Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ"א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

Published: July 12, 2012 doi: 10.3791/3938

Summary

זרימת עבודה יעילה ללמוד מתילציה דנ"א ביטוי שינויים גנטיים על הלחץ מוקדם בחיים מוצג. החל מ הפרידה מן האם של עכברים בני יומם ובידוד של רקמות מוח נפרדים, אנחנו מייצגים את הפרוטוקול בו זמנית לבודד DNA ו-RNA של אגרופים רקמות המוח רצף bisulfite עתידיים RT-PCR ניתוח.

Abstract

חשיפה דיאטה, תרופות מצוקות החיים בשלב מוקדם של Windows רגישים של 1,2 החיים יכולים להוביל לשינויים בר קיימא ביטוי גנים התורמים התצוגה של פנוטיפים פיזיולוגיים והתנהגותיים. תכנות סביבתי כזה עלול להגביר את הרגישות, מחלות מטבוליות לב וכלי דם הנפש 3,4.

מתילציה דנ"א שינויים היסטון נחשבים תהליכים מרכזיים בגישור של דיאלוג גנים הסביבה ומופיעות גם רובד תחתון תכנות הסביבה 5. אצל יונקים, מתילציה בדנ"א בדרך כלל כוללת בנוסף קוולנטי של קבוצת מתיל במיקום-5 של ציטוזין בהקשר של dinucleotides CPG.

מתילציה CPG מתרחשת באופן רקמות ותאים ספציפי מאוד מה שהופך אותו לאתגר ללמוד בדידים, אזורים קטנים של המוח שבו ההטרוגניות הסלולר הוא גבוה וכמות הרקמה מוגבלת. יתר על כן, בביטוי גנים מתילציה ecause ו מתקיים קשר הדוק אירועים, ערך מוגבר ניתן להשיג על ידי השוואת שני הפרמטרים במדגם זהה.

כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד (איור 1) לחקירה של תכנות epigenetic במוח מוצג באמצעות פרדיגמה "הפרידה מן האם" צרה חייו המוקדמים לשם המחשה. הפרוטוקול מתאר את הכנת micropunches של מוחות עכבר דיפרנציאלי בגיל שממנו DNA ו-RNA יכול להיות מבודד בו זמנית, ובכך מאפשר מתילציה בדנ"א וביטוי גנים ניתוחים במדגם זהה.

Protocol

1. תכנות על ידי צרה חייו המוקדמים

הפרידה מן האם (MS) מבוצע כדי לגרום ללחץ מוקדם בחיים (ELS) ב גורי נמסר על ידי מתוזמן, עכברים הרות C57BL/6N (יום לאחר הלידה 0 (P0) ביום הלידה).

  1. המלטות אישיות ממוקמים בכלובים נקיים (עם כרית חימום) למשך 3 שעות מדי יום בין P1-10.
  2. בקרה (לא ELS) הגורים נשארים ללא הפרעה בקן מצד לאורך כל הדרך.
  3. הגורים מוחזקים עם אמהותיהם עד הגמילה (P21), ולאחר מכן פעם שהם שוכנות קבוצות מין מתאימים (3-5 עכברים בכל כלוב) על פי תקן של בעלי חיים בתנאי מעבדה דיור.

2. בידוד Dissection של רקמת מוח

  1. עכברים מומתים בגיל הרצוי על ידי הערה צוואר הרחם העקירה. כי פרוטוקול זה כרוך הפרדיגמה לחץ, לא ניתנת הרדמה לפני העקירה צוואר הרחם, כדי למנוע הפרעה בוויסות פיזיולוגי תקין של הורמוני לחץ. גולגלות נפתחיםהמוח מוסרים בזהירות ומיד Snap-קפואה על ידי טבילה בקרח ISO-פנטן יבש, לפני אחסונם ב -80 ° C.
  2. מוחות הם cryosectioned (10 מיקרומטר עובי); חלקים הם רכובים על שקופיות זכוכית Superfrost ומתוחזק ב -20 ° C. התייחסות עכבר רגיל stereotaxic אטלס (למשל Paxinos 6) משמש לאימות דיוק אנטומי ולהבטיח הכללת האזור של ריבית (למשל עבור נוירונים בגרעין paraventricular - PVN - לאסוף קטעי החל ברמה של PVN מקורי, גבחת -0.75 ל -0.85).
  3. סעיפים מגואלות סגול cresyl כדי להקל על זיהוי מבנים מוחיים שונים. אגרופים (0.8 מ"מ) של אזורים בעלי עניין (למשל PVN) מתקבלים ב microdissection לוקו.

3. חומצה הפקת גרעין של אגרופים המוח

פרוטוקול אופטימיזציה עבור במקביל לחילוץ DNA ו-RNA זעיר מן neuroanatomically מוגדרים במוח רגיונים עבור ניתוחים bisulfite ו ביטוי גנים מתואר 7.

הערה: בהתחשב בכך RNA היא יציבה פחות מ-DNA במאגר-GTC, אנו ממליצים עיבוד RNA 1. Homogenate המשמש לטיהור DNA יכולים להישמר בטמפרטורת החדר (RT) באותה תקופה.

  1. Homogenize אגרופים באמצעות פיפטה ו vortexer ב μl 400 מתוך חוצץ guanidinium thiocyanate (GTC) (4.5 מ 'guanidinium thiocyanate, 2% N-lauroylsarcosine, 50 מ"מ EDTA pH 8.25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 מ' בטא mercaptoethanol, antifoam 0.2% א) ב RT, עובר מספר פעמים באמצעות מזרק המזרק (29G) (איור 2).
  2. פיצול lysate לחלקים שווים, הן RNA ו-DNA עשויה לחלץ בו זמנית או בנפרד, בהתאם לצרכים ניסויים מסוימים.
  3. לטיהור RNA להוסיף נפח 1/10 של NaOAc, 1 AquaPhenol נפח (Appligene) (pH 4) ו 1/2 נפח של כלורופורם: isoamyl (24:1) כדי lysate. מערבולת במרץ לאחר כל שלב ודגירה על קרח 10 דק ', צנטריפוגה (20 דק' ב גרם 10000 ב 4 ° C), מוסיפים נפח שווה של 70% EtOH לשלב aequous.
  4. להעביר את התערובת לעמודה ספין RNA (למשל Nucleospin RNA II מ-Macherey נגל) ולבצע צעדים על עמודות DNase-העיכול כביסה (אחרי פרוטוקול של היצרן); elute RNA של 25 μl H 2 O.
  5. לטיהור DNA פרוטוקול אופטימיזציה של דם Qiagen DNeasy וקיט רקמות משמש. לאזן lysate עם כמויות שוות של מאגר AL ו EtOH 100%, עומס על צנטריפוגות טור ספין (1 דקות ב g 10,000 ב RT) וזורקים זרימה דרך.
  6. הוסף 500 μl מאגר AW1 כולל 5 RNAse μl (1 מ"ג / מ"ל) לעמודה ו דגירה 10 דקות ב RT. ספין (1 דקות ב 10,000 גרם, RT) וזורקים זרימה דרך.
  7. לשטוף את העמודה עם AW2 500 מאגר μl, לבטל את הזרימה דרך ספין יבש העמודה ריקה (1 דקות ב g 15,000).
  8. הוסף prewarmed (70 ° C) מאגר AE ו עמודות דגירה של 10 דק 'ב 70 ° C. Elute ידי צנטריפוגה (1 דקות, 10000 ז), להירשם מחדש זרימה דרך וחזור על שלב צנטריפוגה.

השתמש ספקטרופוטומטר לקבוע DNA ו-RNA בריכוזים. טיפוסי PVN אגרוף תשואות ~ 600 ng DNA ו ~ 400 ng-RNA. ניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותית (QPCR), אנו משתמשים בדרך כלל ~ 100 ננוגרם של רנ"א בתגובה שעתוק לאחור.

4. Bisulfite המרה

Bisulfite נתרן משמש להמיר לא מפוגל cytosines כדי uracils. לעומת זאת, cytosines מפוגל מוגנים מפני המרה. לכן, כל cytosines אשר זוהה רצף סופי של bisulfite PCR-amplicon מייצגים cytosines מפוגל.

ההמרה bisulfite גורם השפלה DNA משמעותית וזה יכול להיות הגורם המגביל בסופו PCR. התנאים התגובה מיטבית למקסם המרה ציטוזין, להפחית את פיצול ה-DNA ולשמר חד גדילי ה-DNA גם בטמפרטורות נמוכות יותר ניתן להשיג באמצעותQiagen של ערכת EpiTect bisulfite. בידינו ~ 200 ng של DNA מטוהרים מן micropunches לספק כמות מספקת של חומר המוצא לתגובה bisulfite.

כדי למנוע הבדלי יעילות ההמרה של תגובה, כמות ה-DNA תבנית יש לשמור קבוע בין כל דגימות שעובדו במהלך הניסוי. בנוסף, רצף קורא יש בחן את יעילות ההמרה על ידי בחינת שיעור הלא המרה למוצרי CpGs שאינם. שיעור זה יעלה על 98%. ערכים נמוכים מצביעים על ההמרה bisulfite לא שלם או לא יעיל ואת רצפי הבסיס צריך להיות נכלל באנליזה.

5. Bisulfite PCR

  1. Bisulfite עיצוב רצף פריימרים ספציפיים ל-DNA bisulfite המרה (ראה דיון) מתיל פריימר Express תוכנה ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ En / ארה"ב / adirect / AB? Cmd = catNavigate2 & catID = 602121) יסייעו זה לעזור לקבוע חישול בטמפרטורה אופטימלית בניסויים טייס.
  2. הכן PCR-Master-Mix (לתגובה 1) כדלקמן:

    2.5 μl חיץ 10x PCR
    0.5 μl 10 מ"מ dNTPs
    1 μl 10 מיקרומטר קדימה פריימר
    1 μl 10 מיקרומטר הפוך פריימר
    0.125 μl Qiagen Hotstart Taq פלוס
    למלא עד 23 μl עם H 2 O

  3. הוסף 2 DNA μl bisulfite שטופלו לתגובה.
  4. להגביר את השימוש בתנאים הבאים:

    1 מחזור 6 דקות 95 ° C
    45-50 מחזורים של 1 דק '95 ° C, 1 דקות בטמפרטורה אופטימלית, חישול 1 דקות 72 ° C
    מחזור 1 5 דקות 72 ° C

ניתוח 7 μl של מוצר ה-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose לאמת את גודל amplicon ולטהר תגובת PCR שנותר קשירת לאחר שימוש זמינה באופן מסחרי PCR ניקוי הערכה (למשל Macherey-Naג'ל Nucleospin חלץ). במקרה מוצרים נוספים לא רצויים ה-PCR מתקבלים, טיהור ג'ל מומלץ.

6. Bisulfite הרצף

ברזולוציה גבוהה מתילציה בדנ"א פרופילים מוסק מקריאות לשבט אחד יכול לזהות שינויים קטנים מתילציה דנ"א ולזהות אזורים רגולטוריים, כי הם מגיבים לטיפול (תכנות סביבתי). תהליך סידור bisulfite מורכב משלושה שלבים עבודה רצופות. ראשית, מוצרי ה-PCR מתקבל על ידי bisulfite PCR לפני הם ligated לתוך וקטור והפכו חיידקים. שנית, המושבה PCR מ שיבוטים אחד מועסק על מנת לקבוע את הגודל הנכון של הכנס. שלישית, PCRs המושבה חיוביות מנקים מעלה נתון התגובה Big-דיי רצף. לאחר שלב ניקוי, מוצרים electrophoresed ברצף על נימי.

6.1 קשירת ושינוי

הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי pGEM-T וקטור CLoning KIT (Promega). מניסיוננו, יעילות שיבוט תלוי באופן קריטי על הוספה להיות ligated. וקטורים שונים יש לבדוק במקרה מספרים נמוכים של שיבוטים רקומביננטי מתקבלים שוב ושוב.

  1. הגדר את התגובה קשירת:

    5 μl קשירת 2x מאגר
    1 μl pGEM-T וקטור
    1 μl T4-האנזים
    3 μl ניקה-PCR את המוצר

  2. מערבבים תגובה על ידי pipetting ו דגירה על הלילה 4 ° C.

    הערה: קשירת יכול גם להתבצע על 1 H ב RT גם כן. כדי להגדיל את מספר שיבוטים רקומביננטי, על קשירת הלילה 4 מעלות צלזיוס הוא המועדף.

  3. נקה-up של מוצרים קשירת ידי משקעים אתנול:
    1. הוסף 1 גליקוגן μl, 1 μl 3M NaAc ו 25 EtOH 100% μl לתגובה קשירת ופתאומי דקות 1 בחנקן נוזלי.
    2. צנטריפוגה (15,0000 גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C) וזורקים supernatant.
    3. לשטוף עם μl 300EtOH 70% ו צנטריפוגה (15,000 גרם של 20 דקות ב 4 ° C), למחוק גלולה supernatant ויבש ב RT (10 דקות).
    4. Resuspend גלולה ב 10 μl H 2 O.

6.2 שינוי של מוצרים קשירת חיידקים electrocompetent

  1. Precool electroporation cuvettes (1 מ"מ רוחב) על קרח aliquot ההפשרה של חיידקים DH5α electrocompetent על הקרח.
  2. הוסף 45 μl חיידקים DH5α ל μl 10 ניקה המוצר קשירת (ראה לעיל) ולהעביר את קובט.
  3. להפוך חיידקים על 1.5 kV, 200 Ω, 15 μF ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום SOB prewarmed מיד לאחר הלידה הדופק.
  4. שחזור חיידקים על 1 ח ב 37 ° C, להפיץ 100 μl של השעיה על LB / צלחות ampicillin מצופה IPTG / X-Gal.
  5. דגירה צלחות לילה ב 37 מעלות ג

6.3 המושבה PCR

הערה: המושבה PCR מ שיבוטים בודדים מתבצע על מנת להבטיח מוסיף כי הםגודל חזה. התפתחות מאוחרת של צבע סינון כחול / לבן, אירועי רקומבינציה לא רצויים במהלך קשירת, שילוב של זוגות פריימר oligomeric או חתוכים מוצרי ה-PCR יכול אחרת להוביל לתוצאות רצף פגומים. אנו משתמשים באופן שגרתי T7 ו SP6 primers להגביר מוסיף משובטים; זה תוצאות הגישה וקטור רצפים נוספים של כ -150 נ"ב. פריימר T7 משמש בתגובה רצף בשלב מאוחר יותר.

  1. הגדרת המושבה PCR התגובה בצלחת 96-היטב. ראשית התגובה להשתמש:

    3 μl 2.5 מ"מ MgCl 2
    2.5 μl חיץ 10x Taq
    1.5 μl 10 mM dNTP
    2 μl 2.5 מ"מ פריימר T7
    2 μl 2.5 SP6 mM פריימר
    1 פולימראז μl Fermentas Taq
    למלא עד 25 μl עם H 2 O

  2. לוותר על 25 μl / גם תמהיל אמן זה לתוך זה גם צלחת 96-היטב.
  3. בחר שיבוט חיובית (לבן) מהצלחת עם קצה פיפטה ולטבול את התגובה PCR.
  4. להגביר באמצעות תחשיב היחסים הגועות תנאים:

    מחזור 1 4 דק 'ב 95 ° C
    10 מחזורים 30 של ב 94 ° C, 30 ב של 56 מעלות צלזיוס ו -30 של ב 72 ° C
    30 מחזורים 30 של ב 94 ° C, 30 ב של 48 מעלות צלזיוס ו -30 של ב 72 ° C
    מחזור 1 5 דק 'ב 72 ° C

  5. טען 5 μl של המושבה PCR על ג'ל agarose ולקבוע תגובות שמכילות את גודל הוסף הנכון.
  6. PCRs מושבה המכילים את amplicons הרצויות ניקה באמצעות ערכת זמינים מסחרית (Machery נגל Nucleofast).

6.4 Big-דיי שליחות קטלנית התגובה סידור

  1. להכין תערובת אב התגובה Big-דאי. ראשית התגובה להשתמש:

    1 μl H 2 O
    0.5 מגיב μl Big-דיי
    1.5 רצף μl חיץ

  2. לוותר על 3 μl / היטב היטב כל צלחת 96-ובכן, זה גם להוסיף 2 μl של המוצר ניקה המושבה PCR ולהפעיל תגובה על thermocycler עם הפרמטרים הבאים:

    > 1 1 מחזור דק 'ב 96 ° C
    35 מחזורים של של 10 על 96 מעלות צלזיוס, 5 שניות ב 50 מעלות צלזיוס, 4 דק 'ב 60 ° C

  3. התגובה Big-דאי הוא ניקה באמצעות ערכת מסחרי (Millipore Montage 96 סידור ניקוי קיט) ומעובדים על נימי ברצף (למשל ABI 3100-DNA).
  4. רצפים מנותחות באמצעות מנתח Biq ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) או בכלי BISMA באינטרנט ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) לגזור את תבנית המתילציה של הדנ"א באזור נחקר (איור 4).

7. נציג תוצאות

כדי לקבל תובנות לגבי ההשפעה של ELS על הביטוי AVP ומצב מתילציה, עכברים C57BL/6N עובדו על פי זרימת העבודה המתוארת לעיל. בקיצור, קבוצה של עכברים C57BL/6N היה שלubjected כדי ELS ואילו קבוצת הביקורת נותרה ללא הפרעה. PVN ואת הגרעין supraoptic (בנו) היו באגרופים DNA ו-RNA נותקו זמנית מן המכות בודדים. רנ"א הוא עיבד לאחור לרמות של תמלילי AVP נמדדו על ידי ניתוח QPCR ו מנורמל לביטוי של Hprt וגנים Gapdh משק הבית. ה-DNA היה bisulfite מטופלים, מוגבר עם פריימרים ספציפיים משפר AVP (איור 4 א) ואת מוצרי ה-PCR היו משובטים ואת רצף. לפחות 20 שיבוטים רקומביננטי של כל עכבר / PCR נותחו על מנת לקבוע תדרים מתילציה עבור CpGs הכלולים amplicon PCR (תרשים 4 ב). בהשוואה לקבוצת הביקורת, ELS המושרה hypomethylation משמעותית על CpG10, CpG12, CpG13 ו Cpg14 של משפר AVP (p <0.05, N = 6-8 בעלי חיים) מציע epigenetic סימון של אזור זה הרגולטורית באמצעות מוקדם חוויות החיים. בניגוד מתילציה PVN, שלמשפר AVP היה מושפע ELS ב ספציפיות הממחישות רקמות בן סימון epigenetic (איור 4C). ניתוח מצב מתילציה בדנ"א ב CpG10 וביטוי AVP גן חיות בקרת (n = 6) שמעידים על מתאם שלילי מצביע על תפקיד המתילציה של הדנ"א כוונון עדין של ביטוי גנים AVP (איור 4D).

איור 1
Micropunches באיור 1. מתקבלים המוח גזור מן מלאה בתחילת החיים עכברים הדגיש. בעקבות ה-DNA ו-RNA בידוד, ביטוי גנים נקבע על ידי qRT-PCR תוך ה-DNA bisulfite טיפול מוגבר ומוצרי מטוהרים הם משובטים בזיהוי וקטור מתאים המאפשר של שיבוטים רקומביננטי ידי בחירה כחול / לבן. גדלים להוסיף נכון מאומתים על ידיהמושבה PCR לפני ביצוע Big-דיי התגובה ועיבוד ברצף על נימי. דגם המתילציה הם דמיינו ידי כלי התוכנה המתאים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 2
איור 2. ציר הזמן של מיצוי DNA / RNA כדי סידור bisulfite.

איור 3
איור 3. זרימת עבודה להפקת סימולטני של DNA ו-RNA. אגרוף של הגרעין ההיפותלמוס paraventricularis, גן AVP זעיר להביע באזור המוח, ממוקם מאגר GTA 400 μl, vortexed עד שיבשו, ומעורים יותר על ידי עובר דרך מזרק (29G). Homogenate מפוצל אז לטיהור של RNA ו-DNA. הפיצול יכול להיות 1:1 או בממדים שונים בהתאםעל השאלה הניסוי בפרט. Homogenates אמורה להתבצע תוך שעות ספורות.

איור 4
איור 4. מתילציה CPG ב לוקוס AVP בשליטה שבועות 6 הישן חיות רכבות עיליות. () תוכנית של הזנב AVP וגנים האוקסיטוצין חוקיים אל הזנב מופרדות באזור intergenic (IGR). אקסונים מתוארים על ידי פתוחים (הממוספרים) תיבות. הפצה של שאריות CPG מצוין ואת הגודל והמיקום של amplicon PCR בהתאמה המכיל CPG 10 עד CpG14 מסומן קו מודגש. (ב) מתילציה של AVP משפר ב PVN בחיות בקרה ELS (n = 6-8). (ג) מתילציה של AVP משפר בבן בשליטה חיות רכבות עיליות (n = 8-10). (ד) ביטוי AVP הגן היתה בקורלציהעם מתילציה ב CpG10 (n = 6). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

Discussion

תכנות epigenetic מוכרת יותר ויותר לבריאות מנגנון חשוב הבסיס לבין המחלה. כאן אנו מציגים שיטה מעודנת לבידוד בו זמנית של DNA ו-RNA מ micropunches ואת הצעדים הבאים כדי לקבל פרופילים מתילציה דנ"א באמצעות רצף bisulfite. עבודה אופטימיזציה מאפשר ניתוח נוח של תכנות epigenetic במוח בתגובה לגירויים סביבתיים. יתר על כן, גישה זו מקלה על חקירת הקשר הפונקציונלי בין מתילציה דנ"א ביטוי גנים כמו גם מנותחים מדגם זהה. לבסוף, מספר בעלי החיים הדרושים לניסוי ניתן לצמצם באופן משמעותי.

אמצעי זהירות מסוימים והנחיות חייבות לבוא בעת ביצוע העבודה שהוצג. בהתחשב במורכבות יוצאת דופן ההטרוגניות של המוח ומאז דפוס מתילציה והביטוי עשויה להשתנות באופן תאים ורקמות ספציפי זה של מירבכי micropunching חשיבות מתבצע בצורה סטנדרטית. כמו במקרה של הנקודה, תכנות epigenetic של AVP מתגלה paravaventriuclar, אבל לא בגרעין supraoptic (איור 4 ב ', ד), 2 AVP להביע אזורי ההיפותלמוס 4. מבחינה זו, הזמינות של DNA ו-RNA של אגרוף רקמות זהה יש יתרון ביטוי RNA של גנים מסוימים ברקמות ספציפיות סמן יכול לשמש במקרים מסוימים לאשר כי השטח הנכון היה אגרוף. למרות micropunching יכול להפחית ההטרוגניות הסלולר, הוא צריך לזכור כי גישה זו אינה מובילה לבידודה של סוגי תאים בודדים או אוכלוסיות. צעדים נוספים טיהור עשוי להיחשב לטפל בנושא זה.

עבור bisulfite רצף עיצוב פריימר האופטימלי לטיפול PCR bisulfite הבאה הגברה חיוני. מוצרי ה-PCR העולה על 400 נ"ב באורך עלולה להיות בעייתית בשל הידרדרות של ה-DNA על ידי בisulfite הטיפול. יש לציין גם כי ה-PCR מקונן יכול לתת תוצאות מוטות אם רק כמה תבניות שלמות כמה לתרום לתהליך ההגברה. זוגות פריימר ספציפיים עבור amplicon שונה צריך להיות מתוכנן, רצפים שלהם לא יכילו dinucleotides CPG על מנת למנוע מתילציה מוטות הגברה. בנוסף, primers צריך להכיל לא CPG cytosines כדי למנוע הגברה של DNA ללא שינוי או המרה באופן חלקי. הגברה של מספר תבניות עשויות להפיק תועלת בניהול חם תחילת PCR. בכל מקרה, התאמת זוגות פריימר צריך להיות מאומת בניסויים הטייס כדי למנוע קלקול של דגימות ניסויים חשובים.

סידור bisulfite מייצג שיטה סטנדרטית לניתוח באתר מתילציה ספציפי כפי שהוא מסוגל לזהות באופן אמין ומדויק מתילציה של שאריות CPG יחיד באופן אלל ספציפי 8. רצף ישיר של מוצר ה-PCR לא מומלץ, היות מתילציה o מעורבתשאריות fa CPG יופיעו השיא C / T כפול electropherogram, אשר יכול למנוע כימות של מתילציה באתר מודאג. מסיבה זו הצעד שיבוט ביניים מבוצע שיבוטים כמה הם רצף (~ 20-30) כדי לקבוע את מידת מתילציה. Pyrosequencing מייצג שיטה חלופית לכמת מתילציה בדנ"א. הוא גם מנצל ההמרה bisulfite ו bisulfite PCR אבל במקום השיבוט רצף amplicon נתונה התגובה pyrosequencing ישיר, שבו מצב מתילציה של שאריות CPG נקרא פולימורפיזם כמו C / T נוקלאוטיד יחיד, שניתן לכמת בקלות. שתי השיטות לזהות רמות דומות של מתילציה 9 אבל מאז שיבוט שלב ניתן להשמיט pyrosequencing יותר זמן יעיל. עם זאת, בהתאם לתבנית רק 40-100 נוקלאוטידים יכול להיות רצף בבת אחת, כך מספר סבבי pyrosequencing עם פריימר סידור שונה נחוצים. זוהי מגבלה קריטית, בהתחשב thaסכומים לא גבוהים יותר של ה-DNA (כ 1 מיקרוגרם לכל תגובה) נדרשים, דבר הנראה לעין יעלה על הסכומים הזמינים מן המכות רקמה זעירים במוח. כך סריקה ראשונית של אזורים בטווח של כמה kilobases ידי pyrosequencing נראה פחות מתאים כמו קריאה שיבוט אחד. אף על פי כן, לאחר זיהוי על אזור קטן של pyrosequencing עניין יש לשקול.

באופן קולקטיבי, את הפרוטוקול המתואר לעיל מספק גישה מדויק, יעיל יעיל לניתוח מהיר וחסכוני של micropunches המוח לשינויים epigenetic. דגימות מרובות ניתן לעבד בטווח אחת השיטות מתאימות בזמן הרצת דגימות ביניים בגודל ניסויים.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי ממכון מקס פלנק לפסיכיאטריה מארי האיחוד האירופי רשת קירי ההכשרה הראשונית (חוזה NINA 238665).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Nucleospin RNA II Macherey-Nagel 740955.50
Epitect Bisulfite Kit Qiagen 59104
Nucleospin Extract Macherey-Nagel 740609.50
pGEM-T Vector Cloning Kit Promega A3600
Nucleofast 96 Macherey-Nagel 743100.50
Montage 96 Sequencing Clean-Up Millipore LSK09624
Hotstar Taq Polymerase Qiagen 203203
Taq Polymerase Fermentas EP0401

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jirtle, R. L., Skinner, M. K. Environmental epigenomics and disease susceptibility. Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).
  2. Murgatroyd, C., Spengler, D. Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides. Stress (Amsterdam, Netherlands). (2011).
  3. Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases. Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).
  4. Murgatroyd, C. Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress. Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).
  5. Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockmühl, Y., Spengler, D. Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression. Epigenetics. 5, (2010).
  6. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. Elsevier Science Publishing Co Inc. (2008).
  7. Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC research notes. 4, 314 (2011).
  8. Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
  9. Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation. Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).
ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bettscheider, M., Kuczynska, A., Almeida, O., Spengler, D. Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain. J. Vis. Exp. (65), e3938, doi:10.3791/3938 (2012).More

Bettscheider, M., Kuczynska, A., Almeida, O., Spengler, D. Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain. J. Vis. Exp. (65), e3938, doi:10.3791/3938 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter