Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Развитию облитерирующего бронхиолит в мышиной модели ортотопической трансплантации легких

doi: 10.3791/3947 Published: July 10, 2012

Summary

Облитерирующий бронхиолит является ключевым препятствием для долгосрочного выживания получателей пересадка легкого, а также отсутствие надежной доклинических модель исключает рассмотрения облитерирующего бронхиолита иммунопатогенезе. В отличие от других твердых трансплантации органов, сосудистой мыши трансплантации легких лишь недавно была разработана. Здесь мы показываем нашу самостоятельно разработал модель облитерирующего бронхиолита после мышиной ортотопической одной трансплантации легких.

Abstract

Ортотопической трансплантации легких у крыс было впервые сообщено Asimacopoulos и его коллеги в 1971 году 1. В настоящее время этот метод хорошо приняты и стандартизированы не только для изучения алло-отказ, но и между сингенных штаммов для изучения механизмов ишемии-реперфузии после трансплантации легких. Хотя применение крыс и других крупных животных 2 модели внесли значительный вклад в выяснение этих исследований, объем этих исследований ограничены нехваткой нокаут и трансгенных крыс. Благодаря нет эффективных методов лечения для облитерирующего бронхиолита, ведущей причиной смерти у пациентов пересадка легкого, наблюдается интенсивный поиск доклинических моделях, которые копируют облитерирующего бронхиолита. Трахеи модели аллотрансплантата является наиболее широко используемым и может воспроизводить некоторые гистологические особенности облитерирующего бронхиолита 3. Тем не менее, отсутствие нетронутыми vasculatЮр, не имеющих отношения к проведению дыхательных путей получателя, и неполное патологические признаки облитерирующего бронхиолита ограничивает полезность этой модели 4. В отличие от трансплантации других солидных органов, сосудистой трансплантации легких мышей только недавно сообщили Окадзаки и его коллеги впервые в 2007 году 5. Применение основных принципов по трансплантации легких крыс, наша лаборатория приступила к облитерирующего бронхиолита модель использования незначительных histoincompatible антигена мышиные ортотопической одного левого легкого трансплантации, которая позволяет в дальнейшем изучении облитерирующего бронхиолита иммунопатогенезе 6.

Protocol

1. Донор процедура

  1. Все хирургические процедуры выполняются с использованием стерильной техники. Нет антибиотики даются донора и реципиента мышей.
  2. Индукция анестезии доноров мыши начинается с 5% Изофлюран.
  3. Мышь orotracheally интубированных с 20 калибра внутривенный катетер, а затем помещают на грызунах вентилятора, с использованием 100% кислорода в размере 125 вдохов / мин и примерно 0,5 мл дыхательного объема (2% от массы тела).
  4. Анестезия поддерживается с вдыхаемым 1-2% Изофлюран.
  5. Донорами мышь находится в лежачем положении, нацелен на 70% спирте.
  6. Laparosternotomy выполнена в виде комбинированной линии и поперечный разрез.
  7. Гепарин 100 ЕД / кг вводят в нижнюю полую вену (НПВ), с чуть ниже печени.
  8. Диафрагму разрезают вдоль брюшной реберной привязанность к позвоночнику и грудной полости подвергается, сокращая обе стороны грудистены на шее.
  9. После надрезание IVC на уровне диафрагмы, в правом предсердии придаток режется и легкие промыть 2 мл охлажденной (4 ° С), лактата Рингера впрыском и 0,1 мл гепарина через поперечный разрез в корне легочной артерии ( PA) ствола.
  10. Арест вентиляции на две трети в конце выдоха инфляции, сердца и легких блоков вырезали и хранили на льду (4 ° С).
  11. Легких донора левой готовится к получателю крепления манжеты. Легочной связки вырезается до легочных вен (PV). Рубчик выносится на удаление пищевода и аорты.
  12. Определить ПА, расположенной на самой черепной аспект воротах, а также прилагаемые главного бронха (Br). Тщательно анализировать ПА из бронхов.
  13. PA манжета из 24 калибра внутривенное (IV) катетер и сократить до 0,5 мм в длину с расширением 0,7 мм.
  14. Вся поверхность манжеты затем прошлифовать для облегчения anastoMOSIS.
  15. Манжета для бронхов происходит от 20 калибра катетер, и нарезать длиной 1,0 мм с расширением 0,7 мм.
  16. Используя те же материалы, манжеты PV меняется в зависимости от веса донора мыши. В частности, для мышей 24-27 граммов манжеты размер составляет 22 калибра 0,7 мм в длину 0,7 мм расширением. Для мышей весом 27-32 грамм, исследования использовали 20 калибра катетер, который составляет 0,7 мм в длину 0,7 мм расширением.
  17. Манжеты вставляются в дистальных концов ПА, ПВ и Br и закрепляется 9-0 шва.
  18. Донор легких покраснел и промывают стерильным физиологическим раствором с гепарином стерильной перед хранением. Донор легких затем обматывают стерильной марлей, смоченной в стерильном физиологическом растворе на льду (4 ° С), который держит легких очень чисто и стерильно.
  19. Зажим микрососудов находится на бронхи, чтобы предотвратить вступление лактата Рингера в дыхательные пути.

