Een gestroomlijnde workflow om DNA-methylatie en expressie van genen veranderingen te bestuderen op de jeugd stress wordt weergegeven. Vanaf moeder scheiding van pasgeboren muizen en isolatie van discrete hersenweefsel vertegenwoordigen wij een protocol van DNA en RNA tegelijk isoleren van hersenweefsel ponsen voor latere bisulfiet sequencing en RT-PCR analyse.
Blootstelling aan voeding, kan drugs en het vroege leven tegenslag tijdens gevoelige ramen van het leven 1,2 leiden tot blijvende veranderingen in genexpressie die bijdragen aan de weergave van fysiologische en gedragsmatige fenotypes. Dergelijke milieu-programmering is waarschijnlijk de gevoeligheid te verhogen tot metabolische, cardiovasculaire en psychische aandoeningen 3,4.
DNA-methylatie en histon modificaties worden beschouwd als de belangrijkste processen in de bemiddeling van de gen-omgeving dialoog en lijken ook voor het milieu programmering ten grondslag 5. In zoogdieren, DNA methylering omvat typisch de covalente toevoeging van een methylgroep aan de 5-plaats van cytosine in het kader van CpG dinucleotiden.
CpG methylering plaatsvindt in een zeer weefsel-en cel-specifieke manier waardoor het een uitdaging om discrete, kleine gebieden van de hersenen waar cellulaire heterogeniteit is hoog en de hoeveelheid weefsel beperkt te bestuderen. Bovendien banwege genexpressie en methylatie zijn nauw met elkaar verbonden gebeurtenissen, kan meer waarde worden verkregen door het vergelijken van beide parameters in hetzelfde monster.
Hier wordt een stap-voor-stap protocol (figuur 1) voor het onderzoek van epigenetische programmering in de hersenen gepresenteerd met behulp van de 'scheiding van de moeder' paradigma van het vroege leven tegenslag voor illustratieve doeleinden. Het protocol beschrijft de bereiding van micropunches van verschillend leeftijd muis hersenen van waaruit DNA en RNA tegelijk kunnen worden geïsoleerd, waardoor DNA-methylatie en genexpressie analyses in hetzelfde monster.
Epigenetische programmering wordt steeds meer erkend als een belangrijk mechanisme dat ten grondslag gezondheid en ziekte. Hier vormen een verfijnde methode voor de gelijktijdige isolatie van DNA en RNA uit micropunches en de volgende stappen DNA methylering profielen verkrijgen door bisulfiet sequencing. De geoptimaliseerde workflow maakt gemakkelijke analyse van epigenetische programmering in de hersenen als reactie op prikkels uit de omgeving. Bovendien is deze aanpak maakt het onderzoek naar de functionele relatie tussen DNA methylatie en gen-expressie als beide worden geanalyseerd uit dezelfde steekproef. Tot slot kan het aantal dieren nodig zijn voor het experiment aanzienlijk worden verminderd.
Sommige voorzorgsmaatregelen en richtlijnen moeten worden gevolgd tijdens het uitvoeren van de gepresenteerde workflow. Gezien de buitengewone complexiteit en de heterogeniteit van de hersenen en sinds methylatie en expressie patroon kan variëren in een cel-en weefsel specifieke manier is het van grootbelang dat micropunching wordt uitgevoerd op een gestandaardiseerde manier. Als voorbeeld wordt epigenetische programmering van Avp gedetecteerd in de paravaventriuclar, maar niet in de supraoptic nucleus (figuur 4b-d), twee Avp expressie gebieden van de hypothalamus 4. In dit verband beschikbaarheid van DNA en RNA uit hetzelfde weefsel punch voordelig als RNA-expressie van bepaalde weefselspecifieke markergenen worden in sommige gevallen te bevestigen dat het juiste gebied is geperforeerd. Hoewel micropunching kan verminderen cellulaire heterogeniteit, moet worden herinnerd dat deze aanpak niet leidt tot de isolatie van enkele cel soorten of populaties. Extra zuiveringsstappen kunnen worden beschouwd dit onderwerp pakken.
Voor bisulfiet sequencing primer optimaal ontwerp voor PCR-amplificatie volgende bisulfiet behandeling is essentieel. PCR producten dan 400 bp in lengte problematisch door de afbraak van DNA door bisulfite behandeling. Ook moet worden opgemerkt dat geneste PCR vertekende resultaten geven als een paar intact templates bijdragen aan het amplificatieproces. Primerparen die specifiek zijn voor de gewijzigde amplicon moeten worden ontworpen, hun sequenties niet bevatten CpG dinucleotiden om methylering voorgespannen versterking te vermijden. Bovendien moet primers bevatten niet CpG cytosines om amplificatie van ongemodificeerde of onvolledig omgezet DNA voorkomen. Versterking van een aantal templates kunnen baat hebben bij het uitvoeren van Hot-start PCR. In ieder geval dient geschikt primerparen worden gecontroleerd modelexperimenten teneinde bederf van waardevolle experimentele monsters voorkomen.
Bisulfiet sequencing is een standaard methode voor het site-specific methylatie analyse als het in staat om betrouwbaar en nauwkeurig opsporen van de methylatie van CpG enkele residuen in een allel-specifieke manier 8. Direct sequencing van het PCR-product wordt niet aangeraden als gemengde methylatie oFA CpG residu wordt weergegeven als een C / T dubbele piek in de elektroferogram, die kwantificering van methylering kan voorkomen dat op het betrokken gebied. Daarom een tussenproduct klonen stap wordt uitgevoerd en verschillende klonen worden gesequenced (~ 20-30) om de mate van methylering bepalen. Pyrosequencing is een alternatieve methode om DNA-methylatie te kwantificeren. Het maakt ook gebruik van bisulfiet conversie en bisulfiet PCR maar in plaats van het klonen en de volgorde van de amplicon wordt onderworpen aan een directe pyrosequencing reactie waarbij de methylatie status van een CpG residu wordt gelezen als een C / T single nucleotide polymorfisme die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd. Beide methoden te sporen hetzelfde niveau van methylatie 9, maar sinds het klonen-stap kan worden overgeslagen pyrosequencing meer tijd-efficiënt. Afhankelijk van het sjabloon 40 tot 100 nucleotiden keer kan worden gesequenced zodat meerdere rondes van Pyrosequencing verschillende sequencing primer noodzakelijk. Dit is een kritieke beperking, gegeven that grotere hoeveelheden DNA (ongeveer 1 ug per reactie) nodig zijn, die voorzienbaar meer bedragen dan de bedragen die beschikbaar zijn van de kleine hersenweefsel stoten. Zo eerste aftasten van gebieden in het bereik van enkele kilobasen door Pyrosequencing weergegeven minder geschikt als enkele kloon lezen. Niettemin moet na de identificatie van een klein gebied van belang pyrosequencing beschouwd.
Collectief, het protocol dat hierboven beschreven biedt een nauwkeurige, efficiënte en gestroomlijnde aanpak voor de snelle en kosteneffectieve analyse van de hersenen micropunches voor epigenetische veranderingen. Meerdere exemplaren kunnen worden verwerkt in een enkele run en de methoden geschikt zijn bij het uitvoeren van steekproeven uit intermediaire-en kleinbedrijf experimenten.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door het Max Planck Instituut voor Psychiatrie en de Europese Unie Marie Curie Initial Training Network (NINA Contract 238665).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 |
Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 |
Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 |
pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 |
Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 |
Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 |
Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 |
Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |