Summary
初期生活ストレスにDNAメチル化と遺伝子発現の変化を研究するために合理化されたワークフローが表示されます。新生児マウスと離散の脳組織の分離の母子分離から始めて、我々は同時に、その後の重亜硫酸塩シークエンシングおよびRT-PCR解析のための脳組織のパンチからDNAとRNAを単離するためのプロトコルを表します。
Abstract
食事療法への曝露は、人生の1,2の敏感な窓の間に薬剤および初期生活逆境は、生理学的および行動表現型のディスプレイに寄与する遺伝子発現の持続的な変化につながる可能性があります。そのような環境のプログラミングは、代謝、心血管疾患および精神疾患3,4に対する感受性を増加させる可能性があります。
DNAメチル化とヒストン修飾は、遺伝子と環境の対話の仲介に主要なプロセスを考慮し、環境のプログラミング5アンダーレイにも表示されています。哺乳類では、DNAメチル化は通常CpGジヌクレオチドのコンテキスト内でのシトシンの5位のメチル基の共有結合的付加を有する。
CpGメチル化は細胞の不均質性が高く、組織の量が制限され、脳の離散的な、小さな領域を研究するために挑戦すること非常に組織および細胞特異的に発生します。また、Because遺伝子発現とメチル化が密接にリンクされているイベントは、増加値は、同じサンプルで両方のパラメータを比較することによって得ることができる。
ここでは、脳内のエピジェネティックなプログラミングの調査のためのステップバイステップのプロトコル（ 図1）は 、例示目的のために初期生活逆境の"母子分離"パラダイムを使用して提示されます。プロトコルは、このように、同じサンプル中のDNAメチル化と遺伝子発現解析を可能にする、DNAおよびRNAを同時に分離することができ、そこから差動高齢マウスの脳からmicropunchesの準備について説明します。
Protocol
1。初期生活逆境によるプログラミング
母子分離（MS）は時限妊娠C57BL/6Nマウス（誕生日の生後0日（P0））によって提供される仔の早期寿命のストレス（ELS）を誘導するために実行されます。
- 個々のリットルは、P1-10から3時間、毎日のために（加熱パッド付き）クリーンケージに配置されます。
- コントロール（非ELS）仔は全体の母体巣に邪魔されずに残っています。
- 子犬は、それらが標準的な実験動物の飼育条件の下で性別をマッチさせたグループ（ケージあたり3から5匹）に収容されている時間が経過した後、（P21）離乳するまで母親と一緒に保管されています。
2。脳組織の分離と解剖
- マウスは頚椎脱臼に注意して所望の年齢で殺されています。このプロトコルはストレスパラダイムが含まれるため、全く麻酔はストレスホルモンの正常な生理的規制と干渉を避けるために、頸椎脱臼する前に指定されていません。頭蓋骨が開かれ、脳は、-80℃で保存される前に、ISO-ペンタンドライアイスに浸漬することにより注意深く除去し、すぐにスナップ凍結されている
- ブレインズ（10μmの厚さ）は凍結切片であり、セクションでは、Superfrostガラススライド上にマウントされ、-20℃で維持されますPVN - -吻側PVNのレベルから始まるセクションを収集し、ブレグマ標準のマウス脳地図（例えばPaxinos 6）への参照は、解剖学的精度を検証し、関心領域（室傍核のニューロンのために例えば含めることを確保するために使用され-0.75 -0.85まで）。
- セクションは、異なる脳の構造の識別を容易にするために、クレシルバイオレットで染色されています。関心領域のパンチ（0.8 mm）を（例えば、PVN） ロコマイクロダイセクションにすることによって得られる。
3。脳のパンチからの核酸抽出
同時に小さなneuroanatomically定義脳レジスタからDNAやRNAを抽出するための最適化プロトコル亜硫酸水素塩と遺伝子発現解析のためのイオンは7に記載されている。
注意：RNAはGTC-バッファ内のDNAよりも安定であることを考慮し、我々は最初のRNAを処理することをお勧めします。 DNA精製のために使用ホモジネートは、その時間の間に室温（RT）で保管することができます。
- グアニジニウムチオシアネート（GTC）バッファー（4.5 Mグアニジンチオシアネート、2％N-ラウロイルサルコシン、50mMのEDTA pHは8.25 mMトリス塩酸pH7.5、0.1 Mβ-メルカプトエタノール、0.2％消泡剤、400μlのピペットとボルテックスを使用してパンチをホモジナイズA）室温で、皮下注射器（29G）（ 図2）を数回通過する。
- 等分ライセートを分割し、RNAおよびDNAの両方は、特定の実験的なニーズに応じて、別々に同時に抽出したりすることができます。
- イソアミルアルコール（24:1）ライセートに：RNA精製のためのNaOAcの1月10日ボリューム、1ボリュームのAquaPhenol（Appligene）液（pH 4）とクロロホルムの1/2のボリュームを追加します。精力的に各ステップの後にボルテックスし、10分間、遠心分離（4℃万グラム℃で20分）氷上でインキュベートする。aequous相に70％エタノールの等量を追加します。
- RNAスピンカラム（マシュレ·ナーゲルから、例えばNucleospin RNA II）に混合物を移し、カラム上のDNase消化、洗浄の手順を実行します（製造元のプロトコールに従ってください）を実行し、25μlのH 2 Oで溶出したRNA
- DNA精製のためにQiagen社DNeasy血液·組織キットの最適化されたプロトコルが使用されます。 、バッファALの等量と100％EtOHでライセート平衡スピンカラムの遠心分離上の負荷（RTで10,000 gで1分間）、およびフロースルー廃棄します。
- 列に5μlのRNase（1 mg / ml）を含む500μlのBuffer AW1を追加し、室温で10分間インキュベートする。スピン（10,000 gで1分間、RT）とフロースルーを捨てる。
- 500μlのBuffer AW2でカラムを洗浄し、フロースルー、スピン乾燥した空の列（15,000 gで1分間）破棄します。
- 追加温め（70℃）70℃のバッファAEと10分間インキュベートするカラム℃、 （1分間遠心分離して溶出する、10,000 g）を、フロースルーを再適用し、遠心分離工程を繰り返します。
DNAおよびRNA濃度を決定するために分光光度計を使用しています。典型的なPVNパンチ利回り〜600 ngのDNAと〜400 ngのRNA。定量PCR（qPCR）による遺伝子発現解析のために、私たちは一般的に逆転写反応においてRNAの〜100 ngを使用しています。
4。 Bisulfite変換
亜硫酸水素ナトリウムは、ウラシルへの非メチル化シトシンを変換するために使用されています。対照的に、メチル化シトシンは変換から保護されています。したがって、亜硫酸PCR-増幅産物の最終的なシーケンスに検出されているすべてのシトシンがメチル化シトシンを表しています。
Bisulfite変換は、PCR解析では制限要因になります実質的なDNA分解を引き起こします。 、シトシンの変換を最大化するDNAの断片化を削減し、より低い温度でも一本鎖DNAを維持するため最適化された反応条件は、使用して達成することができキアゲン社のプロトコールとトラブルシューティング後、Bisulfiteキット。 micropunchesから精製したDNAの我々の手に〜200 ngのBisulfite反応の出発物質の十分な量を提供しています。
変換反応の効率の違いを防ぐために、テンプレートDNAの量は、実験中に処理されたすべてのサンプル間で一定に保たれるべきである。さらに、シーケンスを読み取り、非変換の非CpGの割合を調べることにより、変換効率のために精査する必要があります。この率は98％を超えている必要があります。低い値は、不完全なまたは非効率的なBisulfite変換を示しており、基本的なシーケンスは解析から除外する必要があります。
5。亜硫酸PCR
- DNAを亜硫酸水素塩変換に固有のプライマーを設計シーケンス亜硫酸（説明を参照してください）。メチルプライマーエクスプレスソフトウェア（ https://products.appliedbiosystems.com/ab/ EN /米国/ adirect / AB？CMD = catNavigate2＆catIdを= 602121）は、これを支援するため、パイロットの実験で最適なアニーリング温度を決定するのに役立ちます。
- 次のように、PCRマスターミックス（1反応）の準備をします。
2.5μlの10×PCRバッファー
0.5μLの10 mMのdNTP
1μlの10μMフォワードプライマー
1μlの10μMリバースプライマー
0.125μlのキアゲンHotStartのポリメラーゼプラス
H 2 Oで23μlに埋める - 反応液に2μlの亜硫酸水素塩処理DNAを追加します。
- 以下の条件を使用して増幅する。
1サイクル6分95°C
1分95℃、最適なアニーリング温度で1分間、1分72℃の45から50サイクル
1サイクル5分72℃
アンプリコンのサイズを確認し、市販のPCRクリーンアップキット（例えばマシュレ-Naを用いてライゲーションの残りのPCR反応液を精製するためにアガロースゲル電気泳動によってPCR産物7μlを分析するゲルNucleospinエキス）。追加の不要なPCR産物が得られた場合には、ゲル精製を推奨します。
6。亜硫酸水素シーケンス
単一クローンの測定値から推定した高解像度のDNAメチル化プロファイルは、DNAメチル化の小さな変化を検出し、治療（環境プログラミング）に応答する調節領域を識別することができます。バイサルファイトシーケンシングプロセスは3つの連続した作業工程を含む。まず、前の亜硫酸PCRによって得られたPCR産物をベクターに連結し、細菌に変換されます。第二に、単一のクローンからのコロニーPCRは、インサートの正しいサイズを決定するために採用されています。第三に、正のコロニーPCRはクリーンアップとビッグ色素クエンシング反応に供されています。クリーンアップ手順に続いて、製品はキャピラリーシーケンサー上で電気泳動されています。
6.1ライゲーションとトランスフォーメーション
注：私達は日常的にpGEM-TベクターCLを使用しoningキット（プロメガ社製）。我々の経験では、クローニング効率がライゲーションされるインサートに決定的に依存しています。異なるベクターは、組換えクローンの低い数字が繰り返し得られた場合にテストする必要があります。
- ライゲーション反応を設定します。
5μlの2×ライゲーションバッファー
1μlのpGEM-Tベクター
T4-リガーゼ1μlの
3μlのクリーンアップのPCR産物 - 4℃で一晩ピペッティングとインキュベートすることにより反応を混ぜる℃に
注：ライゲーションにも同様に室温で1時間実施されることがあります。 4時夜のライゲーションを介して、組換えクローンの数を増やすには°Cが好ましい。
- エタノール沈殿によりライゲーション産物のクリーンアップ：
- 1μlのグリコーゲン、1μlの3M NAACと液体窒素中で1分間ライゲーション反応、沈殿物に25μlの100％EtOHを追加します。
- 遠心分離（4℃、30分間15,0000グラム°C）、上清を捨てる。
- 300μlで洗浄70％エタノール及び遠心（4℃、20分間15000グラム°C）、（10分）上清を室温で乾燥したペレットを捨てる。
- 10μlのH 2 Oでペレットを再懸濁し
エレクトロ細菌のライゲーション産物6.2変換
- 氷上のエレクトロDH5α細菌の氷の融解のアリコートに発送前に冷凍するエレクトロポレーションキュベット（1mmの幅）。
- ライゲーション産物のクリーンアップを10μl（上記参照）に45μlのDH5α細菌を追加し、キュベットに移す。
- 1.5 kVの、200Ω、15μFで細菌を形質転換し、直接パルスの配信後に温めておいたSOB培地1 mlを加える。
- 37°Cで1時間のために細菌を回収し、IPTG / X-galで被覆されたLB /アンピシリンプレート上に懸濁液100μlを広げた。
- 37℃で一晩インキュベートし、プレート℃、
6.3コロニーPCR
注：単一のクローンからのコロニーPCRは挿入があることを保証するために行われている予測されたサイズの。青/白スクリーニング、ライゲーション、オリゴマーのプライマーペアの定款又は切り捨てられたPCR産物中に望ましくない組換え事象からの遅延の発色は、特に障害のあるシークエンスの結果につながる可能性があります。我々は定期的にクローン化インサートを増幅するためにT7およびSP6プライマーを使用し、約150 bpの付加的なベクトル配列のこのアプローチの結果。 T7プライマーは後のステップでシークエンシング反応に使用されています。
- 96ウェルプレートでコロニーPCR反応を設定します。一つの反応用：
3μlの2.5mMのMgCl 2を
2.5μlの10×Taq緩衝
1.5μlの10mMのdNTPの
2μlの2.5mMのT7プライマー
2μlの2.5mMのSP6プライマー
1μlのFermentas Taqポリメラーゼ
H 2 Oで25μlに埋める - 96ウェルプレートの各ウェルにマスターミックス25μl/ウェルを分注する。
- PCR反応にピペットチップとディッププレートから正（白）クローンを選択します。
- 次式を用いて増幅lowing条件：
95℃で1サイクル4分°C
94℃10サイクル30秒°C、56℃で30秒72℃、30秒°C
94℃30サイクル30秒°C、48℃で30秒72℃、30秒°C
72 1サイクル5分°C - アガロースゲル上でコロニーPCRの5μlをロードして、右のインサートサイズを含む反応を決定します。
- 希望するアンプリコンを含むコロニーPCRは市販のキット（MacheryナーゲルNucleofast）を使用してクリーンアップされます。
6.4ビッグダイターミネーター反応とシーケンシング
- ビッグ·色素反応のためのマスターミックスを調製する。一つの反応用：
1μlのH 2 O
0.5μlのビッグ色素試薬
1.5μlのシークエンシング·バッファ - 各ウェルにクリーンアップコロニーPCR産物2μlを追加し、次のパラメータを持つサーマルサイクラーで反応を実行するには、μL/ウェル、96ウェルプレートの各ウェルに3分配する。 60°Cで96 50℃、5秒℃、4分10秒の35サイクル
- ビッグ·色素反応は、市販のキット（ミリポアモンタージュ96シーケンスのクリーンアップキット）を使用して、クリーンアップとキャピラリーシーケンサー（例えば、ABI 3100 DNA）上で処理されます。
- 配列は、BIQアナライザ（使用して分析されていhttp://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ）またはオンラインツールビスマ（ http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/を ）調査DNA領域（ 図4）のメチル化パターンを導出する。
7。代表的な結果
AVPの発現とメチル化状態にELSの影響への洞察を得るために、C57BL/6Nマウスは、上述したワークフローに従って処理されました。簡潔に、C57BL/6Nマウスのグループは、sであった対照群は静置している間にELSにubjected。 PVNと視索上核（SON）がパンチされたDNAとRNAは、単一のパンチから同時に分離された。 RNAを逆転写され、AVP転写物のレベルは、qPCR解析とHPRTおよびGAPDHハウスキーピング遺伝子の発現に正規化を用いて測定した。 DNAは、AVPエンハンサー（ 図4a）と、PCR産物に特異的なプライマーで増幅し、亜硫酸水素塩処理したクローニングし、塩基配列を決定した。各マウス/ PCRから少なくとも20組換えクローンをPCRアンプリコン（ 図4b）に含まれているのCpGのメチル化の頻度を決定するために分析した。コントロールと比較して、ELSは、早期の生活体験を通して、この調節領域のマーキングエピジェネティックな示唆CpG10、CpG12、CpG13とAVPエンハンサーた（p <0.05、n = 6〜8で動物）のCpg14で有意低メチル化を誘導した。 PVNとは対照的に、メチル化AVPエンハンサーは、エピジェネティックなマーキングの組織特異性（ 図4c）を示すSONのELSによる影響を受けなかった。 CpG10とAVP遺伝子発現制御動物でのDNAメチル化状態の解析（n = 6）のAVP遺伝子の発現（ 図4d）の微調整におけるDNAメチル化の役割を指している負の相関が明らか。
図1。Micropunchesは、コントロールと早期寿命を強調したマウスからの解剖脳から取得されます。亜硫酸水素塩処理したDNAを増幅し、精製されている間、DNAおよびRNAの単離、遺伝子発現を定量RT-PCRによって決定されます続いて、製品は青/白選択することにより組換えクローンの同定を可能にする適当なベクターにクローニングされています。正しい挿入サイズはによって確認されキャピラリーシーケンサーのビッグ·色素反応と処理を行う前にPCRコロニー。メチル化パターンは、適切なソフトウェアツールにより可視化しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2 DNA / RNA抽出から亜硫酸シークエンシングにタイムライン。
図3 DNAとRNAの同時抽出のためのワークフロー。 paraventricularis視床下部核、脳の領域を表現する小さなAVP遺伝子のパンチは破壊し、さらにシリンジ（29G）を通過することによって均質化されるまでボルテックスし、400μlのGTAのバッファに置かれます。ホモジネートは、その後RNAおよびDNAの精製のために分割されています。分割は1:1または応じて異なる割合のことができます特定の実験的な質問で。ホモジネートを数時間以内に処理する必要があります。
図4。6週齢コントロールとELS動物のAVP遺伝子座におけるCpGメチル化。 （A）AVPとオキシトシン遺伝子指向尾-尾のスキームと遺伝子間領域（IGR）で区切られています。エクソンはopen（番号）のボックスで示されている。のCpG残基の分布が示されているとCpG14にCpGの10を含むそれぞれのPCRアンプリコンのサイズと位置は太線でマークされています。制御およびELS動物のPVNにおけるAVPエンハンサーの（B）メチル化（N = 6-8）。制御およびELS動物のSON（N = 8-10）におけるAVPエンハンサーの（C）メチル化。 （D） のAVP遺伝子発現は相関していたCpG10におけるメチル化（n = 6）であった。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
Discussion
エピジェネティックなプログラミングがますます重要なメカニズムの基礎となる健康と病気として認識されています。ここでは、micropunchesと亜硫酸塩シークエンシングによってDNAメチル化プロファイルを取得するために後続の手順からDNAとRNAの同時分離のための洗練された手法を提案する。最適化されたワークフローは、環境刺激に応答して、脳内のエピジェネティックなプログラミングの便利な分析を行うことができます。また、このアプローチは、両方が同じサンプルから分析されるDNAメチル化と遺伝子発現との間の関数関係の調査を容易にします。最後に、実験に必要な動物数を大幅に削減できます。
提示したワークフローを実行中に特定の注意事項およびガイドラインに従う必要があります。メチル化と発現パターンは細胞および組織特異的に変わることがありますので、特別な複雑さと脳の異質性を考慮し、それが最高のものですmicropunchingが標準化された方法で行われることの重要性。ポイントのケースとして、AVPのエピジェネティックなプログラミングがparavaventriuclarではなく、視索上核（ 図4b-d）は、視床下部4の2 AVP発現している地域で検出されます。この点では、同じ組織のパンチからDNAとRNAの可用性は、RNAの特定の組織特異的なマーカー遺伝子の発現を正しい領域がパンチされたことを証明するいくつかのケースで使用することができるように有利である。 micropunchingは、細胞の不均質性を減らすことができますが、このアプローチは、単一の細胞型または集団の分離につながるものではないことを覚えなければなりません。追加の精製工程は、このトピックに対処するために考えられるかもしれません。
亜硫酸塩は亜硫酸水素塩処理後のPCR増幅のための最適なプライマー設計をシークエンシングのために不可欠です。長さは400 bpを超えるPCR産物はbでDNAの分解に起因する問題が発生することができisulfite処理。また、わずかそのままテンプレートには、増幅過程に寄与する場合は、入れ子になったPCRは、偏った結果を与えることができることに留意すべきである。変更されたアンプリコンに特異的なプライマーペアを設計する必要があります。その配列はメチル化バイアスの増幅を避けるために、CpGジヌクレオチドを含むべきではありません。さらに、プライマーは修飾されていない、または不完全に変換されたDNAの増幅を防ぐために、非CpGのシトシンを含める必要があります。いくつかのテンプレートの増幅にはホットスタートPCRを実施して恩恵を受ける可能性があります。貴重な実験試料の損傷を防止するためにどのような場合には、プライマーペアの適合性は、パイロット実験で検証する必要があります。
それが確実かつ正確にアレル特異的に8つのCpGの残基のメチル化を検出することができるように亜硫酸シークエンシングは、サイト固有のメチル化解析のための標準的な方法を表しています。 PCR産物のダイレクトシークエンシングは、混合メチル化Oとしてお勧めできませんFA化CpG残基は、当該サイトでのメチル化の定量化を防ぐことができる電気泳動におけるC / T、ダブルピークとして表示されます。この理由のために中間のクローニングステップが行われ、いくつかのクローンを配列決定されている（〜20から30）メチル化の程度を決定する。パイロシーケンシングではDNAメチル化を定量化するための代替メソッドを表します。また、亜硫酸水素塩変換と亜硫酸PCRではなく、クローニングおよびアンプリコンは、CpGの残基のメチル化状態を容易に定量化することができるC / Tの一塩基多型として読まれ、直接パイロシークエンシング反応に供されているシーケンスを利用しています。どちらの方法でも、メチル化9の類似のレベルを検出するがクローニングステップを省略することができるので、パイロシーケンシングでは、より多くの時間が効率的です。ただし、テンプレートに応じてのみ40から100ヌクレオチドが異なるシークエンスプライマーを用いてパイロシーケンシングのいくつかのラウンドが必要であるように一度配列を決定することができます。これは、股関節を考えると、重要な制限事項です。DNAのtより高い量（反応当たり約1μg）を小さな脳組織のパンチから利用可能額を超える予見され、必要とされています。したがって、パイロシーケンシングで数キロの範囲内の領域の最初のスキャンは、単一のクローンの読みとしてはあまり適して表示されます。それにもかかわらず、金利のパイロシーケンシングの小さな領域の識別に以下を考慮する必要があります。
総称して、上記のプロトコルは、エピジェネティックな変化の脳micropunchesの迅速かつ費用対効果分析のために、正確に効率的かつ合理的なアプローチを提供します。複数の標本は、単一の実行で処理し、中間サイズの実験からのサンプルを実行するときの方法が適していることができます。
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、精神医学のマックスプランク研究所と欧州連合（EU）のマリー·キュリー初期研修ネットワーク（NINA契約238665）によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 | |
| Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 | |
| Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 | |
| Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 | |
| Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 | |
| Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 | |
| Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |
References
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