一个精简的工作流程,研究DNA甲基化和基因表达变化后早期生活压力。从新生鼠和离散脑组织隔离母体分离开始,我们代表的协议,同时为随后的亚硫酸氢钠测序和RT-PCR分析DNA和RNA分离脑组织拳。
暴露于饮食,药物和早期生活逆境中,在生活的1,2敏感窗口可以导致持久的基因表达的变化,有助于生理和行为表型显示。这样的环境规划是可能增加易感性代谢,心血管疾病和精神疾病3,4。
DNA甲基化和组蛋白修饰的基因与环境对话的调解被认为是在关键工序,也出现下衬的环境规划5。在哺乳动物中,DNA甲基化通常包括甲基胞嘧啶5位内的CpG二核苷酸的背景下,除了共价。
CpG甲基化发生在一个高度的组织和细胞特异性的方式使其成为一个挑战,研究,脑细胞的异质性高,组织数量有限的离散小区域。此外,Because基因表达和甲基化紧密相连的活动,增加值,可以得到比较这两个参数在同一样品。
在这里,一步一步的协议,为大脑中的后生编程调查( 图1)提出使用“母婴分离”说明目的的早期生活逆境的典范。协议描述的DNA和RNA可以同时分离出的大脑差异中年鼠标micropunches的准备,从而在同一样品中的DNA甲基化和基因表达分析。
后生编程日益被视为潜在的健康和疾病的一个重要机制。在这里,我们提出了一个同时隔离,从micropunches和后续步骤获得通过亚硫酸氢盐测序的DNA甲基化谱的DNA和RNA的精制方法。优化工作流程,允许在应对环境刺激大脑中的后生编程方便分析。此外,这种做法有利于功能的DNA甲基化和基因表达之间的关系,因为二者都是从同一样品分析的调查。最后,实验所需的动物数量可显着减少。
应遵循一定的预防措施和指引,而提出的工作流程执行。考虑非凡的复杂性和异质性脑和甲基化和表达模式,因为在细胞和组织的具体方式可能会有所不同,它是最重要的是micropunching在一个标准化的方式进行。作为一个点的情况下,AVP后生编程在paravaventriuclar检测,但没有在视上核( 图4B-D),两个地区的下丘脑4 AVP表达。在这方面,来自同一组织冲床DNA和RNA的可用性是有利的RNA可以在某些情况下使用证明,正确的区域被打了个一定的组织特异性标记基因的表达。 ,虽然micropunching可以减少细胞的异质性,它必须记住,这种方法不会导致单细胞类型或种群的隔离。可能被视为额外的纯化步骤,以解决这一主题。
对于亚硫酸氢盐测序的PCR扩增以下的亚硫酸氢钠治疗的最佳引物设计是必不可少的。长度超过400 bp的PCR产物可以由B的问题,由于DNA降解isulfite治疗。还应指出,巢式PCR可以给偏见的结果,如果只有少数完整的模板有助于放大过程。设计应当是具体的修改扩增引物对,它们的DNA序列不应该含有CpG二核苷酸,以避免偏向甲基化扩增。另外,引物应该包含非CpG基胞嘧啶,以防止未修改或不完全转换的DNA扩增。进行热启动PCR扩增一些模板可能会受益。在任何情况下,对引物的适用性,应在试点实验验证,有价值的实验标本,以防止腐败。
亚硫酸氢钠测序代表一个站点特定的甲基化分析的标准方法,因为它是能够可靠和准确的检测甲基化的CpG单残留在等位基因特异的方式8。 PCR产物直接测序,不建议作为混合甲基Ø发CPG渣会出现一个C /双峰在电泳,它可以防止定量甲基化有关的网站。出于这个原因,中间克隆步骤进行,一些克隆测序(20-30),以确定甲基化的程度。焦磷酸测序的一种替代方法,以量化DNA甲基化。它还采用重亚硫酸盐转化和亚硫酸氢钠PCR而是克隆和测序的扩增受到直接的焦磷酸测序反应,其中一个CpG残留的甲基化状态是作为一个C / T单核苷酸多态性,可以很容易量化阅读。这两种方法检测9甲基化水平相似,但自克隆步可以省略焦磷酸测序技术是更多的时间效率。然而,根据模板只有40-100个核苷酸测序一次,这样几轮不同的测序引物与焦磷酸测序是必要的。这是一个关键的限制,给予THADNA T更高的金额(约1微克每反应)是必需的,可预见的超过金额可从微小的脑组织拳。因此,在地区范围内的几个碱基的初始扫描,由焦磷酸测序似乎不太适合作为单一的克隆读数。然而,对小区域的利益焦磷酸测序鉴定后应予以考虑。
总的来说,上述协议提供了一个后生变化的脑micropunches快速和成本效益分析,准确,高效和简化的方法。多个标本,可以在一个单一的运行和处理的方法是合适的运行时从中间大小的实验样本。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由马克斯·普朗克研究所精神病学和欧盟的玛丽·居里的初始培训网络(如心合同238665)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 |
Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 |
Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 |
pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 |
Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 |
Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 |
Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 |
Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |