Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

同所性肺移植のマウスモデルにおける閉塞性細気管支炎の開発

doi: 10.3791/3947 Published: July 10, 2012

Summary

閉塞性細気管支炎は、肺移植の長期生存に重要な障害と堅牢な前臨床モデルの欠如である閉塞性細気管支炎の免疫病原性を調べて排除します。他の固形臓器移植とは異なり、血管新生マウス肺移植は、ごく最近開発されました。ここでは、マウス同所性単肺移植後に独自に開発した閉塞性細気管支炎モデルを示しています。

Abstract

ラットにおける同所性肺移植は1971年1 Asimacopoulosらによって報告されました。現在、このメソッドは、よく受け入れられ、同種拒絶反応の研究のためだけでなく、肺移植後の虚血再灌流障害のメカニズムを調べるために同系の株の間だけでなく、標準化されています。ラットや他の大型動物モデル2のアプリケーションはこれらの研究の解明に大きく貢献していますが、それらの調査の範囲は、ノックアウトとトランスジェニックラットの不足によって制限されます。閉塞性細気管支炎、肺移植患者の死亡の主要な原因のない効果的な治療のために、閉塞性細気管支炎を複製する前臨床モデルのための集中的な検索がありました。気管移植モデルは、最も広く使用され、閉塞性細気管支炎3の組織病 ​​理学的特徴のいくつかを複製することができます。しかし、そのままvasculatの欠如閉塞性細気管支炎の受信者の指揮の気道、および不完全な病理学的特徴への接続なしのUREは、このモデル4のユーティリティを制限します。他の固形臓器の移植とは異なり、血管新生マウスの肺移植はごく最近の2007 5で初めて岡崎らによって報告されています。ラット肺移植の基本的な原則を適用して、私たちのラボでは、閉塞性細気管支炎の免疫病原性6のさらなる研究を可能にするマイナー組織不適合抗原マウス同所シングル左肺移植を用いた閉塞性細気管支炎モデルを開始しました。

Protocol

1。ドナーの手順

  1. すべての手術は無菌技術を用いて行った。ない抗生物質は、ドナーとレシピエントマウスの両方に指定されていない。
  2. ドナーマウスの麻酔導入は、5%イソフルランで開始されます。
  3. マウスはorotracheally 20ゲージの静脈カテーテルを挿管し、齧歯類の人工呼吸器に置かれ、125回/分と約0.5ミリリットル一回換気量(その体重の2%)の割合で100%酸素を使用しています。
  4. 麻酔は、イソフルラン吸入1-2%維持されます。
  5. ドナーマウスを仰臥位に置かれ、70%アルコールで整形処理。
  6. Laparosternotomyは、結合正中線と横切開として実行されます。
  7. 100 U / kgでヘパリンはちょうど肝臓の下から、下大静脈(IVC)に注入される。
  8. ダイヤフラムは、背骨に向かって腹側の肋骨の添付ファイルに沿って切断され、胸腔は、胸部の両側を切断することによって公開されている首への壁。
  9. 横隔膜レベルでのIVCを切開した後、右心耳をカットされており、肺は冷却の2ミリリットル(4°C)肺動脈のルートで横切開を介した乳酸リンゲル注射とヘパリンの0.1ミリリットル(とフラッシュPA)のトランク。
  10. 呼気終末インフレの三分の二に換気を逮捕し、心肺ブロックを摘出し​​、氷(4℃)に保存されています。
  11. ドナー左肺は、袖口の添付ファイルで受信者のために準備されています。肺靱帯は肺静脈(PV)まで切開されています。門は、食道、大動脈を除去することによって引き出されています。
  12. 門の中で最も頭蓋の側面と同様に、添付の主気管支(Br)の位置PAを識別します。気管支からPAを慎重に分析する。
  13. PAのカフは、24ゲージの静脈内(IV)カテーテルから作られ、0.7 mmの拡張子の付いた長さが0.5mmにカットされています。
  14. カフの表面全体は、その後anastoを容易にするために削られているMOSIS。
  15. 気管支用カフは、20ゲージの静脈カテーテルから派生したもので、0.7ミリメートルの拡張子を持つ1.0ミリメートルの長さにカットされます。
  16. 同じ材料を使用して、PVカフは、ドナーマウスの重量によって異なります。具体的には、マウス24〜27グラ​​ム用カフのサイズは、0.7 mmの拡張子の付いた長さが0.7ミリメートル、22ゲージです。 27〜32グラムを計量したマウスでは、研究では、0.7ミリメートル拡張子の付いた長さが0.7ミリメートル、20ゲージのカテーテルを利用した。
  17. 袖口は、PA、PVとBrの先端に挿入し、9から0縫合糸で固定されています。
  18. ドナー肺がフラッシュされ、ストレージの前に滅菌ヘパリンによる滅菌生理食塩水で洗浄する。ドナー肺は、肺は非常に清潔で滅菌維持し、氷上に滅菌生理食塩水に浸した滅菌ガーゼ(4℃)でラップされています。
  19. 微小血管クランプが気道に乳酸リンゲルエントリを防ぐために、気管支に配置されます。

2。受信者の手順

  1. anesの誘導上記のドナーについて説明したようにthesiaと機械的人工換気は同じです。
  2. 左胸壁を剃毛し、70%アルコールおよび外科フィールドが覆われて整形処理されています。
  3. 開胸切開を背骨の背に近い切開し、心臓に隣接する左肺血管や気管支に置か微小血管クランプを拡張し、左第三肋間で作られています。あなたは、PV、それらの間の門とBrの尾の端で、頭蓋の側面でPAを見ることができます。
  4. クランプ中央の肺門の構造を残したまま、PA、BrおよびPVに軽度の緊張を引き起こすために止血剤で穏やかなトラクションを使用して、左肺は胸腔から引き出されています。
  5. PA、PVおよびBrは、PA、PVおよびBrの周りに疎に配置9から0縫合糸を配置し、続いて鈍的切開によって分離されています。
  6. その外膜鞘から完全にPAを解剖した後、容器の円周の約4分の1の小さな横切開です。動脈の背部分の継続をそのまま残し、前方の壁にしました。
  7. 寒い、乳酸リンゲルに浸した綿ガーゼに包まれ、上述のように調製したドナーの肺は、その後、胸腔内に位置し、袖口は、受信者、PA、PVとBrに挿入され、9から0縫合糸で固定されています。
  8. 肺門クロスクランプは再灌流と換気を可能に削除されます。
  9. 受信者の胸部に戻って移植肺を配置した後、開胸切開を5から0縫合糸を使用してクローズされています。
  10. マウスは麻酔から回復するために許可されています。ブプレノルフィン(0.05から0.15 mg / kg体重)は手術後、および8時間毎2-3日後に手術のためにすぐに投与される。

3。代表的な結果

我々の経験は、それが繰り返される練習の数ヶ月は、マウスの肺移植モデルに習熟するために必要な私たちに教えてくれました。習熟が達成された後、我々作動7日後以内に発生した死亡の96%(100分の96の連続した​​手術)周術期の生存率をchieved。二つの死は手術中に始まった出血によるものであった、とpneumothracesは、他の二つのマウスの死亡の原因となった。すべての手順については、温虚血時間は±3.14分、14.32であり、冷虚血時間は58.51±18.06分であった。三同所性肺移植グループが検討した。同種移植片:C57BL / 6→C​​57BL / 6、同種移植片:C57BL/10→C57BL / 6およびC57BL / 6→C​​57BL/10。私たちは、雄マウスを使用しましたが、男女間に有意な解剖学的違いはありませんので、私たちの技術はまた、雌マウスに適用することができます。

拒絶反応の病理学の成績は、臨床肺移植7( 表1)標準的な基準を活用した盲検で行われた。我々は同種移植片(C57BL / 6→C​​57BL / 6)に軽度またはなし拒絶を観察したのに対し、両方の同種移植片の組み合わせはCOMPAを開発rable急性または慢性拒絶反応( 図1)。対照的に、OBがC57BL/10で有意に多かったday28( 表1)C57BL / 6→C57BL/10グループより→C57BL / 6。

C57BL / 6→
C57BL / 6
C57BL/10→
C57BL / 6
C57BL / 6→
C57BL/10
P-値
拒絶反応病理
28日目​​ ""スコア
0.67±0.89 * 3.33±0.82 * 3.29±0.76 * P> 0.05
OB / 21日と28日の総マウス 0/24(0%) ** 14/34(42.1%) ** 2/16(12.5%) ** P <0.05

表1。閉塞性細気管支炎の移植後の急性拒絶反応と有病率の組織学的スコア。標準CRIによる急性拒絶反応のスコアリング( "A"スコア)teriaは、代表的な結果で説明しています。データは日28移植後に ""スコアの平均値±SDを表す。データは日21日と28日後の移植でOBを開発し、各群のマウスの量と割合を表します。

図1
図1は28日後に肺移植における肉眼所見および組織病 ​​理学。パネル1Aは、肉眼所見とH&E染色された同種移植片肺および右肺ナイーブを表しています。パネル1B及び1Cは、H&Eは、それぞれ、OB、非OBを開発しましたBL / 6マウスの受信者に移植マッソンのトリクローム染色したBL/10肺移植を表しています。 1Bの白い矢印はOBの病変を識別します。パネル1DはBL/10マウスのレシピエントに移植BL / 6肺移植を示しています。

手順の実行中にメインのトラブルシューティングは以下の通りであった。

  1. 血流障害:フラッシュドナー肺まで色は白色になります。過度の圧力を使用すると、肺水腫を引き起こす可能性があります。しかし、移植後に浮腫を防ぐために、あまりにも押さないでください。
  2. ドナーへのカフの挿入の難易度:脈管構造は、十分な長さと接続された脂肪と結合組織の自由であることを確かめる。
  3. 吻合部位で出血する:約5分間患部に圧力を適用するにはQのヒントを参考にしてください。
  4. 受信者のPA血流障害:主にカフを挿入時のねじれに起因する。空気がPA内で観察されている場合、再吻合を行うのに必要です。
  5. 難しいのPV吻合:PVの膜は非常に薄く、簡単に涙です。適切なカフのサイズを選択して、非常に穏やかに、受信者のPVにまっすぐに挿入します。
  6. レシピエントのPV血流障害:カフの位置と方向を確認してください。気管支カフから圧縮を解除します。
  7. 気胸:これはmanipulatioために、どちらかの気管支穿孔が原因である可能性があり気道のn、または移植プロシージャに関連付けられた外傷による肺表面の穿孔。前者は気道壁内の穴の外科的閉鎖で処理され、後者は10から0ナイロン縫合糸を用いた肺表面のリークをover​​sewingによって扱われます。

Discussion

マウスの同所性肺移植は、顕微要求と組織の極端なもろさのために挑戦されています。カフ技術の導入は、ラット8の同所性肺移植の普及を可能にした。これは我々の研究室でマウスに同所性肺移植モデルの開発のための基礎となった。マウスやラットでは、人間と違って、左肺は1つだけ葉が含まれており、全肺気量のわずか25%を占めています。これは左単肺移植循環支援システムを必要とせず、マウスモデルで可能になります。

我々の予備的手術は、移植肺の換気と血流がPV吻合のサイズに大きく依存していたことを明らかにした。特定のPV吻合部カフのサイズは9報告されたドナーとレシピエントに一致するように利用された。不適切なカフのサイズは、PV anastの移植肺や裂開の無気肺のどちらかの結果omosis。岡崎らは、結合された血管結紮の使用を報告し、気管支5をクリッピング。現在の研究で我々は温阻血時間を短縮することが示唆されたすべての肺門構造の動脈瘤クリップを使用しています。マウスモデルにおける同所性左肺移植の一つの制限は、レシピエント動物が彼らの同種移植片5の同種免疫介在性壊死後に生き残ることができるということです。したがって、生存研究は不可能であり、グラフト評価は移植肺10の組織学的検査に依存します。

このテクニックを使用して、我々はマウスの前臨床閉塞性細気管支炎モデルを開発しました。具体的には、ドナーマウスはC57BL/10で、受信者は、C57BL / 6です。これは、閉塞性細気管支炎の病因6のメジャー、マイナー、しない、組織適合性抗原の役割を示唆している。さらに、我々はIL-17は、マウスモデルでは閉塞性細気管支炎を防ぐことが中和報告されています。このモードではlは肺移植の検討と臨床肺移植の進歩のための新しい研究ツールを表します。

Disclosures

利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgments

資金源:健康補助HL067177、HL096845の国立研究所でサポートされているこの作品、とDSWへP01AI084853

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Opmi 6SFC-1880 Prescott’s Inc PMZ014
Harvard Rodent Ventilator Harvard Apparatus 55-7058
20-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100510D
22-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 081015S
24-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100522A
9/0 Meth Blue Virgin Silk Ashaway Line Twine Mfg. CO MBVS-90
10-0 Alcon Surgical Suture Alcon Laboratories, Inc 8065-192101
Black Braided Silk 5-0/18inches Henry Schein M652630
Heparin Sodium 1000 units/ml APP Pharmaceuticals 407156
Betadine Solution Purdue Product 67618-150
Lactated Ringer's injection Hospira NDC 0409-7953-03
C57BL/10 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor
C57BL/6 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor or recipient

Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
  2. Yoshida, S. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
  3. McDyer, J. F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
  4. Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
  5. Okazaki, M. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
  6. Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
  7. Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
  8. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
  9. Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
  10. Li, W. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (2010).
同所性肺移植のマウスモデルにおける閉塞性細気管支炎の開発
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).More

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter