1. Программирование на ранних Беда жизнь Материнская разделения (MS) выполняется, чтобы вызвать в ранний период жизни стресс (ELS) у щенков выступил временном беременных C57BL/6N мышей (постнатальный день 0 (P0) на день рождения). Индивидуальные помета помещают в чистые клетки (с грелку) в течение 3 ч ежедневно с Р1-10. Управления (не ELS) щенки остаются нетронутыми в материнском гнезде во всем. Щенки находятся вместе с матерями до отъема (P21), после чего они помещаются в пол подобранные группы (3-5 мышей в клетке) при стандартных условиях животное лаборатории жилья. 2. Выделение и Препарирование мозга ткани Мыши погибают в возрасте от желаемого шейки дислокации. Примечание: так как этот протокол включает в себя стресс парадигмы, без анестезии дается до шейки дислокацию, чтобы не мешать нормальной физиологической регуляции гормонов стресса. Черепа открыты иМозг осторожно удаляют и сразу же оснастки заморожены погружение в изо-пентан-сухой лед, прежде чем хранили при -80 ° C. Мозг cryosectioned (толщина 10 мкм); разделы монтируются на салазках SuperFrost стекла и поддерживается на уровне -20 ° С. Ссылка на стандартную мышь стереотаксической атлас (например, Paxinos 6) используется для проверки анатомической точностью и обеспечить включение области интересов (например, нейроны в паравентрикулярное ядро – НДС – собрать разделов, начиная с уровня ростральной НДС, брегмы -0,75 до -0,85). Разделы окрашивали крезиловый фиолетовый для облегчения идентификации различных структур головного мозга. Удары (0,8 мм) регионах, представляющих интерес (например, НДС) получены в микродиссекции локомотива. 3. Нуклеиновых кислот из мозга Пуансоны Оптимизированный протокол для одновременного извлечения ДНК и РНК с крошечными neuroanatomically определенные мозга регионов для анализа бисульфит и экспрессии генов описаны 7. Примечание: Учитывая, что РНК менее стабильна, чем ДНК в GTC-буфера, мы рекомендуем обработку РНК, в первую очередь. Гомогената для очистки ДНК можно хранить при комнатной температуре (RT) в это время. Однородный удары с помощью пипетки и vortexer в 400 мкл гуанидиний тиоцианата (GTC) буфера (4,5 М гуанидин тиоцианат, 2% N-lauroylsarcosine, 50 мМ EDTA рН 8,25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1 М бета-меркаптоэтанола, 0,2% пеногасителя А) при комнатной температуре, проходя несколько раз через шприц (29G) (рис. 2). Сплит лизата на равные части, как РНК и ДНК могут быть получены одновременно или по отдельности, в зависимости от конкретных экспериментальных потребностей. Для очистки РНК добавить 1/10 объема NaOAc, 1 объем AquaPhenol (Appligene) (рН 4) и 1/2 объема хлороформ: изоамиловый (24:1) в лизата. Vortex энергично после каждого шага иинкубировать на льду в течение 10 мин, центрифуги (20 мин при 10000 г на 4 ° С), добавить равное количество 70% этанола в aequous фазы. Передача смесь РНК колонке спином (например, Nucleospin РНК II с Macherey-Nagel) и выполнять в колонку ДНКазы, пищеварение и промывки (следовать протоколу производителя); элюируются РНК в 25 мкл H 2 O. Для очистки ДНК оптимизированный протокол крови Qiagen DNeasy и тканей Kit используется. Равновесие лизата с равными объемами буфера AL и 100% этанола, нагрузка на центрифуге Колонка Spin (1 мин при 10000 г при комнатной температуре) и отказаться от проточных. Добавить 500 мкл буфера AW1 в том числе 5 мкл РНКазы (1 мг / мл) в колонну и инкубировать 10 мин при комнатной температуре. Spin (1 мин при 10000 г, РТ) и отказаться от проточных. Промойте колонку с 500 мкл буфера AW2, отказаться от проточных и спин-сухой пустой столбец (1 мин при 15000 г). Добавить нагретого (70 ° C) буфера AE и инкубировать столбцов в течение 10 мин при 70 ° C. Элюции с помощью центрифугирования (1 мин, 10000 г), повторно применять проточные и повторите шаг центрифугирования. Используйте спектрофотометр для определения ДНК и РНК концентрации. Типичный НДС удар дает ~ 600 нг ДНК и ~ 400 нг РНК. Для экспрессии генов анализ ПЦР (КПЦР), мы обычно используем ~ 100 нг РНК в обратной реакции транскрипции. 4. Бисульфит преобразования Бисульфита натрия используется для преобразования неметилированных цитозина в урацила. В отличие от метилированных цитозина защищены от преобразования. Таким образом, все цитозина, которые были обнаружены в конечном секвенирования бисульфит ПЦР-ампликонов представляют метилированных цитозина. Бисульфит преобразования приводит к существенному деградации ДНК, которая может быть ограничивающим фактором в ПЦР-анализа. Оптимизированные условия реакции, которые максимизируют цитозин преобразования, снизить фрагментацию ДНК и поддерживать одноцепочечной ДНК даже при низких температурах может быть достигнуто с помощьюEpiTect бисульфит Qiagen в комплект. В наших руках ~ 200 нг ДНК очищали от micropunches обеспечивать достаточное количество исходного материала для бисульфит реакции. Чтобы избежать различий в эффективности преобразования реакции, количество матричной ДНК должна быть постоянной среди всех образцов, обработанных во время эксперимента. Кроме того, последовательность чтения должны быть тщательно проанализированы на эффективность преобразования путем изучения скорости неконвертированных без CpGs. Эта ставка должна превышать 98%. Более низкие значения указывают на неполной или неэффективной бисульфит преобразования и основной последовательности должны быть исключены из анализа. 5. Бисульфит ПЦР Дизайн бисульфит последовательности праймеров, которые являются специфическими для бисульфит превращается ДНК (см. обсуждение); метил Primer Express, программное обеспечение ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ EN / США / adirect / AB? Cmd = catNavigate2 и CATID = 602121) поможет это и помогает определить оптимальные температуры отжига в пилотных экспериментах. Подготовка ПЦР-Мастер-Mix (для одной реакции) следующим образом: 2,5 мкл 10x ПЦР буфер 0,5 мкл 10 мМ дНТФ 1 мкл 10 мкМ прямого праймера 1 мкл 10 мкМ обратный праймер 0,125 мкл Taq Qiagen HotStart Plus заполнить до 23 мкл H 2 O Добавить 2 мкл бисульфит обработанных ДНК реакции. Усиление с помощью следующих условиях: 1 цикл 6 мин 95 ° C 45-50 циклов в 1 мин 95 ° С, 1 мин при оптимальной температуре отжига, 1 мин 72 ° C 1 цикл 5 мин 72 ° C Анализ 7 мкл продукта ПЦР электрофорезом в агарозном геле для проверки размеров ампликона и очистить оставшиеся реакции ПЦР для последующей перевязкой использованием коммерчески доступных ПЦР очистке комплект (например, Macherey-NaГель Nucleospin Извлечение). В случае дополнительных нежелательных продуктов ПЦР получен, гель очистки рекомендуется. 6. Бисульфит Sequencing Высокое разрешение метилирования ДНК профилей выводится из одного чтения клон может обнаружить небольшие изменения метилирования ДНК и выявление регуляторных областях, которые реагируют на лечение (экологических программ). В процессе секвенирования бисульфит состоит из трех последовательных этапов работы. Во-первых, ПЦР продуктов, полученных по предварительному бисульфит ПЦР лигируют в вектор и превращаются в бактерии. Во-вторых, колония ПЦР из одного клона используется для определения правильного размера вставки. В-третьих, положительный ПЦР колонии очищают и подвергают Биг-краска последовательность реакций. После очистки шаг, продукты электрофорезу на капиллярной секвенсор. 6,1 лигирования и трансформации Примечание: Мы обычно используем pGEM-T вектор млoning комплект (Promega). По нашему опыту, эффективность клонирования в решающей степени зависит вставки должны быть перевязаны. Различные векторы должны быть проверены в случае небольшого числа рекомбинантных клонов неоднократно получены. Настройка реакции лигирования: 5 мкл 2х буфера лигирования 1 мкл pGEM-T векторного 1 мкл Т4-лигазы 3 мкл очищенных продуктов ПЦР Смешайте реакции с помощью пипетки и инкубировать в течение ночи при 4 ° C. Примечание: Перевязка может быть проведена в течение 1 часа при комнатной температуре, а также. Для увеличения количества рекомбинантных клонов, за одну ночь перевязки при 4 ° С является предпочтительным. Очистка от перевязки продуктов осаждения этанолом: Добавить 1 мкл гликогена, 1 мкл 3М NaAc и 25 мкл 100% этанола в реакции лигирования и осадка в течение 1 мин в жидком азоте. Центрифуга (15,0000 г в течение 30 мин при 4 ° С) и отказаться от супернатант. Промыть 300 мкл70% этанола и центрифуги (15,000 г в течение 20 мин при 4 ° С), удалите супернатант и сухие гранулы при комнатной температуре (10 мин). Ресуспендируйте гранул в 10 мкл H 2 O. 6,2 трансформации перевязки продуктов в electrocompetent бактерии Предварительно охлаждать электропорации кюветы (1 мм), на льду и оттаивания аликвоты electrocompetent DH5α бактерий на льду. Добавьте 45 мкл DH5α бактерий до 10 мкл очистке перевязки продуктов (см. выше) и трансфер в кювет. Преобразование бактерий на 1,5 кВ, 200 Ω, 15 мкФ и добавляют 1 мл предварительно нагретого среду SOB непосредственно после импульса доставки. Восстановление бактерий в течение 1 ч при 37 ° C, распространяются по 100 мкл суспензии на LB / ампициллин плиты с покрытием из IPTG / X-Гал. Инкубируйте пластины ночи при 37 ° C. 6,3 колонии PCR Примечание: Колония ПЦР из одного клона проводится с целью обеспечения того, чтобы вставкипрогнозируемого размера. Задержка развития цвет синий / белый скрининга, нежелательные события рекомбинации во время перевязки, включение олигомерных пар праймеров или усеченной продуктов ПЦР в противном случае могут привести к порче результатов секвенирования. Мы регулярно использовать Т7 и SP6 праймерами для амплификации клонировали вставками, этот подход приводит к дополнительному последовательности вектор около 150 базисных пунктов. T7 грунтовка применяется в последовательности реакций на более позднем этапе. Настройка колонии реакции ПЦР в 96-луночного планшета. С одной реакции использовать: 3 мкл 2,5 мМ MgCl 2 2,5 мкл 10x буфер Taq 1,5 мкл 10 мМ дНТФ 2 мкл 2,5 мМ T7 праймером 2 мкл 2,5 мМ SP6 грунтовка 1 мкл Taq полимераза Fermentas заполнить до 25 мкл H 2 O Внесите 25 мкл / лунку мастер смеси в каждую лунку 96-луночного планшета. Выберите положительный (белая) от клонов пластины с пипетки и окунуться в реакции ПЦР. Усиление использованием следуюследующим условиям: 1 цикл 4 мин при 95 ° C 10 циклов 30 с при 94 ° С, 30 с при 56 ° C и 30 с при 72 ° C 30 циклов 30 с при 94 ° С, 30 с при 48 ° С и 30 с при 72 ° C 1 цикл 5 мин при 72 ° C Загрузка 5 мкл колонии ПЦР на геле агарозы и определить реакции, которые содержат нужный размер вставки. Колония ПЦР, содержащий нужный ампликонов очищаются с использованием коммерчески доступного набора (Machery Nagel Nucleofast). Большой 6,4-краска терминатор реакции и секвенирования Подготовка магистра смесь для Big-краска реакции. С одной реакции использовать: 1 мкл H 2 O Большой 0,5 мкл краски реагент 1,5 мкл буфера Sequencing Внесите 3 мкл / лунку в каждую лунку 96-луночного планшета, в каждую лунку добавляют 2 мкл очищенных продуктов ПЦР колонии и запустить реакцию на Термоциклер со следующими параметрами: <p class="jove-content"> 1 цикла 1 мин при 96 ° C 35 циклов 10 с при 96 ° C, 5 с при 50 ° С и 4 мин при 60 ° C Биг-краска реакции очищают с использованием коммерческого набора (Millipore Montage 96 Последовательность Clean-Up Kit) и обрабатываться на капиллярной секвенсор (например, ABI 3100 ДНК). Последовательности, анализируются с помощью BIQ Analyzer ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) или онлайн-инструмент BISMA ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) для получения метилирования исследуемых ДНК области (рис. 4). 7. Представитель Результаты Чтобы лучше понять влияние ELS на Avp выражения и статуса метилирования, C57BL/6N мышей были обработаны в соответствии с рабочим процессом, описанные выше. Короче говоря, группа мышей была с C57BL/6Nubjected в ELS в то время как в контрольной группе осталась нетронутой. НДС и супраоптического ядра (SON) были кулаками и ДНК и РНК были выделены одновременно в одном ударов. РНК обратной транскрипции и уровни транскриптов Avp измерялись КПЦР анализа и нормированная на выражение HPRT и гены GAPDH хозяйства. ДНК бисульфит лечение, усиливается с праймеров, специфичных для Avp усилитель (рис. 4а) и ПЦР-продукты были клонированы и последовательность. По меньшей мере 20 рекомбинантных клонов из каждой мыши / ПЦР были проанализированы для определения частоты метилирования CpGs, содержащихся в ПЦР-ампликонов (рис. 4б). По сравнению с контрольной группой, ELS вызвало значительное понижение уровня метилирования в CpG10, CpG12, CpG13 и Cpg14 из Avp усилитель (р <0,05, п = 6-8 животных), предлагая эпигенетической маркировки этой регуляторной области по ранним жизненным опытом. В отличие от НДС, метилированиеAvp усилитель не повлияло на ELS в сыне иллюстрирует тканевой специфичности эпигенетической маркировки (рис. 4в). Анализ состояния метилирования ДНК в CpG10 и Avp экспрессии генов у контрольных животных (п = 6) свидетельствует отрицательная корреляция указывает на роль метилирования ДНК в тонкой настройки AVP экспрессии генов (рис. 4б). Рисунок 1. Micropunches получаются из расчлененных мозги от контроля и раннего жизнь подчеркнул мышей. После ДНК и РНК, изоляция, экспрессия генов определяется QRT-PCR в то время как бисульфит рассматривать ДНК усиливается и очищенные продукты клонированы в подходящий вектор, позволяющие идентифицировать рекомбинантных клонов синий / белый выбор. Правильные размеры вставки проверяютсяПЦР колонии до проведения Big-краска реакции и обработки на капиллярной секвенсор. Метилирование картина визуализируются на соответствующие программные средства. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 2. Сроки от ДНК / РНК добычи до бисульфит последовательности. Рисунок 3. Workflow для одновременного извлечения ДНК и РНК. Удар гипоталамо ядра paraventricularis, маленький геном Avp выражения головного мозга, находится в 400 мкл буфера GTA, встряхивали до нарушается и далее гомогенизируется, проходя через шприц (29G). Гомогенат затем разделить для очистки ДНК и РНК. Раскол может быть 1:1 или различных пропорциях в зависимостиот конкретных экспериментальных вопрос. Гомогенатах должны быть обработаны в течение нескольких часов. Рисунок 4. CpG метилирования в локусе Avp в 6 недель контроля и ELS животных. (А) Схема АВП и окситоцин генов ориентированных хвост к хвосту и отделены друг от друга межгенных области (ИГИ). Экзоны изображены открытые (номерные) коробки. Распределение CpG остатков указывается и размер и положение соответствующих ампликона ПЦР содержащие CpG 10 CpG14 отмечено жирной линией. (B) Метилирование Avp усилитель в ПВН в управлении ELS и животных (п = 6-8). (C) Метилирование Avp усилитель на сына в управлении ELS и животных (п = 8-10). (D) Avp экспрессии генов коррелируетс метилирования в CpG10 (п = 6). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .