Ein optimierter Workflow, um DNA-Methylierung und Veränderungen der Genexpression auf Early-Stress Leben zu studieren gezeigt wird. Ausgehend von mütterlicher Trennung von neugeborenen Mäusen und Isolierung von diskreten Hirngewebe, vertreten wir ein Protokoll, um gleichzeitig zu isolieren DNA und RNA aus Hirngewebe Schläge für nachfolgende Bisulfit-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.
Die Exposition gegenüber Diät, können Medikamente und frühes Leben Widrigkeiten während der sensiblen Fenstern des Lebens 1,2 zu nachhaltigen Veränderungen in der Genexpression, die zur Darstellung von physiologischen und Verhaltens-Phänotypen beitragen führen. Solche Umwelt-Programmierung geeignet ist, die Anfälligkeit für Stoffwechsel-, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und psychische 3,4 zu erhöhen.
DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen sind wichtige Prozesse in der Vermittlung der Gen-Umwelt-Dialog berücksichtigt und erscheinen auch auf Umwelt-Programmierung zu unterlegen 5. Bei Säugetieren, DNA-Methylierung in der Regel umfasst die kovalente Addition einer Methylgruppe an der 5-Position von Cytosin im Kontext der CpG Dinukleotide.
CpG methyliert in einem hoch-Gewebe und Zell-spezifischen Weise so dass es eine Herausforderung, um diskrete, kleine Regionen des Gehirns, wo zellulären Heterogenität ist hoch und Gewebe Menge beschränkt zu studieren. Darüber hinaus beil Genexpression und Methylierung eng miteinander verknüpft Ereignisse, können erhöhte Wert durch den Vergleich beider Parameter in der gleichen Probe gewonnen werden.
Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll (Abbildung 1) für die Untersuchung der epigenetischen Programmierung im Gehirn präsentiert mit der "mütterlichen Trennung 'Paradigma der frühen Leben Widrigkeiten zu illustrativen Zwecken. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von micropunches von differentiell Alters Mäusehirnen, aus denen DNA und RNA gleichzeitig isoliert werden können, so dass DNA-Methylierung und Genexpressionsanalysen in der gleichen Probe.
Epigenetischen Programmierung wird zunehmend als wichtiger Mechanismus zugrunde liegen, Gesundheit und Krankheit anerkannt. Hier präsentieren wir eine verfeinerte Methode zur simultanen Isolierung von DNA und RNA aus micropunches und die nachfolgenden Schritte, um DNA-Methylierungs-Profile durch Bisulfit-Sequenzierung zu erhalten. Der optimierte Workflow ermöglicht eine bequeme Analyse der epigenetischen Programmierung im Gehirn als Reaktion auf Reize aus der Umwelt. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz für die Untersuchung von den funktionalen Zusammenhang zwischen DNA-Methylierung und Genexpression sowohl aus derselben Probe analysiert. Schließlich kann der Tiernummer für das Experiment benötigten signifikant reduziert werden.
Bestimmte Vorsichtsmaßnahmen und Richtlinien zu befolgen, während Sie die Workflow vorgestellt werden. Angesichts der außerordentlichen Komplexität und Heterogenität des Gehirns und da-Methylierung und Expression kann in einem Zell-und Gewebe-spezifische Weise zu variieren ist es von größterwichtig, dass micropunching in einer standardisierten Art und Weise durchgeführt. Als Beispiel hierfür wird epigenetische Programmierung von AVP in der paravaventriuclar nachgewiesen, aber nicht im Nucleus supraopticus (4b-d), Expression zweier Avp Regionen des Hypothalamus 4. In dieser Hinsicht ist die Verfügbarkeit von DNA und RNA aus der gleichen Gewebestanze vorteilhaft, da RNA Expression bestimmter Gewebe-spezifischen Markergene kann in einigen Fällen verwendet werden, zu bestätigen, dass der richtige Bereich gestanzt wurde. Obwohl micropunching zellulären Heterogenität reduzieren kann, ist zu bedenken, dass dieser Ansatz nicht auf die Isolierung einzelner Zelltypen oder Populationen führen kann. Zusätzliche Reinigung Schritte könnten erwogen werden, um dieses Thema anzugehen.
Für eine optimale Bisulfit-Sequenzierung Primer-Design für die PCR-Amplifikation folgenden Bisulfit-Behandlung ist unerlässlich. PCR-Produkte von mehr als 400 bp Länge kann problematisch sein, infolge des Abbaus von DNA durch bisulfite Behandlung. Es sollte auch beachtet werden, dass nested PCR kann verzerrten Ergebnissen führen, wenn nur noch wenige intakte Vorlagen zur Verstärkung beitragen. Primerpaare, die spezifisch für das modifizierte Amplikon sind gestaltet werden sollte, ihre Sequenzen sollten keine CpG-Dinukleotide, um Methylierung vorgespannte Verstärkung zu vermeiden. Darüber hinaus sollte Primer enthalten nicht-CpG Cytosine um die Amplifikation von nicht modifizierten oder nicht vollständig umgesetzte DNA zu verhindern. Verstärkung von einigen Vorlagen kann von der Durchführung von Hot-Start PCR profitieren. In jedem Fall sollte die Eignung von Primerpaaren in Pilot-Experimente verifiziert werden, so Verderb von wertvollen experimentellen Proben zu verhindern.
Bisulfit-Sequenzierung stellt eine Standardmethode für die ortsspezifische Methylierungsanalyse, wie es in der Lage, zuverlässig und präzise erkennen die Methylierung von CpG einzigen Rückstände in einer Allel-spezifischen Art und Weise 8 ist. Direkte Sequenzierung des PCR-Produkt wird nicht als gemischte Methylierung o empfohlenfa CpG Rest wird als C / T Doppel-Peak im Elektropherogramm, die Quantifizierung der Methylierung am betreffenden Standort kann verhindern, erscheinen. Aus diesem Grund eine Zwischenschicht Klonierung durchgeführt wird, und mehrere Klone sequenziert (~ 20-30), um das Ausmaß der Methylierung zu bestimmen. Pyrosequenzierung stellt eine alternative Methode zur Quantifizierung von DNA-Methylierung. Außerdem verwendet Bisulfitumwandlung und Bisulfit PCR sondern der Klonierung und Sequenzierung das Amplifikat, um eine direkte Reaktion, bei der Pyrosequenzierung der Methylierungsstatus einer CpG-Rest als C / T Einzel-Nukleotid-Polymorphismus, der leicht quantifiziert werden kann gelesen werden, unterzogen wird. Beide Methoden ermitteln ähnliches Ausmaß an Methylierung 9, aber da das Klonen-Schritt kann übersprungen werden Pyrosequenzierung ist zeiteffizienter. In Abhängigkeit von der Vorlage nur 40 bis 100 Nukleotide auf einmal sequenziert werden, so dass mehrere Runden der Pyrosequenzierung mit unterschiedlichen Sequenzierprimer erforderlich sind. Dies ist eine kritische Begrenzung, da that höhere Mengen an DNA (ca. 1 pg pro Reaktion) benötigt, was absehbar über die Beträge zur Verfügung, von winzigen Hirngewebe Schläge. So anfängliche Abtasten der Regionen im Bereich von mehreren Kilobasen von Pyrosequenzierung scheint weniger geeignet als einzigen Klon Lesen. Dennoch sollte nach der Identifizierung von einem kleinen Bereich von Interesse Pyrosequenzierung betrachtet werden.
Insgesamt bietet der oben beschriebenen Protokoll eine genaue, effiziente und optimierte Ansatz für die schnelle und kostengünstige Analyse von Gehirn micropunches für epigenetische Veränderungen. Mehrere Proben können in einem einzigen Durchlauf verarbeitet werden und die Verfahren sind geeignet, wenn der Analyse von Proben von mittlerer Größe Experimenten.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Institut für Psychiatrie und der Europäischen Union im Marie-Curie Initial Training Network (NINA Contract 238665) gefördert.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 |
Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 |
Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 |
pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 |
Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 |
Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 |
Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 |
Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |