1. Programmering i början av Life Motgångar Maternell separation (MS) utförs för att framkalla tidiga liv stress (ELS) i ungar som levererats av tidsbestämd-gravida C57BL/6N möss (postnatal dag 0 (P0) på dag av födelse). Individuella kullar placeras i rena burar (med värmedyna) under 3 timmar dagligen P1-10. Kontroll (icke-ELS) valpar kvar ostört i moderns boet hela tiden. Ungar hålls med sina mödrar fram till avvänjning (P21), varefter de är inrymda i sex-matchade grupper (3-5 möss per bur) under normala boendeförhållanden laboratorium djurens. 2. Isolering och Dissektion av hjärnvävnad Möss dödade önskade åldrar genom halshuggning Anm.: Eftersom detta protokoll innebär en stress paradigm, ingen bedövning ges före halshuggning, för att undvika att störa normala fysiologiska regleringen av stresshormoner. Skallar öppnas ochHjärnorna avlägsnades försiktigt och omedelbart snabbfrystes genom nedsänkning i iso-pentan-torr is innan de lagrades vid -80 ° C. Hjärnor är cryosectioned (10 | im tjocklek); sektioner är monterade på SuperFrost glasskivor och hölls vid -20 ° C. Hänvisning till en vanlig mus stereotaxisk atlas (t.ex. Paxinos 6) används för att verifiera anatomiska precision och för att säkerställa införandet av regionen av intresse (t.ex. för nervceller i paraventrikulära kärnan – PVN – samla delar med början på nivå rostral PVN, bregma -0,75 till -0,85). Sektioner färgas med kresylviolett för att underlätta identifiering av olika hjärnstrukturer. Slag (0,8 mm) av regionerna av intresse (t.ex. PVN) erhålls av i lok mikrodissektion. 3. Nukleinsyra Utsug från Brain stansar En optimerad protokoll för att samtidigt utvinna DNA och RNA från små neuroanatomically definierade hjärnan regjoner för bisulfit och genuttryck analyser beskrivs 7. Notera: Med tanke på att RNA är mindre stabilt än DNA i GTC-buffert, rekommenderar vi att behandla RNA först. Homogenatet användes för DNA-rening kan förvaras vid rumstemperatur (RT) under denna tid. Homogenisera stansar med en pipett och virvelanordningen i 400 | il av guanidinium-tiocyanat (GTC)-buffert (4,5 M guanidiniumtiocyanat, 2% N-lauroylsarkosin, 50 mM EDTA, pH 8,25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M beta-merkaptoetanol, 0,2% skumdämpare A) vid RT, som passerar flera gånger genom en injektionsspruta (29 g) (Figur 2). Delas lysatet i lika stora delar, både RNA och DNA kan extraheras samtidigt eller separat, beroende på speciella experimentella behov. För RNA-rening tillsätt 1/10 volym NaOAc, 1 volym AquaPhenol (Appligene) (pH 4) och 1/2 volym kloroform: isoamylalkohol (24:1) till lysatet. Vortex kraftigt efter varje steg ochinkubera på is under 10 min, centrifugera (20 min vid 10.000 g vid 4 ° C), tillsätt en lika stor volym av 70% EtOH för att aequous fas. Överföra blandningen till en RNA-spinn-kolonn (t.ex. Nucleospin RNA II från Macherey-Nagel) och utför i kolonnen DNas-digerering och tvättningssteg (följa tillverkarens protokoll); eluerar RNA i 25 pl H 2 O För DNA-rening ett optimerat protokoll för Qiagen DNeasy blod och vävnad Kit används. Jämvikta lysatet med lika stora volymer av buffert AL och 100% EtOH, belastning på en spinnkolonn centrifug (1 min vid 10.000 g vid RT) och kassera genomflöde. Tillsätt 500 pl buffert AW1 inklusive 5 il RNas (1 mg / ml) till kolonnen och inkubera 10 minuter vid rumstemperatur. Spinn (1 min vid 10.000 g, RT) och kassera genomflöde. Tvätta kolonnen med 500 | il buffert AW2 kasseras genomströmning och centrifugeras tom kolonn (1 min vid 15.000 g). Tillsätt förvärmd (70 ° C) buffert AE och inkubera kolonner för 10 minuter vid 70 ° C. Eluera genom centrifugering (1 min, 10.000 g), re-tillämpa genomströmning och upprepa centrifugering steg. Använda en spektrofotometer för att bestämma DNA-och RNA-koncentrationen. En typisk PVN punch ger ~ 600 ng DNA och ~ 400 ng RNA. För genexpression analys med kvantitativ PCR (qPCR), använder vi typiskt ~ 100 ng RNA i den omvända transkriptionsreaktionen. 4. Bisulfit Omvandling Natriumbisulfit används för att omvandla icke-metylerade cytosiner för att uraciler. Däremot är denaturerad cytosiner skyddas från omvandling. Därför är alla cytosiner som upptäcks i den slutliga sekvenseringen av bisulfit PCR-amplikonet representerar metylerade cytosiner. Bisulfit omvandling förorsakar väsentlig DNA-nedbrytning som kan vara en begränsande faktor i PCR-analys. Optimerade reaktionsbetingelser som maximerar cytosin omvandling, minska DNA-fragmentering och bibehålla enkelsträngat DNA och med vid lägre temperaturer kan uppnås med användningQiagens EpiTect bisulfit Kit. I våra händer ~ 200 ng DNA renat från micropunches tillhandahålla en tillräcklig mängd av utgångsmaterialet för bisulfit reaktionen. För att förhindra skillnader i effektivitet omvandlingsreaktionen, bör mängden DNA-mall hållas konstant mellan alla prover som behandlas under ett experiment. Dessutom läser sekvens bör granskas för att verkningsgraden genom att undersöka graden av icke-omvandlade icke-CpG. Denna ränta bör överstiga 98%. Lägre värden anger ofullständig eller ineffektiv bisulfit omvandling och de underliggande sekvenserna bör undantas från analysen. 5. Bisulfit PCR Konstruktion bisulfit sekvensering primrar som är specifika för bisulfitkonverterat DNA (se diskussion); Metyl Primer Express mjukvara ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ Sv / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 & catid = 602.121) kommer att hjälpa detta och bidra till att fastställa optimala glödgningstemperaturer i pilotförsök. Framställa PCR-Master-blandning (för en reaktion) enligt följande: 2,5 pl 10 x PCR-buffert 0,5 | il 10 mM dNTP 1 il 10 | iM framåtriktad primer 1 il 10 nM omvänd primer 0,125 jil Qiagen Hotstart Taq Plus fylla upp till 23 pl med H2O Tillsätt 2 pl bisulfit-behandlade DNA till reaktionen. Amplifiera användning av följande betingelser: 1 cykel 6 min 95 ° C 45-50 cykler av 1 min 95 ° C, 1 min vid optimala härdningstemperaturen, 1 min 72 ° C 1 cykel 5 min 72 ° C Analysera 7 pl av PCR-produkten genom elektrofores på agarosgel för att verifiera storleken av amplikon och rena återstående PCR-reaktion för efterföljande ligering med användning av en kommersiellt tillgänglig PCR upprensnings-kit (t ex Macherey-Nagel Nucleospin Extrahera). Om ytterligare oönskade PCR-produkter framställs är gelrening rekommenderas. 6. Bisulfit Sekvensering Högupplösta DNA metylering-profiler härledda från enstaka klon avläsningar kan upptäcka små förändringar i DNA-metylering och identifiera regulatoriska regioner som är mottagliga för behandling (miljö programmering). Den bisulfit sekvenseringen består av tre på varandra följande arbetssteg. För det första är PCR-produkter erhållna genom tidigare bisulfit PCR ligerades in i en vektor och transformeras in i bakterier. För det andra är koloni-PCR från enkla kloner användes för att bestämma den korrekta storleken av skäret. För det tredje är positiv koloni PCR saneras och utsätts för Big-Dye sekvensering reaktion. Efter en sanering steg, produkter elektrofores på en kapillär sequencer. 6,1 Ligering och transformation Obs: Vi använder rutinmässigt pGEM-T-vektor cloning kit (Promega). Enligt vår erfarenhet är beroende av kloningseffektiviteten kritiskt på inlägget som skall ligeras. Olika vektorer bör testas vid låga antalet rekombinanta kloner upprepade gånger erhålls. Inrättat ligeringsreaktion: 5 | il 2x ligeringsbuffert 1 il pGEM-T-vektor 1 il T4-ligas 3 | il rensade PCR-produkt Blanda reaktionen genom pipettering och inkubera över natten vid 4 ° C. Notera: Ligering kan också utföras under 1 h vid RT också. Att öka antalet rekombinanta kloner, över natten ligering vid 4 ° C föredrages. Sanering av ligeringsprodukter med etanol nederbörd: Tillsätt 1 pl glykogen, 1 | il 3 M NaAc och 25 | il 100% EtOH för att ligeringsreaktionen och fällningen under 1 minut i flytande kväve. Centrifug (15,0000 g under 30 min vid 4 ° C) och kasta supernatanten. Tvätta med 300 | il70% EtOH och centrifug (15.000 g under 20 min vid 4 ° C), kasta supernatanten och torr pellet vid RT (10 min). Återsuspendera pelleten i 10 pl H 2 O 6,2 Omvandling av ligeringsprodukter produkter i elektrokompetenta bakterier Förkyla elektroporering kyvetter (1 mm bredd) på is och tina alikvot av elektrokompetenta DH5a bakterier på is. Lägg 45 pl DH5a bakterier 10 pl städas upp ligeringsprodukten (se ovan) och transfer till kyvett. Transformera bakterier vid 1,5 kV, Ω 200, 15 | iF och tillsätt 1 ml förvärmd SOB-medium direkt efter pulsen leverans. Återhämta bakterier under 1 h vid 37 ° C, spred 100 | il av suspensionen på LB / ampicillin-plattor belagda med IPTG / X-Gal. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C. 6,3 Colony PCR Obs: Colony PCR från enstaka kloner genomföras för att säkerställa att insatserna ärav förutsagda storleken. Fördröjd färgutveckling från den blå / vit screening, oönskade rekombinationshändelser händelser under ligering, inkorporering av oligomera primerpar eller trunkerade PCR-produkter kan annars leda till felaktiga sekvensering resultat. Vi använder rutinmässigt T7-och SP6-primers för att amplifiera insättningar klonade; Detta tillvägagångssätt resulterar i ytterligare vektorsekvenser av ca 150 bp. T7-primer används i sekvenseringsreaktionen i ett senare steg. Inrättat koloni-PCR reaktionen i 96-brunnars platta. För en reaktion använda: 3 | il 2,5 mM MgCl2 2,5 pl 10 x Taq-buffert 1,5 | il 10 mM dNTP 2 | il 2,5 mM T7-primer 2 ^ 2,5 mM SP6 primer 1 il Fermentas Taq-polymeras fylla upp till 25 pl med H2O Dispensera 25 ul / brunn av huvudblandning i varje brunn i en 96-brunnsplatta. Välj positiva (vit) klon från plattan med pipett spets och dopp i PCR-reaktionen. Amplifiera användning följande villkor: 1 cykel 4 min vid 95 ° C 10 cykler 30 s vid 94 ° C, 30 s vid 56 ° C och 30 s vid 72 ° C 30 cykler 30 s vid 94 ° C, 30 s vid 48 ° C och 30 s vid 72 ° C 1 cykel 5 min vid 72 ° C Ladda 5 pl av koloni-PCR på en agarosgel och bestämma reaktioner som innehåller den rätta insättningsstorlek. Kolonistimulerande PCR innehållande de önskade amplikoner städas upp med användning av ett kommersiellt tillgängligt kit (Machery Nagel Nucleofast). 6,4 Big-Dye terminator reaktion och sekvensering Förbered Master Mix för Big-Dye reaktion. För en reaktion använda: 1 | il H2O 0,5 | il Big-färgreagens 1,5 | il buffert Sekvensering Dispensera 3 pl / brunn i varje brunn i en 96-brunnsplatta, till varje brunn tillsattes 2 | il av saneras koloni-PCR-produkten och kördes reaktionen på en termocykler med följande parametrar: <p class="jove-content"> 1 cykel 1 min vid 96 ° C 35 cykler av 10 s vid 96 ° C, 5 s vid 50 ° C och 4 minuter vid 60 ° C The Big-Färg reaktion städas upp med ett kommersiellt kit (Millipore Montage 96 Sekvensering Clean-Up Kit) och bearbetas på ett kapillär sequencer (t.ex. ABI 3100 DNA). Sekvenser analyseras med hjälp av BIQ Analyzer ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) eller online-verktyget Bisma ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) att härleda metyleringsmönstret för den undersökta DNA-regionen (figur 4). 7. Representativa resultat För att få insikt i påverkan av ELS på avp uttrycket och metylering status, var C57BL/6N mössen behandlades enligt arbetsflödet ovan beskrivna. I korthet var en grupp C57BL/6N möss subjected till ELS medan kontrollgruppen fick stå ostörd. Den PVN och supraoptiska kärnan (SON) stansades och DNA och RNA isolerades samtidigt från de enskilda slag. RNA transkriberades omvänt och nivåerna av AVP transkript mättes med qPCR analys och normaliserades till uttrycket av HPRT och GAPDH-gener housekeeping. DNA var bisulfit behandlas, amplifieras med primrar som är specifika för AVP förstärkare (Figur 4a) och PCR-produkterna klonades och sekvenserades. Minst 20 rekombinanta kloner från varje mus / PCR analyserades för att bestämma metylering frekvenser för de CpG i det PCR-amplikon (figur 4b). Jämfört med kontroller ELS inducerade en betydande hypometylering på CpG10, CpG12, CpG13 och Cpg14 av avp förstärkare (p <0,05, n = 6-8 djur) antyder epigenetisk märkning av detta reglerande regionen genom tidiga livserfarenheter. I motsats till den PVN, metylering avAVP förstärkaren var opåverkad av ELS i Sonen visar vävnaden specificitet epigenetisk märkning (figur 4c). Analys av DNA-metylering status vid CpG10 och avp genuttryck i kontrolldjur (n = 6) framgår en negativ korrelation pekar på en roll för DNA-metylering i finjustering av AVP genuttryck (Figur 4d). Figur 1. Micropunches erhålls från dissekerade hjärnor från kontroll-och tidiga liv stressade möss. Efter DNA-och RNA-isolering, är genuttryck bestäms genom QRT-PCR, medan bisulfit behandlade DNA amplifieras och renade produkter klonas i en lämplig vektor som möjliggör identifiering av rekombinanta kloner genom blå / vit selektion. Korrekta insats storlekar kontrolleras avkoloni-PCR före utförandet Big Dye-reaktion och behandling på ett kapillär-sekvenserare. Metylering mönster visualiseras med lämpliga programverktyg. Klicka här för att visa en större bild . Figur 2. Tidslinjen från DNA / RNA-extraktion till bisulfit-sekvensering. Figur 3. Arbetsflöde för samtidig extraktion av DNA och RNA. Stansen av hypotalamuskärna paraventricularis, en liten avp gen som uttrycker hjärnregion, placeras i 400 | il GTA buffert, virvlades tills sönderdelas och vidare homogeniseras genom att passera genom en spruta (29 g). Homogenatet delas sedan för rening av RNA och DNA. Uppdelningen kan vara 1:1 eller olika proportioner beroendepå den speciella experimentella fråga. Homogenat bör behandlas inom några timmar. Figur 4. CpG-metylering vid avp-lokuset i 6 veckor gamla kontroll och ELS djur. (A) ordning för AVP och oxytocin gener orienterad svans till svans och åtskilda av intergenregionen (IGR). Exoner visas med ofyllda (numrerad) lådor. Fördelningen av CpG rester indikeras och storleken och placeringen av de respektive PCR-amplikon som innehåller CpG-10 till CpG14 markeras av en tjock linje. (B) Metylering av AVP förbättrare i PVN i kontrolldjur och ELS djur (n = 6-8). (C) Metylering av AVP förbättrare i SON i kontroll och ELS djur (n = 8-10). (D) avp-genexpression korreleradesmed metylering vid CpG10 (n = 6). Klicka här för att visa en större bild .