2. Получатель процедур

  1. Индукция ANESанестезии и искусственной вентиляции легких такие же, как описано выше доноров.
  2. Левая стена грудь побрился и нацелен на 70% спирте и хирургического поля задрапированы.
  3. Торакотомия разрез в левой третьего межреберья, расширяя разрез сверху близко к позвоночнику, и микрососудов зажим Расположенные слева легочных сосудов и бронхов, прилегающих к сердцу. Вы можете видеть, PA в черепной аспект, PV на хвостовом конце воротах и ​​Br между ними.
  4. Использование нежной тяги на кровоостанавливающего, чтобы вызвать легкое напряжение на ПА, Br и PV, левого легкого вырывается из грудной полости, оставляя центральных структур грудной зажаты.
  5. ПА, ПВ и Br изолированы от тупой диссекции следует поместить 9-0 шов расположен свободно вокруг ПА, ПС и Br.
  6. После вскрытия ПА полностью от адвентиции влагалища, небольшой поперечный разрез приблизительно 1/4 окружности судна являетсясделано в передней стенке, в результате чего продолжение спинной части артерии нетронутыми.
  7. Донор легких, завернутый в холод, лактата Рингера пропитанной хлопковой марли и получали, как описано выше, то положение в грудной полости, и манжет вставлена ​​получателя ПА, ПВ и Br и закрепляется 9-0 шва.
  8. Грудной зажим крест удален позволяет реперфузии и вентиляции.
  9. После размещения трансплантированных легких обратно в получатель грудной клетки, торакотомия разрез закрыт с помощью 5-0 шва.
  10. Мышь имеет право взыскать с анестезией. Бупренорфин (0,05-0,15 мг / кг) вводят сразу после операции, и каждые 8 ​​часов в течение 2-3 дней после операции.

3. Представитель Результаты

Наш опыт учит нас, что он требует нескольких месяцев повторяют практику, чтобы стать специалистами в пересадке легкого модель мыши. После того, как знание достигается, мыchieved 96% (96/100 последовательных операций) периоперационной выживаемость при смерти, происходящих в течение семи дней после операции. Две смерти были связаны с кровотечением, которое началось во время операции, и pneumothraces были причиной смерти в двух других мышей. Для всех процедур, теплое время ишемии 14,32 ± 3,14 минут, а холодное время ишемии 58,51 ± 18,06 минут. Три группы ортотопической трансплантации легких изучали: isograft: C57BL / 6 → C57BL / 6, аллотрансплантата: C57BL/10 → C57BL / 6 и C57BL / 6 → C57BL/10. Мы использовали только самцов мышей, но наш метод может быть также применен к самкам мышей, потому что нет никаких существенных анатомических различий между полами.

Классификация отказа патология была проведена в слепым методом с использованием стандартных критериев для клинической трансплантации легких 7 (табл. 1). В то время как наблюдается легкая или не отказ в isograft (C57BL / 6 → C57BL / 6), как аллотрансплантат комбинации разработанных компаниямиРабле острого или хронического отторжения (рис. 1). В отличие от ОВ достоверно чаще в C57BL/10 → C57BL / 6, чем C57BL / 6 → C57BL/10 группы day28 (табл. 1).

C57BL / 6 →
C57BL / 6
C57BL/10 →
C57BL / 6
C57BL / 6 →
C57BL/10
P-значение
Отказ патологии
"А" Счет на 28-й день
0,67 ± 0,89 * 3,33 ± 0,82 * 3,29 ± 0,76 * Р> 0,05
OB / Всего мышей в день 21 и 28 0/24 (0%) ** 14/34 (42,1%) ** 2/16 (12,5%) ** P <0.05

Таблица 1. Гистологическое оценки острого отторжения и распространение облитерирующего бронхиолита после пересадки. Скоринг острого отторжения ("A" результаты) с помощью стандартных критерияteria, как описано в представительные результаты. Данных представляет собой среднее ± стандартное отклонение "А" результаты на дней 28 после трансплантации. Данные представляют количество и процент мышей в каждой группе, которая разработала Б. в дни 21 и 28 после трансплантации.

Рисунок 1
Рисунок 1. Макроскопические выводы и гистопатология через 28 дней после трансплантации легких. Группа 1А представляет макроскопических выводы и H & E окрашенных легких Isograft и право наивно легких. 1В и 1С группа представляет собой H & E и трехцветного окрашенных Массона BL/10 легких аллотрансплантата пересаживают в BL / 6 мышей получателя, который разработал О. и не О.Б., соответственно. Белая стрелка указывает 1B поражений ОВ. Группа 1D показывает BL / 6 легких аллотрансплантата пересаживают в BL/10 мыши получателя.

Главная устранения неисправностей во время процедуры были следующими.

  1. Кровоток расстройства: Флеш легких донора доцвет становится белого цвета. Использование избыточного давления может вызвать отек легких. Но не давите слишком сильно, чтобы предотвратить отек после пересадки.
  2. Сложность манжеты вставки в доноры: Удостоверьтесь, что сосудистая имеет достаточную длину и бесплатно прилагается жира и соединительной ткани.
  3. Кровотечение на месте анастомоза: Используйте Q советы, чтобы оказать давление на пораженный участок в течение приблизительно 5 минут.
  4. Получатель ПА кровоток препятствия: в основном вызвано кручение в манжете вставки. Если воздух наблюдается в ПА повторно делать анастомоза необходимо.
  5. Трудно анастомоза PV: PV Мембрана очень тонкая и легко слез. Выберите нужный размер манжеты и вставить прямо в PV получателя очень мягко.
  6. Получатель PV кровотока препятствие: Убедитесь, что положение и направление манжеты. Отпустите сжатия от бронхиальной манжеты.
  7. Пневмоторакс: Это может быть вызвано либо бронхиальной перфорации из-за manipulatioп дыхательных путей, или перфорация поверхности легких из-за травмы связаны с процедуры трансплантации. В первом случае лечение с хирургическим закрытием отверстия в стене дыхательных путей, а это последнее трактуется oversewing утечки на поверхность с помощью легких 10-0 нейлона шва.

Discussion

Ортотопической трансплантации легких у мышей является сложной задачей в связи с микрохирургической требования и чрезвычайная хрупкость тканей. Введение в манжету техники позволило широко распространенное использование ортотопической трансплантации легких у крыс 8. Это стало основой для разработки модели ортотопической трансплантации легких у мышей, в нашей лаборатории. У мышей и крыс, в отличие от людей, левого легкого содержит только одну долю и составляет лишь 25% от общей массы легких. Это делает левая одной трансплантации легких возможно в мышиной модели без системы поддержки кровообращения.

Наши предварительные операции выяснилось, что вентиляция и кровоснабжение пересаженных легких в значительной степени зависит от размера PV анастомоза. Конкретные PV анастомоза Размер манжеты были использованы в соответствии с донорами и получателями, как сообщил 9. Несоответствующий манжета размера в результате либо ателектаз трансплантированных легких или зияние в PV anastomosis. Окадзаки и др. сообщили об использовании комбинированных перевязки сосуда и отсечения бронха 5. В настоящем исследовании мы используем аневризмы клип для всех внутригрудных структур, которые мы предлагаем может сократить теплой ишемии. Одним из ограничений ортотопической трансплантации левого легкого в мышиной модели является то, что получатель животные могут выжить после аллоимунный опосредованного некроз их аллотрансплантатов 5. Таким образом, выживание исследований не представляется возможным и взяточничества оценка зависит от гистологического исследования пересаженных легких 10.

Используя эту технику, мы разработали модель доклинических облитерирующего бронхиолита у мышей. В частности, доноры мыши C57BL/10 и получатель C57BL / 6. Это говорит о роли несовершеннолетнего, а не основной, гистосовместимости антигенов в патогенезе облитерирующего бронхиолита 6. Кроме того, мы уже сообщали нейтрализации IL-17 позволяет облитерирующий бронхиолит в мышиной модели. Этот режимл представляет собой новый инструмент исследования для изучения трансплантации легких и улучшения клинической трансплантации легких.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Источники финансирования: Эта работа поддерживается Национальным институтом здравоохранения грантов HL067177, HL096845 и P01AI084853 в DSW

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Opmi 6SFC-1880 Prescott’s Inc PMZ014
Harvard Rodent Ventilator Harvard Apparatus 55-7058
20-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100510D
22-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 081015S
24-gauge I.V. catheter Terumo Medical Corporation 100522A
9/0 Meth Blue Virgin Silk Ashaway Line Twine Mfg. CO MBVS-90
10-0 Alcon Surgical Suture Alcon Laboratories, Inc 8065-192101
Black Braided Silk 5-0/18inches Henry Schein M652630
Heparin Sodium 1000 units/ml APP Pharmaceuticals 407156
Betadine Solution Purdue Product 67618-150
Lactated Ringer's injection Hospira NDC 0409-7953-03
C57BL/10 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor
C57BL/6 Harlan Sprague-Dawley 8-12 weeks, 25-30g Male, Donor or recipient

Table 2. Table of mice, specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).
  2. Yoshida, S. Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits. Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).
  3. McDyer, J. F. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).
  4. Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation. Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).
  5. Okazaki, M. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
  6. Fan, L. Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation. Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).
  7. Stewart, S. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).
  8. Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).
  9. Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).
  10. Li, W. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (2010).
Развитию облитерирующего бронхиолит в мышиной модели ортотопической трансплантации легких
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).More

Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation. J. Vis. Exp. (65), e3947, doi:10.3791/3947 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter