Summary
Erken yaşam stresinin üzerine DNA metilasyon ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için bir iş akışı gösterilir. Yeni doğmuş farelerin ve ayrık beyin dokularında izolasyonu anneden ayrılma başlayarak, eş zamanlı olarak izleyen bisülfit sıralama ve RT-PCR analizi için beyin dokusu yumruklar DNA ve RNA izole etmek için bir protokol temsil eder.
Abstract
Diyet maruz kalmak, hayatın 1,2 duyarlı pencereleri sırasında ilaçlar ve erken yaşam sıkıntı fizyolojik ve davranışsal fenotipleri ekran katkıda gen ekspresyonu kalıcı değişikliklere yol açabilir. Bu tür çevresel programlama metabolik, kardiyovasküler ve ruhsal hastalıklar 3,4 duyarlılığı artırmak olasıdır.
DNA metilasyon ve histon modifikasyonları gen-çevre diyalog arabuluculuk önemli süreçler olarak kabul edilir ve çevresel programlama 5 underlay da görünür. Memelilerde, DNA metilasyon tipik CpG dinucleotides bağlamında sitosin ve 5-pozisyonunda bir metil grubu ile kovalent ek içerir.
CpG metilasyonu bu hücresel heterojenite yüksek olduğu ve doku miktarı sınırlı beyin ayrık, küçük bölgelere çalışmak için bir meydan okuma yapan bir yüksek doku ve hücre-spesifik bir şekilde oluşur. Dahası, because gen ekspresyonu ve metilasyon olayları yakından bağlantılıdır, artan değer aynı örnek iki parametreleri karşılaştırılarak elde edilebilir.
Burada, beyinde epigenetik programlama soruşturma için bir adım-adım protokolü (Şekil 1) amaçlıdır yaşamın erken sıkıntının 'anneden ayrılma' paradigması kullanılarak sunulmaktadır. Protokolü, böylece aynı örnek DNA metilasyonu ve gen ifadesi analizleri sağlayan DNA ve RNA eşzamanlı olarak izole edilebileceği farklı şekilde yaşlı fare beyinlerinden micropunches hazırlanmasını açıklar.
Protocol
1. Erken Yaşam Sıkıntı ile Programlama
Anne ayırma (MS) zamanlanmış-hamile C57BL/6N farelerde (doğum günü doğum sonrası günlük 0 (P0)) tarafından teslim Yavrularda erken yaşam stresinin (ELS) ikna etmek için yapılır.
- Bireysel yavrularına P1-10 3 saat için günlük (ısıtma yastığı ile) temiz kafeslere yerleştirilir.
- Kontrol (non-ELS) yavru boyunca anne yuvada bozulmadan kalır.
- Pups onlar standart laboratuvar hayvan barınağı koşullarında cinsiyet uyumlu gruplara (kafes başına 3-5 fareler) yerleştirilmiştir hangi zaman sonra (P21) sütten kadar anneleri ile birlikte tutulur.
2. Beyin Dokusu izolasyonu ve Diseksiyon
- . Fareler servikal dislokasyon Not istenilen yaşta öldürüldü: Bu protokol bir stres paradigma içerir, çünkü anestezi stres hormonları normal fizyolojik düzenleme girişimi önlemek için, servikal dislokasyon önce verilir. Skulls açtı ve olanbeyinleri -80 ° C'de muhafaza edilmeden önce, izo-pentan-kuru buz batırılarak dikkatlice çıkarılır ve derhal ek dondurulur
- Beyinler (10 mikron kalınlığında) cryosectioned vardır; bölümleri SuperFrost cam slaytlar üzerine monte edilir ve -20 ° C'de muhafaza edilir PVN - - rostral PVN, bregma düzeyinde başlayan bölümlerde toplamak bir standart fare stereotaksik atlas Referans (örneğin Paxinos 6) anatomik hassas doğrulamak ve ilgi bölgesi dahil (paraventriküler nükleus nöronların örneğin sağlamak için kullanılır -0,75 için -0,85).
- Bölümler farklı beyin yapılarının tespiti kolaylaştırmak için cresyl violet ile boyandı edilir. Ilgi bölgelerin delgeçler (0.8 mm) (örn. PVN) loco mikrodiseksiyon olarak elde edilir.
3. Beyin zımba ile Nükleik Asit Ekstraksiyon
Aynı anda küçük Nöroanatomik tanımlı beyin Tescil DNA ve RNA ayıklanması için optimize edilmiş bir protokolbisülfit ve gen ifadesi analizler için iyonları 7 tarif edilmektedir.
Not: RNA GTC-Tampon DNA daha az istikrarlı olduğunu düşünecek olursak, RNA ilk işleme öneririz. DNA saflaştırılması için kullanılan Homojenat ve bu süre içinde oda sıcaklığında (RT) tutulabilir.
- Guadinyum tiyosiyanat (GTC) tamponu (4.5 M guadinyum tiyosiyanat,% 2 N-lauroylsarcosine, 50 mM EDTA pH 8.25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M, beta-merkaptoetanol,% 0.2 köpük önleyici bir 400 ul bir pipet ve zımbaların vortexer kullanılarak homojenize A) oda sıcaklığında, bir derialtı enjektörünün (29G) (Şekil 2) ile birkaç kez geçtikten.
- Eşit parçaya bölünür Lizat; RNA ve DNA hem de özellikle deneysel gereksinimlerine bağlı olarak, ayrı ayrı aynı anda veya ekstre edilebilir.
- Izoamil (24:1) ile Lizat: RNA saflaştırılması için NaOAc ile 1/10 hacim, 1 hacim AquaPhenol (Appligene) (pH 4) ve kloroform ile 1/2 hacim ekleyin. Gayretle her adımdan sonra Vortex veaequous faz% 70 EtOH eşit hacimde ilave;. 10 dak, santrifüj (4 azından 10.000 g'de 20 dakika ° C) buz üzerinde inkübe
- Bir RNA spin kolon (Macherey-Nagel örneğin Nucleospin RNA II) karışımı aktarın ve on-sütun DNaz-sindirim ve yıkama adımları (imalatçının protokolü takip) gerçekleştirmek; 25 ul H 2 O da Zehir RNA
- DNA saflaştırılması için Qiagen DNeasy Kan ve Doku Kit optimize bir protokol kullanılır. Tampon AL eşit hacimleri ve% 100 EtOH, bir Spin Sütun santrifüj yükü (RT 10.000 gr az 1 dk) ile Lizat ve akış yoluyla atmak dengeye.
- Sütun 5 ul RNAse (1 mg / ml) içeren 500 ul Tampon AW1 ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. Spin (10.000 gr az 1 dakika, RT) ve flow-through atın.
- 500 ul Tampon AW2 ile sütun yıkayın, flow-through ve spin-kuru boş bir sütun (15.000 gr az 1 dk) atın.
- Ekle önceden ısıtılmış (70 ° C) 70 az Tampon AE ve 10 dakika süreyle inkübe kolon ° C. (1 dakika santrifüj Zehir10.000 g), flow-through yeniden uygulamak ve santrifüj adımı tekrarlayın.
DNA ve RNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. Tipik bir PVN yumruk verimleri ~ 600 ng DNA ve RNA ~ 400 ng. Kantitatif PCR (qPCR) tarafından gen ifadesi analizi için, tipik olarak ters transkripsiyon reaksiyonunda RNA ~ 100 ng kullanımı.
4. Bisülfit Dönüşüm
Sodyum bisülfit uracils olmayan metillenmiş sitozinleri dönüştürmek için kullanılmıştır. Buna karşılık, metillenmiş sitozinleri dönüşüm korunmaktadır. Bu nedenle, bisülfit PCR-amplikon nihai sekanslama tespit edilir tüm sitozinleri metillenmiş sitozinleri temsil eder.
Bisülfit dönüşüm PCR analizinde sınırlayıcı bir faktör olabilir önemli DNA bozulması neden olur. , Sitozin dönüşüm maksimize DNA parçalanması azaltmak ve daha düşük sıcaklıklarda bile tek iplikli DNA korumak Optimize reaksiyon şartları kullanılarak elde edilebilirQiagen Kullanıcı EpiTect Bisülfit Kit. Elimizdeki ~ micropunches arındırılan DNA 200 ng bisülfit reaksiyonu için başlangıç malzemelerinin örneği bir miktarda bulunur.
Dönüşüm reaksiyonu verimini farklılıklar önlemek için, şablon DNA miktarının bir deney boyunca işlenen tüm örnekleri arasında sabit tutulmalıdır. Buna ek olarak, sırası non-dönüştürülmüş non-larını oranı inceleyerek dönüşüm etkinlik için gereken incelemiş okur. Bu oran% 98 fazla olmalıdır. Daha düşük değerler eksik veya yetersiz bisülfit dönüşüm gösterir ve altta yatan dizileri analize dahil edilmelidir.
5.. Bisülfit PCR
- Metil Primer Express yazılımı (; Tasarım bisülfit bisülfit dönüştürülür DNA (bakınız tartışma) özgü primerler sıralama https://products.appliedbiosystems.com/ab/ Tr / ABD / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 & catid = 602.121) bu yardım ve pilot deneylerde optimal tavlama sıcaklıkları belirlemek için yardımcı olacaktır.
- Aşağıdaki gibi PCR-Master-Mix (bir reaksiyon için) hazırlayın:
2.5 ul 10x PCR buffer
0.5 ul 10 mM dNTP
1 ileri ul 10 uM astar
1 ul 10 uM ters astar
0.125 ul Qiagen HotStart Taq Artı
H 2 O ile 23 ul kadar doldurmak - Reaksiyon için 2 ul bisülfit ile tedavi edilen DNA ekleme.
- Aşağıdaki koşullar kullanılarak amplifiye:
1 döngü 6 dakika 95 ° C
1 dakika 95 ° C'de 45-50 döngüleri, optimal tavlama sıcaklığında 1 dakika, 1 dakika 72 ° C
1 döngüsü 5 dakika 72 ° C
Amplikon büyüklüğü doğrulamak ve ticari olarak satılan bir temizleme PCR kiti (kullanılarak takip eden bağlama için geri kalan PCR reaksiyonu arındırmak için agaroz jel elektroforezi ile PCR ürün 7 ul analiz örneğin Macherey-Najel Nucleospin) ayıklayın. Ek istenmeyen bir PCR ürünleri elde edilmektedir durumda, jel saflaştırması tavsiye edilir.
6. Bisülfit Sıralama
Tek bir klon okumaları dayandırılamaz Yüksek çözünürlüklü DNA metilasyon profilleri DNA metilasyon küçük değişiklikleri tespit ve tedavi (çevresel programlama) cevap veren düzenleyici bölgeler tanımlayabilir. Bisülfit sıralama işlemi üç ardışık çalışma adımları içermektedir. İlk olarak, önceden bisülfit PCR ile elde edilen PCR ürünleri, bir vektör içine bağlandı ve bakteriler dönüştürülür. İkincisi, tek klonlarından koloni PCR eklemek doğru boyutunu belirlemek için kullanılır. Üçüncü olarak, pozitif koloni PCR temizlenir ve Big-Boya dizi reaksiyona tabi tutulur. Temiz bir şekilde adım takiben, ürünlerin bir kılcal sıralayıcı elektroforezinde edilir.
6.1 Ligasyonu ve Dönüşüm
Not: Biz rutin pGEM-T vektör cl kullanınoning kiti (Promega). Deneyimlerimize göre, klonlama verimliliği bağlandı edilecek ekleme doğruluğuna bağlıdır. Rekombinant klonların düşük sayılar art arda elde edilmesi halinde Farklı vektörler test edilmelidir.
- Ligasyon reaksiyonu ayarlayın:
5 ul 2x Ligasyonu Tampon
1 ul pGEM-T vektörü
1 T4-Ligaz ul
3 ul temizlenmiş PCR ürünü - 4 gece boyunca pipetleme ve inkübe tarafından tepki karıştırın ° C
Not: Ligation aynı zamanda da oda sıcaklığında 1 saat boyunca gerçekleştirilebilir. 4 gece boyunca ligasyon, rekombinant klonların sayısını arttırmak için ° C tercih edilir.
- Clean-up etanol yağış tarafından ligasyon ürünler:
- 1 ul glikojen, 1 ul 3M NaAc ve sıvı azot içinde 1 dakika süreyle reaksiyona ligasyon ve çökelti 25 ul% 100 EtOH ekleyin.
- Santrifüj (4 azından 30 dakika süreyle 15,0000 g ° C) ve süpernatant atılır.
- 300 ul ile yıkayın% 70 EtOH ve santrifüj (4 azından 20 dakika süreyle 15.000 g ° C), RT (10 dakika) ve kuru süpernatan pelet atılır.
- 10 ul H 2 O da Pastör pipetiyle pelet
Electrocompetent bakterilerde ligasyon ürün 6,2 Dönüşümü
- Buz üzerinde buz ve electrocompetent DH5α bakterilerin çözülme kısım üzerine ğutma elektroporasyon küvetler (1 mm genişlik).
- Ligasyonu ürün temizledik 10 ul (yukarıya bakınız) 45 ul DH5α bakteri ekleyin ve küvet transfer.
- 1.5 kV, 200 Ω, 15 uF bakteri Dönüşüm ve doğrudan darbe doğumdan sonra önceden ısıtılmış orta SOB 1 ml ekleyin.
- 37 ° C'de 1 saat süreyle bakteri kurtarmak IPTG / X-Gal ile kaplanmış / ampisilin plakaları üzerine LB süspansiyon 100 ul yayılır.
- 37 'de bir gece plakaları ° C'de inkübe
6.3 Colony PCR
Not: Tek klonlarından Colony PCR ekler sağlamak için yapılırtahmin büyüklüğü. Mavi / beyaz tarama, ligasyon, oligomerik primer çiftlerinin birleşme veya kesildi PCR ürünleri sırasında istenmeyen rekombinasyon olayları Gecikmeli renk gelişimi Aksi taktirde hatalı sıralama sonuçlara yol açabilir. Biz rutin olarak klonlanmış ekler yükseltmek için T7 ve SP6 primerleri kullanmak; yaklaşık 150 bp ek vektör dizileri bu yaklaşımın sonuçları. T7 primerin bir sonraki adımda sekanslama reaksiyonda kullanılır.
- 96-plaka koloni PCR ayarlayın. Bir reaksiyon kullanın:
3 ul 2.5 mM MgCl2
2.5 ul 10x Taq tampon
1.5 ul 10 mM dNTP
2 ul 2.5 mM T7 astar
2 ul 2.5 mM SP6 astar
1 ul Fermentas Taq Polimeraz
H 2 O ile 25 ul kadar doldurmak - / Kuyu ana karışımı içine her oyuğa 96-kuyulu plakanın 25 ul dağıtın.
- PCR içine pipet ve daldırma ile plaka pozitif (beyaz) klon seçin.
- Fol kullanarak Amplifyiyice silinir koşulları:
95 1 döngü 4 dk ° C
94 az 10 döngü 30 saniye ° C, 56 at 30 s 72 ° C ve 30 ° C'de s
94 at 30 döngü 30 saniye ° C, 48 at 30 s 72 ° C ve 30 ° C'de s
72 de 1 döngüsü 5 dak ° C - Bir jelde koloni PCR 5 ul yükleyin ve sağ ekleme boyutunu içeren reaksiyonlarının belirlenmesi.
- İstenen amplikonlar içeren Colony PCR uygun ticari kit (Machery Nagel Nucleofast) kullanılarak temizlenir.
6.4 Big-Boya terminatör reaksiyon ve sıralama
- Big-Boya reaksiyon için Master karışımı hazırlayın. Bir reaksiyon kullanın:
1 ul H2O
0.5 ul Big-Dye reaktif
1.5 ul Sıralama tampon - Her iyi temizlenmiş koloni PCR ürün 2 ul ekleyin ve aşağıdaki parametreleri ile bir termalcycler üzerine tepki çalıştırmak için, ul / iyi bir 96-plakanın her kuyuya 3 dağıtın: 96 at 10 sn 35 ° C döngüleri, 5 s 50 at 60 ° C'de ve 4 dakika ° C
- Big-Boya reaksiyon ticari kit (Millipore Montage 96 Temizlik-Up Kit Sıralama) kullanılarak temizlenir ve kılcal bir sequencer (örneğin ABI 3100 DNA) işlenir.
- Diziler BIQ Analyzer (analiz edilir http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) veya online araç Bisma ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) İncelenen DNA bölgesi (Şekil 4) metilasyon paterni türetmek için.
7. Temsilcisi Sonuçlar
AVP ifade ve metilasyon durumu hakkında ELS etkisi hakkında fikir edinmek için, C57BL/6N fareler yukarıda açıklanan iş akışına uygun olarak işlendi. Kısaca, C57BL/6N farelerin bir grup olduğu sKontrol grubu ellenmeden bırakılmaktadır iken ELS'ye ubjected. Tek bir zımba ile PVN ve supraoptik çekirdeğin (SON) delikli edildi ve DNA ve RNA eşzamanlı olarak izole edilmiştir. RNA ters transkripsiyonu edildi ve AVP transkriptlerin seviyeleri qPCR analizi ve HPRT ve GAPDH temizlik genlerinin ifadesi için normalize ile ölçüldü. DNA avp artırıcı (Şekil 4a) ve PCR ürünleri için spesifik primerlerin ile amplifiye, bisülfit, işlemden geçirilmiş klonlanmış ve dizilenmisti.r. Her bir fare / PCR en az 20 rekombinant klonlar PCR amplikon (Şekil 4b) içerdiği CpG'ler için metilasyon frekansları belirlemek için analiz edilmiştir. Kontrollere göre, ELS epigenetik erken yaşam deneyimleri ile bu düzenleyici bölgenin işaretleme düşündüren AVP zenginleştiricinin CpG10, CpG12, CpG13 ve Cpg14 (p <0.05, n = 6-8 hayvanlar) de önemli bir hipometilasyonu bağlı. Of PVN, metilasyon aksineAVP arttırıcı epigenetik işaretlemesi (Şekil 4c) OĞLU gösteren doku özgüllüğü ELS etkilenmedi. CpG10 ve AVP gen ekspresyonu kontrol hayvanlarında az DNA metilasyon durumunun analizi (n = 6) AVP gen ekspresyonu (Şekil 4d) ince ayar DNA metilasyon bir role işaret eden bir negatif korelasyon gösterdiği.
Şekil 1. Micropunches kontrol ve erken yaşam vurguladı farelerin diseke beyinleri elde edilmektedir. Bisülfit tedavi edilen DNA amplifiye edilir ve saflaştırılmış ürün beyaz / mavi seçimi tarafından rekombinant klonlarının uygun bir vektör içinde klonlanmış izin tanımlama iken DNA ve RNA izolasyonu takiben, gen ekspresyonunun QRT-PCR ile belirlenir. Doğru uç boyutları ile doğrulanırönce bir kapiller sıralayıcı Big-Boya reaksiyonu ve işlemlerden geçirmek için koloni PCR. Metilasyon desen uygun yazılım araçları tarafından görüntülenmiştir vardır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. DNA / RNA ekstraksiyonu bisülfit sıralama için Timeline.
Şekil 3. DNA ve RNA eş zamanlı olarak çıkarılması için Akışı. Paraventricularis hipotalamik nükleus, beyin bölgesini ifade küçücük bir avp gen, bir yumruk bir şırınga (29G) geçerek, 400 ul GTA tampon yerleştirilir kesintiye kadar vortekslenmiş ve daha homojen hale getirilir. Homojenat sonra RNA ve DNA saflaştırılması için ayrılır. Bölünmüş 1:1 olduğu veya bağlı olarak farklı oranlarda olabilirÖzellikle deneysel soru. Homojenat birkaç saat içinde işlenmelidir.
Şekil 4. 6 haftalık kontrolü ve ELS hayvanlarda AVP lokustaki CpG metilasyonu. (A) ve AvP oksitosin genler yönelik kuyruk-kuyruk Şema ve intergenik bölgesi (IGR) ile ayrılır. Ekzon açık (numaralı) kutuları tasvir ediliyor. CpG kalıntı dağılımı gösterilir ve boyut ve CpG14 için CpG 10 içeren ilgili PCR amplikon pozisyonu kalın bir çizgi ile işaretlenir. (B) kontrolü ve ELS hayvanlarda PVN in AvP artırıcı madde metilasyon (n = 6-8). Kontrolü ve ELS hayvanlarda SON (n = 8-10) içinde AvP artırıcı madde (C) metilasyon. (D) avp gen ekspresyonu korelasyonCpG10 de metilasyon (n = 6). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Discussion
Epigenetik programlama giderek önemli bir mekanizma altta yatan sağlık ve hastalık olarak kabul edilmektedir. Burada micropunches ve bisülfit sıralanması yoluyla DNA metilasyon profilleri elde etmek için sonraki adımları DNA ve RNA aynı anda izolasyonu için zarif bir yöntem sunuyoruz. Optimize bir iş akışı çevresel uyaranlara yanıt olarak beyindeki epigenetik programlama rahat analiz sağlar. Ayrıca bu yaklaşım hem aynı örnek analiz edilir, DNA metilasyon ve gen ekspresyonu arasındaki fonksiyonel ilişkinin araştırılması kolaylaştırır. Son olarak, deney için gerekli hayvan sayısı önemli ölçüde düşürülebilir.
Sunulan iş akışı yaparken bazı önlemler ve kurallara uyulmalıdır. Metilasyon ve ifade desen bir hücre ve doku spesifik bir şekilde değişebilir yana olağanüstü karmaşıklığı ve beyin heterojenliği göz önüne alındığında ve bu derece taşıyorönemli olduğu micropunching standart bir tarzda gerçekleştirilir. Noktasında bir olgu olarak, AVP epigenetik programlama paravaventriuclar tespit edilir, ancak supraoptik çekirdeğinde (Şekil 4b-d), iki avp hipotalamus 4 bölgeleri ifade. Bu bağlamda, aynı doku delikli DNA ve RNA mevcudiyeti RNA belirli doku spesifik bir işaretleyici gen ifadesi doğru alanı delikli olduğunu teyit, bazı durumlarda da kullanılabilmektedir olarak avantajlıdır. Micropunching hücresel heterojenite azaltabilir rağmen, bu yaklaşım tek hücre tipleri veya popülasyonlarının izolasyon neden olmadığını akılda tutulmalıdır. Ek saflaştırma adımları bu konu ele düşünülebilir.
PCR amplifikasyonu için aşağıdaki bisülfit tedavisi için uygun primer tasarımı sekanslama bisülfit esastır. Uzunluğu 400 bp aşan PCR ürünleri b DNA'nın bozulması nedeniyle sorunlu olabilirisulfite tedavi. Ayrıca, yalnızca, birkaç bozulmadan şablon amplifikasyon sürece katkıda bulunuyor ise iç içe PCR yanlı sonuçlar verir not edilmelidir. Modifiye amplikon için spesifik olan primer çiftleri olarak tasarlanmış olması gerekir; bunların sekansları metilasyon-yanlı amplifikasyon önlemek için CpG dinucleotides içermemelidir. Buna ek olarak, primerler değiştirilmemiş ya da tam olarak dönüştürülür DNA amplifikasyon önlemek için non-CpG sitozinleri içermelidir. Bazı şablonlar Amplifikasyon Sıcak-start PCR iletken yararlanabilir. Değerli örneklerin deneysel bozulmasını önlemek için şekilde, her durumda, primer çiftleri uygunluğu Pilot deneylerde kontrol edilmelidir.
Güvenilir bir şekilde ve tam bir allel spesifik şekilde 8 tek CpG kalıntılarının metilasyon tespit edebilmektedir olarak bisülfit sıralama siteye özgü metilasyon analizi için standart bir yöntem temsil eder. PCR ürününün doğrudan sıralama karışık metilasyon o olarak tavsiye edilmezfa CpG kalıntı ilgili yerinde metilasyon miktarının önleyebilir Elektroforegramda bir C / T çift tepe gibi görünecektir. Bu nedenle bir ara klonlama adımı yapılır ve birkaç klonlar metilasyon kapsamını belirlemek için (~ 20-30) dizilerek. Pyrosequencing DNA metilasyon ölçmek için alternatif bir yöntem temsil eder. Ayrıca, bisülfit dönüştürme ve bisülfit PCR fakat bunun yerine klonlama ve amplikon bir CpG kalıntı metilasyon durumu kolaylıkla belirlenebilir bir C / T, tek nükleotid polimorfizm olarak okunur doğrudan bir pyrosequencing tepkimeye tabi tutulur ve sekanslama kullanmaktadır. Her iki yöntem de metilasyon 9 benzer düzeylerde saptamak ancak klonlama adım atlanabilir yana pyrosequencing daha fazla zaman verimlidir. Bununla birlikte, şablon bağlı olarak, sadece 40-100 nükleotidleri farklı sekanslama astar ile pyrosequencing birkaç tur gereklidir, böylece bir kerede dizisi yapılabilir. Bu THA göz önüne alındığında, kritik bir sınırlama yokturDNA t yüksek miktarda (reaksiyon başına yaklaşık 1 mikrogram) küçük beyin dokusu yumruklar edinilebilir tutarları aşan öngörülebilir, hangi gereklidir. Böylece pyrosequencing tarafından birkaç kilobases aralığında bölgeler ilk tarama tek bir klon okuma olarak az uygundur görünür. Bununla birlikte, faiz pyrosequencing küçük bir bölgenin tespiti üzerine takip düşünülmelidir.
Toplu olarak, yukarıda tarif edilen protokol epigenetik değişiklikler için beyin micropunches hızla ve düşük maliyetli bir analiz için doğru, verimli ve akıcı bir yaklaşım sağlar. Çoklu örnekleri, tek bir çalıştırma işlenir ve ara ölçekli denemeler örnekler çalıştırırken yöntemler uygundur edilebilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Psikiyatri Max Planck Enstitüsü ve Avrupa Birliği Marie Curie İlk Eğitim Ağı (NINA Sözleşme 238.665) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 | |
| Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 | |
| Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 | |
| Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 | |
| Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 | |
| Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 | |
| Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |
References
- Jirtle, R. L., Skinner, M. K. Environmental epigenomics and disease susceptibility. Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).
- Murgatroyd, C., Spengler, D. Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides. Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).
- Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases. Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).
- Murgatroyd, C. Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress. Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).
- Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockmühl, Y., Spengler, D. Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression. Epigenetics. 5, (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , Elsevier Science Publishing Co Inc. (2008).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC research notes. 4, 314 (2011).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation. Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).
