera de tillgängliga aktiva Rho-specifika GEFs med en analys affinitet nederbörd. Denna analys utvecklades för några år sedan i Burridge labbet 3,4 och vi har använt det i njure tubulära cellinjer 5,6,7. Analysen utnyttjar ett "nukleotid fri"-mutant RhoA, med en hög affinitet för aktiva GEFs. Mutationen (G17A) gör proteinet oförmöget att binda BNP eller GTP och detta tillstånd härmar det mellanliggande läget som är bunden till GEF. En GST-märkt version av denna mutant protein uttrycks och renas från E. coli, som är bundna till glutation Sepharose-pärlor och användes för att fälla aktiva GEFs från lysat av obehandlade och stimulerade celler. Eftersom de flesta GEFs aktiveras via post-translationella modifieringar eller utsläpp från hämmande bindningar, deras aktiva statligabevaras i cellysat, och de kan detekteras genom denna analys 8. Infångade proteinerna kan sonderas för kända GEFs genom detektion med specifika antikroppar med användning av Western blotting, eller analyseras genom masspektrometri för att identifiera okända GEFs aktiveras av vissa stimuli.
Den metod som presenteras här är den enda tillgängliga icke-radioaktiva aktivering analys för GEFs som kan följa den aktiva poolen av GEFs i celler. Analysen liknar de utfällnings analyser som användes för efter aktivering av små GTPaser, liksom GEFs mot Rac och Cdc42. De analyser använder olika GST-märkta proteiner och har små skillnader från det som beskrivs här, men de grundläggande stegen är desamma. Således kan detta protokoll enkelt anpassas för andra små GTPas och GEF analyser aktivering.
Den presenterade GEF Analysen har nyligen ändrats för ansökan om nukleära fraktioner 9,10. Med ytterligare modifieringar kan testning av GEF aktivering i andra subcellulära fack även vara möjligt.
Vi använder den presenterade metoden för att studera aktivering av GEFs i epiteliala cellinjer 5,6,7. Med viss optimering bör denna analys är tillräcklig för att detektera GEFs från någon cell-linje. När adapting till en viss celltyp, hitta den optimala antalet celler, lysbuffert volym och detektion metod för GEF som skall testas (en bra antikropp för Western blotting är viktigt). Den inledande installationen av analysen är det lämpligt att använda en stimulans som är känd för att aktivera GEF av intresse. Vid användning av en okänd stimulus, använd alltid en positiv kontroll för att verifiera att din analys fungerar. Denna analys kan användas för att detektera aktivering av kända GEFs med Western blotting. Det är emellertid också lämplig för att identifiera okända GEFs. För detta bör infångade GEFs från kontroll-och stimulerade proverna analyseras en Coomassie-färgad gel. Band som bara visas i stimulerade proverna kan innehålla aktiverade GEFs och kan skickas för identifiering med hjälp av masspektrometri (t.ex. 5).
Slutligen, ett varnande anmärkning. Analysen är baserad på antagandet att de post-translationella modifieringar som gör GEFs aktiva bevaras efter cellys. Det är detta tydligt CAoch för sig för en rad GEFs, och eftersom dess anläggningar, har denna analys har använts av olika grupper för att detektera aktivering av olika GEFs, inklusive GEF-H1, p115RhoGEF och XPLN (t.ex. 5,11,12,13). Bevarande av det aktiva tillståndet dock inte kan hända i fråga om alla GEFs, och därför är det tänkbart att denna analys inte fungerar för alla GEFs. Det bör också noteras att många GEFs utövar aktivitet mot mer än en mindre GTPases. Så när en viss GEF studeras, är det rekommenderat att komplettera denna analys med GEF nederbörd analyser för andra små GTPases samt funktionella studier undersöka RhoA, RAC1 och Cdc42.
Kritiska steg i protokollet:
Kolonier av transformerade bakterier bör plockas från färska, väl beredda plattor för att säkerställa tillräcklig valet genom Amp, bra utväxt och avkastning. Transformationsbetingelser för behöriga celler erhållna från andra källor kan variera och bör konsulteras. </p>
Alla stegen i proteinberedningen protokollet (från steg 2.3) och analysen (från steg 3,2) bör utföras vid 4 ° C med kylda lösningarna och centrifuger.
Bakteriell lys (steg 2.5) bör vara grundlig och fullständig för att erhålla en homogen suspension. När lysera bakterier, virvel och pipettera lysatet växelvis, medan den hålls vid 4 ° C och säkerställa sonikering görs på is för att förhindra denaturering av proteinet. Om du använder en annan modell av sonikator, får villkor behöva justeras. Inkubation av sonikat med pärlorna ska alltid göras vid 4 ° C på en rotator för att säkerställa tillräcklig bindning och försiktighet bör vidtas för att hålla timing konsekvent.
GST-Rho mutanter är något instabila när de uttrycks i bakterier, så det är bäst att använda förberedda pärlor direkt eller inom några dagar.
Nederbörden analys (del 3) är tid och temperatur känslig, enaktiva GEFs lätt kan förloras från cellysatet, och därför bör steg utföras så snabbt som möjligt.
Följande avsnitt innehåller en del felsökningstips.
Ingen eller mycket liten mängd av mutant Rho-protein i den slutliga pärlan beredningen: detta kan vara orsakad av ineffektiv induktion, otillräcklig lys av bakterierna, eller en förlust av proteinet under framställningen process eller lagring. För att hjälpa felsöka några av dessa möjligheter, kan prover av bakterier analyseras före och efter induktion. Om det är dålig induktion av proteinet upprepa processen med användning av en koloni från en färskt strimmigt platta eller från att åter-transformerade kompetenta celler. Olika IPTG koncentrationer och tider induktion bör också testas. Om lys är otillräcklig (dvs proteinet förblir i pelleten istället för supernatanten) varierar salt och tvättmedel koncentrationerna i lyseringsbuffert kan prövas. Alternativa sonikering tider ochInställningarna bör övervägas, och prover före och efter ultraljudsbehandling kan kontrolleras genom mikroskopi för att bestämma effektiviteten i lys.
Nej fälls GEF, trots att GST-proteinet finns på pärlorna: Detta kan bero på tekniska problem under utfällningen analysen, eller genom en verklig brist på aktivering av den studerade GEF med stimulans tillämpas. Använd alltid en känd stimulans som en positiv kontroll för att verifiera att din analys fungerar. Använda de preparerade pärlorna inom några dagar. Om nederbörden analysen fångar omätbara mängder av GEF studerade under alla förhållanden, kontrollera att din GEF finns och är väl detekteras i supernatanten efter centrifugering som ska användas för analysen (steg 3,3). Se till att alla buffertar och proteashämmare är fräscha och utföra alla steg på is så fort som möjligt. Öka mängden ingående protein (t.ex. genom användning av lysat från 2 plattor / prov). Om utfällning analysen visar basala utfälldförandet av din GEF, men ingen skillnad ses mellan kontroll-och stimulerade prover (figur 4), börja felsökning genom att kontrollera att tillämpas stimulans arbetat med andra kända effekter (t.ex. genom att detektera aktivering av andra signalvägar). Överväga att ändra behandlingen arbetsförhållanden eller koncentrationer. Lita på data från litteraturen rapporteringen hur stimulans aktiverar Rho eller andra signalering att förutsäga sannolika tider och koncentrationer. När du optimerar behandlingstid, använda både korta och långa tidpunkter, som GEF aktivering kan vara bäst upptäckas vid en tidpunkt före väl detekterbart Rho aktivering. Slutligen kan samma stimulus resultera i en varierande grad av aktivering på grund av en förändring i cellskänslighet orsakad av passage-antal, cell konfluens, etc
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av det kanadensiska institutet för hälsoforskning (CIHR) (MOP-97.774) och naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC bevilja nr: 480.619). KS är mottagare av en KRESCENT New Investigator Award (en gemensam upphandling av Kidney Foundation of Canada, Kanadas njurmedicin samhälle och kanadensiska Institute of Health Research) och en tidig forskare Award från Ontario ministeriet för forskning och innovation. FW stöds av en Li Ka Shing stipendium.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.