1. Programmering af Tidlig Life modgang Maternal separation (MS) er udført for at inducere tidlige liv stress (ELS) hos hvalpe leveret af tidsbestemt-gravide C57BL/6N mus (postnatal dag 0 (P0) på dagen for fødslen). Individuelle kuld er placeret i rene bure (med varmepude) i 3 timer dagligt fra P1-10. Kontrol (non-ELS) hvalpe forbliver uforstyrret i moderens reden hele vejen igennem. Hvalpe holdes med deres mødre, indtil fravænning (P21), hvorefter de er opstaldet i sex-matchede grupper (3-5 mus pr bur) i henhold til standardkontrakter laboratoriedyr boligforhold. 2. Isolering og dissektion af hjernevæv Mus dræbes ved ønskede alder ved cervikal dislokation. Bemærk: for denne protokol indebærer en stress paradigme, der ikke anæstesi indgives før cervikal dislokation, at undgå interferens med normal fysiologisk regulering af stresshormoner. Skulls åbnes ogHjernerne fjernes omhyggeligt og umiddelbart lynfrosset ved nedsænkning i iso-pentan-tøris, før det lagres ved -80 ° C. Hjerner cryosectioned (10 um tykkelse); sektioner er monteret på SuperFrost objektglas og holdt ved -20 ° C. Reference til en standard mus stereotaktisk atlas (f.eks Paxinos 6) anvendes til at verificere anatomiske præcision og sikre optagelse af regionen af interesse (f.eks neuroner i den paraventrikulære kernen – PVN – samle sektioner startende ved niveauet for den rostrale PVN, bregma -0,75 til -0,85). Sektionerne farves med cresylviolet at lette identifikationen af de forskellige hjernestrukturer. Patricer (0,8 mm) i de områder af interesse (f.eks PVN) opnås ved in loco mikrodissektion. 3. Nucleic Acid Udsugning fra Brain Punches En optimeret protokol til samtidig ekstraktion af DNA og RNA fra bittesmå neuroanatomically-defineret hjerne regioner af bisulfit og genekspression analyser er beskrevet syv. Bemærk: I betragtning af, at RNA er mindre stabil end DNA i GTC-buffer, vi anbefaler behandling RNA først. Homogenatet anvendes til DNA-oprensning kan opbevares ved stuetemperatur (RT) i løbet af denne tid. Homogenisere slag med en pipette og hvirvelomrøreren i 400 pi guanidiniumthiocyanat (GTC) puffer (4,5 M guanidiniumthiocyanat, 2% N-lauroylsarcosin, 50 mM EDTA, pH 8,25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,1 M p-mercaptoethanol, 0,2% antiskummiddel A) ved stuetemperatur. passerer adskillige gange gennem en hypodermisk sprøjte (29 g) (figur 2) Opdelt lysat i lige store dele, både RNA og DNA kan ekstraheres samtidigt eller separat, afhængig af særlige eksperimentelle behov. For RNA-oprensning tilsættes 1/10 volumen af NaOAc, 1 volumen AquaPhenol (Appligene) (pH 4) og 1/2 volumen chloroform: isoamylalkohol (24:1) til lysatet. Vortex kraftigt efter hvert trin, oginkuberes på is i 10 minutter, centrifugeres (20 minutter ved 10.000 g ved 4 ° C); tilsættes et lige volumen af 70% EtOH til aequous fase. Overfør blandingen til en RNA-spinkolonne (f.eks Nucleospin RNA II fra Macherey-Nagel) og udføre på søjlen DNase-fordøjelse og vasketrin (følge fabrikantens protokol); eluerer RNA i 25 ul H2O For DNA oprensning en optimeret protokol af Qiagen DNeasy blod og væv Kit bruges. Ækvilibrere lysatet med lige volumener af Buffer AL og 100% EtOH belastning på en Spin Column centrifuge (1 minut ved 10.000 g ved stuetemperatur) og kasseres gennemstrømning. Tilsæt 500 pi buffer AW1 herunder 5 ul RNAse (1 mg / ml) til søjlen og inkuberes 10 minutter ved stuetemperatur. Centrifugering (1 minut ved 10.000 g, stuetemperatur) og kasseres gennemstrømning. Vask kolonne med 500 pi puffer AW2 kasseres gennemstrømnings-og spin-tør tom søjle (1 minut ved 15.000 g). Tilsættes forvarmet (70 ° C) puffer AE og inkuber kolonner i 10 minutter ved 70 ° C. Eluere ved centrifugering (1 minut, 10.000 g), ansøge igen gennemstrømning og gentage centrifugering. Anvendes et spektrofotometer til at bestemme DNA-og RNA-koncentrationer. En typisk PVN patrice udbytter ~ 600 ng DNA og ~ 400 ng RNA. For genekspressionsanalyse ved kvantitativ PCR (qPCR), typisk anvender vi ~ 100 ng af RNA i revers transkription-reaktionen. 4. Hydrogensulfit Konvertering Natriumbisulfit anvendes til at omdanne ikke-methylerede cytosiner i uraciler. I modsætning hertil er denatureret cytosinerne beskyttet mod konvertering. Derfor er alle cytosinerne, der registreres i den endelige sekventering af hydrogensulfit PCR-amplikon repræsenterer metylerede cytosinerne. Bisulfit omdannelse forårsager væsentlig DNA nedbrydning, der kan være en begrænsende faktor ved PCR-analyse. Optimerede reaktionsbetingelser, som maksimerer cytosin omdannelse reducere DNA-fragmentering og opretholde enkeltstrenget DNA selv ved lavere temperaturer kan opnås ved anvendelseQiagen s EpiTect bisulfit Kit. I vores hænder ~ 200 ng DNA oprenset fra micropunches tilvejebringe en tilstrækkelig mængde af udgangsmaterialet til bisulfit reaktionen. At undgå forskelle i effektiviteten af omdannelsesreaktionen, bør mængden af skabelon DNA holdes konstant blandt alle prøver behandlet ved et eksperiment. Hertil kommer, læser sekvens bør gennemgås for omdannelseseffektivitet ved at undersøge antallet af ikke-konverterede ikke-CpG'er. Denne sats bør overstige 98%. Lavere værdier indikerer ufuldstændige eller ineffektive hydrogensulfit konvertering og de underliggende sekvenser bør udelukkes fra analysen. 5. Hydrogensulfit PCR Konstruktion bisulfit sekvensprimere, der er specifikke for bisulfit omdannet DNA (se diskussionen) Methyl Primer Express software ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ Da / US / adirect / AB? Cmd = catNavigate2 & catid = 602.121), vil støtte dette og hjælpe med til at bestemme optimale annealingstemperaturer i pilotforsøg. Fremstille PCR-Master-Mix (for en reaktion) som følger: 2,5 pi 10 x PCR-buffer 0,5 pi 10 mM dNTP'er 1 pi 10 uM fremadrettet primer 1 pi 10pM revers primer 0,125 gl Qiagen Hotstart Taq Plus fylde op til 23 pi med H 2 O Tilsættes 2 ul bisulfit behandlede DNA til reaktionen. Amplificere anvendelse af følgende betingelser: 1 cyklus 6 min 95 ° C 45-50 cykler af 1 minut 95 ° C, 1 min ved optimale annealingstemperatur, 1 min 72 ° C 1 cyklus 5 min 72 ° C Analysere 7 ul PCR-produkt ved agarosegelelektroforese for at kontrollere størrelsen af amplikon og oprense resterende PCR-reaktion til efterfølgende ligering under anvendelse af en kommercielt tilgængelig PCR-oprensning kit (f.eks Macherey-Nagel Nucleospin Uddrag). I tilfælde yderligere uønskede PCR-produkter opnået, geloprensning anbefales. 6. Hydrogensulfit Sequencing Høj opløsning DNA methylering profiler udledes fra en enkelt klon aflæsninger kan detektere små ændringer i DNA methylering og identificere regulatoriske regioner, der er lydhøre over for behandling (miljø programmering). Den bisulfit sekventering Fremgangsmåden omfatter tre på hinanden følgende arbejdstrin. For det første er PCR-produkter opnået ved kendte bisulfit PCR ligeres ind i en vektor og transformeres ind i bakterier. For det andet er koloni-PCR fra enkelte kloner anvendes til at bestemme den rigtige størrelse af indsatsen. For det tredje er positive koloni PCR ryddet op og udsat for Big-Dye sekventering reaktion. Efter en oprensnings trin, er produkter elektroforesebehandlet på en kapillær sekvenator. 6,1 ligering og transformation Bemærk: Vi rutinemæssigt bruger pGEM-T-vektor cloning kit (Promega). I vores erfaring, afhænger kloningseffektiviteten kritisk på indsatsen, der skal ligeres. Forskellige vektorer bør testes i tilfælde lavt antal rekombinante kloner gentagne opnås. Nedsat ligeringsreaktion: 5 ul 2x ligeringspuffer 1 pi pGEM-T-vektor 1 pi T4-ligase 3 pi rensede PCR-produkt Blandes reaktionsblandingen ved pipettering og inkuberes natten over ved 4 ° C. Bemærk: Ligering kan også udføres i 1 time ved stuetemperatur også. At øge antallet af rekombinante kloner, natten over ligering ved 4 ° C foretrækkes. Oprensning af ligeringsprodukter ved ethanolfældning: Tilsæt 1 pi glycogen, 1 pi 3 M NaAc og 25 pi 100% EtOH til ligeringsreaktionen og præcipitatet i 1 min i flydende nitrogen. Centrifuge (15,0000 g i 30 minutter ved 4 ° C) og kasseres supernatanten. Vask med 300 gl70% EtOH og centrifugeres (15.000 g i 20 minutter ved 4 ° C), kasseres supernatanten og tør pellet ved stuetemperatur (10 min). Resuspender pellet i 10 pi H2O 6,2 Transformation af ligeringsprodukter i elektrokompetente bakterier Precool elektroporation kuvetter (1 mm bredde) på is og tø aliquot af elektrokompetente DH5a bakterier på is. Tilsæt 45 gl DH5a bakterier til 10 pi ryddet op ligeringsprodukt (se ovenfor) og overføres til kuvetten. Transformere bakterier på 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF og tilsæt 1 ml forvarmet SOB-medium umiddelbart efter puls levering. Genvinde bakterier i 1 time ved 37 ° C, spredes 100 ul af suspensionen på LB / ampicillin plader overtrukket med IPTG / X-Gal. Pladerne inkuberes natten over ved 37 ° C. 6,3 koloni-PCR Bemærk: Koloni PCR fra enkelte kloner udføres for at sikre, at skærene eraf den forventede størrelse. Forsinket farveudvikling fra den blå / hvide screening, uønskede rekombinationsbegivenheder begivenheder i ligatur, inkorporering af oligomere primerpar eller trunkerede PCR-produkter som ellers kan føre til defekte sekventering resultater. Vi anvender rutinemæssigt T7 og SP6 primere til at amplificere klonede inserts; Denne fremgangsmåde resulterer i yderligere vektorsekvenser på omkring 150 bp. T7-primer anvendes i sekventering reaktionen i et senere trin. Nedsat koloni PCR-reaktion i 96-brønds plade. For en reaktion anvendes: 3 ul 2,5 mM MgCl2 2,5 pi 10 x Taq-puffer 1,5 gl 10 mM dNTP 2 ul 2,5 mM T7-primer 2 ul 2,5 mM SP6 primer 1 pi Fermentas Taq Polymerase fylde op til 25 pi med H2O Dispensere 25 gl / brønd af stamblandingen i hver brønd af en 96-brønds plade. Vælg en positiv (hvid) klon fra tallerken med pipettespids og dip til PCR-reaktion. Forstærk hjælp følgende betingelser: 1 cyklus 4 minutter ved 95 ° C 10 cyklusser 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 56 ° C og 30 s ved 72 ° C 30 cykler 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 48 ° C og 30 s ved 72 ° C 1 cyklus 5 min ved 72 ° C Indlæse 5 ul af koloni-PCR på en agarosegel og bestemme reaktioner, der indeholder den rigtige insert størrelse. Kolonidannende PCR'er indeholdende de ønskede amplikoner renset ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit (Machery Nagel Nucleofast). 6,4 Big-Dye Terminator reaktion og sekventering Forbered Master mix for Big-Dye reaktion. For en reaktion anvendes: 1 pi H2O 0,5 gl Big-Dye reagens 1,5 pi Sekventering puffer Dispensere 3 gl / brønd i hver brønd af en 96-brønds plade, til hver brønd tilsættes 2 ul renset koloni-PCR-produktet og køre reaktionen i en thermocycler med følgende parametre: <p class="jove-content"> 1 cyklus 1 minut ved 96 ° C 35 cykler af 10 sek ved 96 ° C, 5 sekunder ved 50 ° C og 4 minutter ved 60 ° C The Big-Dye reaktion renses op ved hjælp af et kommercielt kit (Millipore Montage 96 Sekventering Clean-Up Kit) og behandles på en kapillær sequencer (f.eks ABI 3100 DNA). Sekvenser analyseres ved hjælp af BiQ Analyzer ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) eller online-værktøjet Bisma ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) at udlede den methylering mønster af undersøgte DNA-region (figur 4). 7. Repræsentative resultater For at få indblik i indflydelse ELS på AVP udtryk og methylering status, blev C57BL/6N mus behandlet i henhold til arbejdsgangen er beskrevet ovenfor. Kort fortalt, en gruppe C57BL/6N mus blev subjected til ELS, mens kontrolgruppen blev efterladt uforstyrret. Den PVN og supraoptic kerne (SON) blev udstanset og DNA og RNA blev isoleret samtidigt fra de enkelte stempler. RNA blev revers transkriberet og niveauerne af AVP-transkripter blev målt ved qPCR analyse og normaliseret til ekspressionen af HPRT-og GAPDH husholdning gener. DNA blev bisulfit behandlede amplificeret med primere specifikke for AVP enhancer (fig. 4a) og PCR-produkterne blev klonet og sekventeret. Mindst 20 rekombinante kloner fra hver mus / PCR blev analyseret for at bestemme methylering frekvenser for de CpG'er indeholdt i PCR-amplikon (figur 4b). Sammenlignet med kontrol, inducerede ELS en betydelig hypometylering på CpG10, CpG12, CpG13 og Cpg14 af AVP enhancer (p <0,05, n = 6-8 dyr), hvilket tyder epigenetiske mærkning af denne reguleringsmulighed regionen gennem den tidlige livserfaringer. I modsætning til PVN, methylering afAVP enhanceren var upåvirket af ELS i SON illustrerer vævsspecificitet af epigenetisk mærkning (fig. 4c). Analyse af DNA methylering status på CpG10 og AVP genekspression i kontroldyr (n = 6) viste en negativ korrelation peger på en rolle af DNA methylering i finjustering af AVP genekspression (fig. 4d). Figur 1. Micropunches stammer fra dissekerede hjerner fra kontrol og tidlige liv stressede mus. Efter DNA-og RNA-isolering, er gen-ekspression bestemmes ved QRT-PCR under bisulfit behandlede DNA amplificeres og oprensede produkter klones i en egnet vektor til identifikation af rekombinante kloner ved blå / hvid selektion. Insert størrelser verificeret afkoloni-PCR forud for udførelsen af Big-Dye reaktion og forarbejdning på et kapillært sekvenator. Methylering mønster visualiseres ved passende softwareværktøjer. Klik her for at se større figur . Figur 2. Tidslinje fra DNA / RNA-ekstraktion til bisulfit sekventering. Figur 3. Arbejdsgang til samtidig udvinding af DNA og RNA. Dornen af hypothalamus kernen paraventricularis, en lille AVP-gen udtrykker hjerneregion, anbringes i 400 pi GTA puffer, hvirvelbehandles indtil afbrudt, og yderligere homogeniseret ved passage gennem en sprøjte (29 g). Homogenatet derefter delt til oprensning af RNA og DNA. Opdelingen kan være 1:1 eller forskellige forhold afhængigtden særlige eksperimentelle spørgsmål. Homogenater skal behandles inden for få timer. Figur 4. CpG methylation i AVP locus i 6 uger gamle kontrol og ELS dyr. (A) Ordning af AVP og oxytocin-generne orienteret hale til-hale og adskilt af den intergeniske region (IGR). Exonerne er vist ved åbne (nummereret) kasser. Fordelingen af CpG rester er angivet, og størrelsen og placeringen af den respektive PCR-amplikon indeholdende CpG 10 til CpG14 er markeret med en fed linje. (B) Methylering af AVP enhanceren i PVN i kontrol-og ELS dyr (n = 6-8). (C) Methylering af AVP forstærker i SON i kontrol og ELS dyr (n = 8-10). (D) AVP genekspression blev korreleretmed methylering på CpG10 (n = 6). Klik her for at se større figur .