1. תכנות על ידי צרה חייו המוקדמים הפרידה מן האם (MS) מבוצע כדי לגרום ללחץ מוקדם בחיים (ELS) ב גורי נמסר על ידי מתוזמן, עכברים הרות C57BL/6N (יום לאחר הלידה 0 (P0) ביום הלידה). המלטות אישיות ממוקמים בכלובים נקיים (עם כרית חימום) למשך 3 שעות מדי יום בין P1-10. בקרה (לא ELS) הגורים נשארים ללא הפרעה בקן מצד לאורך כל הדרך. הגורים מוחזקים עם אמהותיהם עד הגמילה (P21), ולאחר מכן פעם שהם שוכנות קבוצות מין מתאימים (3-5 עכברים בכל כלוב) על פי תקן של בעלי חיים בתנאי מעבדה דיור. 2. בידוד Dissection של רקמת מוח עכברים מומתים בגיל הרצוי על ידי הערה צוואר הרחם העקירה. כי פרוטוקול זה כרוך הפרדיגמה לחץ, לא ניתנת הרדמה לפני העקירה צוואר הרחם, כדי למנוע הפרעה בוויסות פיזיולוגי תקין של הורמוני לחץ. גולגלות נפתחיםהמוח מוסרים בזהירות ומיד Snap-קפואה על ידי טבילה בקרח ISO-פנטן יבש, לפני אחסונם ב -80 ° C. מוחות הם cryosectioned (10 מיקרומטר עובי); חלקים הם רכובים על שקופיות זכוכית Superfrost ומתוחזק ב -20 ° C. התייחסות עכבר רגיל stereotaxic אטלס (למשל Paxinos 6) משמש לאימות דיוק אנטומי ולהבטיח הכללת האזור של ריבית (למשל עבור נוירונים בגרעין paraventricular – PVN – לאסוף קטעי החל ברמה של PVN מקורי, גבחת -0.75 ל -0.85). סעיפים מגואלות סגול cresyl כדי להקל על זיהוי מבנים מוחיים שונים. אגרופים (0.8 מ"מ) של אזורים בעלי עניין (למשל PVN) מתקבלים ב microdissection לוקו. 3. חומצה הפקת גרעין של אגרופים המוח פרוטוקול אופטימיזציה עבור במקביל לחילוץ DNA ו-RNA זעיר מן neuroanatomically מוגדרים במוח רגיונים עבור ניתוחים bisulfite ו ביטוי גנים מתואר 7. הערה: בהתחשב בכך RNA היא יציבה פחות מ-DNA במאגר-GTC, אנו ממליצים עיבוד RNA 1. Homogenate המשמש לטיהור DNA יכולים להישמר בטמפרטורת החדר (RT) באותה תקופה. Homogenize אגרופים באמצעות פיפטה ו vortexer ב μl 400 מתוך חוצץ guanidinium thiocyanate (GTC) (4.5 מ 'guanidinium thiocyanate, 2% N-lauroylsarcosine, 50 מ"מ EDTA pH 8.25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 מ' בטא mercaptoethanol, antifoam 0.2% א) ב RT, עובר מספר פעמים באמצעות מזרק המזרק (29G) (איור 2). פיצול lysate לחלקים שווים, הן RNA ו-DNA עשויה לחלץ בו זמנית או בנפרד, בהתאם לצרכים ניסויים מסוימים. לטיהור RNA להוסיף נפח 1/10 של NaOAc, 1 AquaPhenol נפח (Appligene) (pH 4) ו 1/2 נפח של כלורופורם: isoamyl (24:1) כדי lysate. מערבולת במרץ לאחר כל שלב ודגירה על קרח 10 דק ', צנטריפוגה (20 דק' ב גרם 10000 ב 4 ° C), מוסיפים נפח שווה של 70% EtOH לשלב aequous. להעביר את התערובת לעמודה ספין RNA (למשל Nucleospin RNA II מ-Macherey נגל) ולבצע צעדים על עמודות DNase-העיכול כביסה (אחרי פרוטוקול של היצרן); elute RNA של 25 μl H 2 O. לטיהור DNA פרוטוקול אופטימיזציה של דם Qiagen DNeasy וקיט רקמות משמש. לאזן lysate עם כמויות שוות של מאגר AL ו EtOH 100%, עומס על צנטריפוגות טור ספין (1 דקות ב g 10,000 ב RT) וזורקים זרימה דרך. הוסף 500 μl מאגר AW1 כולל 5 RNAse μl (1 מ"ג / מ"ל) לעמודה ו דגירה 10 דקות ב RT. ספין (1 דקות ב 10,000 גרם, RT) וזורקים זרימה דרך. לשטוף את העמודה עם AW2 500 מאגר μl, לבטל את הזרימה דרך ספין יבש העמודה ריקה (1 דקות ב g 15,000). הוסף prewarmed (70 ° C) מאגר AE ו עמודות דגירה של 10 דק 'ב 70 ° C. Elute ידי צנטריפוגה (1 דקות, 10000 ז), להירשם מחדש זרימה דרך וחזור על שלב צנטריפוגה. השתמש ספקטרופוטומטר לקבוע DNA ו-RNA בריכוזים. טיפוסי PVN אגרוף תשואות ~ 600 ng DNA ו ~ 400 ng-RNA. ניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותית (QPCR), אנו משתמשים בדרך כלל ~ 100 ננוגרם של רנ"א בתגובה שעתוק לאחור. 4. Bisulfite המרה Bisulfite נתרן משמש להמיר לא מפוגל cytosines כדי uracils. לעומת זאת, cytosines מפוגל מוגנים מפני המרה. לכן, כל cytosines אשר זוהה רצף סופי של bisulfite PCR-amplicon מייצגים cytosines מפוגל. ההמרה bisulfite גורם השפלה DNA משמעותית וזה יכול להיות הגורם המגביל בסופו PCR. התנאים התגובה מיטבית למקסם המרה ציטוזין, להפחית את פיצול ה-DNA ולשמר חד גדילי ה-DNA גם בטמפרטורות נמוכות יותר ניתן להשיג באמצעותQiagen של ערכת EpiTect bisulfite. בידינו ~ 200 ng של DNA מטוהרים מן micropunches לספק כמות מספקת של חומר המוצא לתגובה bisulfite. כדי למנוע הבדלי יעילות ההמרה של תגובה, כמות ה-DNA תבנית יש לשמור קבוע בין כל דגימות שעובדו במהלך הניסוי. בנוסף, רצף קורא יש בחן את יעילות ההמרה על ידי בחינת שיעור הלא המרה למוצרי CpGs שאינם. שיעור זה יעלה על 98%. ערכים נמוכים מצביעים על ההמרה bisulfite לא שלם או לא יעיל ואת רצפי הבסיס צריך להיות נכלל באנליזה. 5. Bisulfite PCR Bisulfite עיצוב רצף פריימרים ספציפיים ל-DNA bisulfite המרה (ראה דיון) מתיל פריימר Express תוכנה ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ En / ארה"ב / adirect / AB? Cmd = catNavigate2 & catID = 602121) יסייעו זה לעזור לקבוע חישול בטמפרטורה אופטימלית בניסויים טייס. הכן PCR-Master-Mix (לתגובה 1) כדלקמן: 2.5 μl חיץ 10x PCR 0.5 μl 10 מ"מ dNTPs 1 μl 10 מיקרומטר קדימה פריימר 1 μl 10 מיקרומטר הפוך פריימר 0.125 μl Qiagen Hotstart Taq פלוס למלא עד 23 μl עם H 2 O הוסף 2 DNA μl bisulfite שטופלו לתגובה. להגביר את השימוש בתנאים הבאים: 1 מחזור 6 דקות 95 ° C 45-50 מחזורים של 1 דק '95 ° C, 1 דקות בטמפרטורה אופטימלית, חישול 1 דקות 72 ° C מחזור 1 5 דקות 72 ° C ניתוח 7 μl של מוצר ה-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose לאמת את גודל amplicon ולטהר תגובת PCR שנותר קשירת לאחר שימוש זמינה באופן מסחרי PCR ניקוי הערכה (למשל Macherey-Naג'ל Nucleospin חלץ). במקרה מוצרים נוספים לא רצויים ה-PCR מתקבלים, טיהור ג'ל מומלץ. 6. Bisulfite הרצף ברזולוציה גבוהה מתילציה בדנ"א פרופילים מוסק מקריאות לשבט אחד יכול לזהות שינויים קטנים מתילציה דנ"א ולזהות אזורים רגולטוריים, כי הם מגיבים לטיפול (תכנות סביבתי). תהליך סידור bisulfite מורכב משלושה שלבים עבודה רצופות. ראשית, מוצרי ה-PCR מתקבל על ידי bisulfite PCR לפני הם ligated לתוך וקטור והפכו חיידקים. שנית, המושבה PCR מ שיבוטים אחד מועסק על מנת לקבוע את הגודל הנכון של הכנס. שלישית, PCRs המושבה חיוביות מנקים מעלה נתון התגובה Big-דיי רצף. לאחר שלב ניקוי, מוצרים electrophoresed ברצף על נימי. 6.1 קשירת ושינוי הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי pGEM-T וקטור CLoning KIT (Promega). מניסיוננו, יעילות שיבוט תלוי באופן קריטי על הוספה להיות ligated. וקטורים שונים יש לבדוק במקרה מספרים נמוכים של שיבוטים רקומביננטי מתקבלים שוב ושוב. הגדר את התגובה קשירת: 5 μl קשירת 2x מאגר 1 μl pGEM-T וקטור 1 μl T4-האנזים 3 μl ניקה-PCR את המוצר מערבבים תגובה על ידי pipetting ו דגירה על הלילה 4 ° C. הערה: קשירת יכול גם להתבצע על 1 H ב RT גם כן. כדי להגדיל את מספר שיבוטים רקומביננטי, על קשירת הלילה 4 מעלות צלזיוס הוא המועדף. נקה-up של מוצרים קשירת ידי משקעים אתנול: הוסף 1 גליקוגן μl, 1 μl 3M NaAc ו 25 EtOH 100% μl לתגובה קשירת ופתאומי דקות 1 בחנקן נוזלי. צנטריפוגה (15,0000 גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C) וזורקים supernatant. לשטוף עם μl 300EtOH 70% ו צנטריפוגה (15,000 גרם של 20 דקות ב 4 ° C), למחוק גלולה supernatant ויבש ב RT (10 דקות). Resuspend גלולה ב 10 μl H 2 O. 6.2 שינוי של מוצרים קשירת חיידקים electrocompetent Precool electroporation cuvettes (1 מ"מ רוחב) על קרח aliquot ההפשרה של חיידקים DH5α electrocompetent על הקרח. הוסף 45 μl חיידקים DH5α ל μl 10 ניקה המוצר קשירת (ראה לעיל) ולהעביר את קובט. להפוך חיידקים על 1.5 kV, 200 Ω, 15 μF ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום SOB prewarmed מיד לאחר הלידה הדופק. שחזור חיידקים על 1 ח ב 37 ° C, להפיץ 100 μl של השעיה על LB / צלחות ampicillin מצופה IPTG / X-Gal. דגירה צלחות לילה ב 37 מעלות ג 6.3 המושבה PCR הערה: המושבה PCR מ שיבוטים בודדים מתבצע על מנת להבטיח מוסיף כי הםגודל חזה. התפתחות מאוחרת של צבע סינון כחול / לבן, אירועי רקומבינציה לא רצויים במהלך קשירת, שילוב של זוגות פריימר oligomeric או חתוכים מוצרי ה-PCR יכול אחרת להוביל לתוצאות רצף פגומים. אנו משתמשים באופן שגרתי T7 ו SP6 primers להגביר מוסיף משובטים; זה תוצאות הגישה וקטור רצפים נוספים של כ -150 נ"ב. פריימר T7 משמש בתגובה רצף בשלב מאוחר יותר. הגדרת המושבה PCR התגובה בצלחת 96-היטב. ראשית התגובה להשתמש: 3 μl 2.5 מ"מ MgCl 2 2.5 μl חיץ 10x Taq 1.5 μl 10 mM dNTP 2 μl 2.5 מ"מ פריימר T7 2 μl 2.5 SP6 mM פריימר 1 פולימראז μl Fermentas Taq למלא עד 25 μl עם H 2 O לוותר על 25 μl / גם תמהיל אמן זה לתוך זה גם צלחת 96-היטב. בחר שיבוט חיובית (לבן) מהצלחת עם קצה פיפטה ולטבול את התגובה PCR. להגביר באמצעות תחשיב היחסים הגועות תנאים: מחזור 1 4 דק 'ב 95 ° C 10 מחזורים 30 של ב 94 ° C, 30 ב של 56 מעלות צלזיוס ו -30 של ב 72 ° C 30 מחזורים 30 של ב 94 ° C, 30 ב של 48 מעלות צלזיוס ו -30 של ב 72 ° C מחזור 1 5 דק 'ב 72 ° C טען 5 μl של המושבה PCR על ג'ל agarose ולקבוע תגובות שמכילות את גודל הוסף הנכון. PCRs מושבה המכילים את amplicons הרצויות ניקה באמצעות ערכת זמינים מסחרית (Machery נגל Nucleofast). 6.4 Big-דיי שליחות קטלנית התגובה סידור להכין תערובת אב התגובה Big-דאי. ראשית התגובה להשתמש: 1 μl H 2 O 0.5 מגיב μl Big-דיי 1.5 רצף μl חיץ לוותר על 3 μl / היטב היטב כל צלחת 96-ובכן, זה גם להוסיף 2 μl של המוצר ניקה המושבה PCR ולהפעיל תגובה על thermocycler עם הפרמטרים הבאים: <p class="jove-content"> 1 1 מחזור דק 'ב 96 ° C 35 מחזורים של של 10 על 96 מעלות צלזיוס, 5 שניות ב 50 מעלות צלזיוס, 4 דק 'ב 60 ° C התגובה Big-דאי הוא ניקה באמצעות ערכת מסחרי (Millipore Montage 96 סידור ניקוי קיט) ומעובדים על נימי ברצף (למשל ABI 3100-DNA). רצפים מנותחות באמצעות מנתח Biq ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) או בכלי BISMA באינטרנט ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) לגזור את תבנית המתילציה של הדנ"א באזור נחקר (איור 4). 7. נציג תוצאות כדי לקבל תובנות לגבי ההשפעה של ELS על הביטוי AVP ומצב מתילציה, עכברים C57BL/6N עובדו על פי זרימת העבודה המתוארת לעיל. בקיצור, קבוצה של עכברים C57BL/6N היה שלubjected כדי ELS ואילו קבוצת הביקורת נותרה ללא הפרעה. PVN ואת הגרעין supraoptic (בנו) היו באגרופים DNA ו-RNA נותקו זמנית מן המכות בודדים. רנ"א הוא עיבד לאחור לרמות של תמלילי AVP נמדדו על ידי ניתוח QPCR ו מנורמל לביטוי של Hprt וגנים Gapdh משק הבית. ה-DNA היה bisulfite מטופלים, מוגבר עם פריימרים ספציפיים משפר AVP (איור 4 א) ואת מוצרי ה-PCR היו משובטים ואת רצף. לפחות 20 שיבוטים רקומביננטי של כל עכבר / PCR נותחו על מנת לקבוע תדרים מתילציה עבור CpGs הכלולים amplicon PCR (תרשים 4 ב). בהשוואה לקבוצת הביקורת, ELS המושרה hypomethylation משמעותית על CpG10, CpG12, CpG13 ו Cpg14 של משפר AVP (p <0.05, N = 6-8 בעלי חיים) מציע epigenetic סימון של אזור זה הרגולטורית באמצעות מוקדם חוויות החיים. בניגוד מתילציה PVN, שלמשפר AVP היה מושפע ELS ב ספציפיות הממחישות רקמות בן סימון epigenetic (איור 4C). ניתוח מצב מתילציה בדנ"א ב CpG10 וביטוי AVP גן חיות בקרת (n = 6) שמעידים על מתאם שלילי מצביע על תפקיד המתילציה של הדנ"א כוונון עדין של ביטוי גנים AVP (איור 4D). Micropunches באיור 1. מתקבלים המוח גזור מן מלאה בתחילת החיים עכברים הדגיש. בעקבות ה-DNA ו-RNA בידוד, ביטוי גנים נקבע על ידי qRT-PCR תוך ה-DNA bisulfite טיפול מוגבר ומוצרי מטוהרים הם משובטים בזיהוי וקטור מתאים המאפשר של שיבוטים רקומביננטי ידי בחירה כחול / לבן. גדלים להוסיף נכון מאומתים על ידיהמושבה PCR לפני ביצוע Big-דיי התגובה ועיבוד ברצף על נימי. דגם המתילציה הם דמיינו ידי כלי התוכנה המתאים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה . איור 2. ציר הזמן של מיצוי DNA / RNA כדי סידור bisulfite. איור 3. זרימת עבודה להפקת סימולטני של DNA ו-RNA. אגרוף של הגרעין ההיפותלמוס paraventricularis, גן AVP זעיר להביע באזור המוח, ממוקם מאגר GTA 400 μl, vortexed עד שיבשו, ומעורים יותר על ידי עובר דרך מזרק (29G). Homogenate מפוצל אז לטיהור של RNA ו-DNA. הפיצול יכול להיות 1:1 או בממדים שונים בהתאםעל השאלה הניסוי בפרט. Homogenates אמורה להתבצע תוך שעות ספורות. איור 4. מתילציה CPG ב לוקוס AVP בשליטה שבועות 6 הישן חיות רכבות עיליות. () תוכנית של הזנב AVP וגנים האוקסיטוצין חוקיים אל הזנב מופרדות באזור intergenic (IGR). אקסונים מתוארים על ידי פתוחים (הממוספרים) תיבות. הפצה של שאריות CPG מצוין ואת הגודל והמיקום של amplicon PCR בהתאמה המכיל CPG 10 עד CpG14 מסומן קו מודגש. (ב) מתילציה של AVP משפר ב PVN בחיות בקרה ELS (n = 6-8). (ג) מתילציה של AVP משפר בבן בשליטה חיות רכבות עיליות (n = 8-10). (ד) ביטוי AVP הגן היתה בקורלציהעם מתילציה ב CpG10 (n = 6). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .