Abstract
Tumore bilden eine einzigartige immunsuppressive Mikroumgebung (Tumor-Mikroumgebung, TME), wobei Leukozyten in den Tumor durch verschiedene Chemokine und Wachstumsfaktoren 1,2 rekrutiert werden. Sobald jedoch in der TME, verlieren diese Zellen die Fähigkeit, die Antitumor-Immunität zu fördern und zu beginnen, das Tumorwachstum zu unterstützen und nach unten zu regulieren Anti-Tumor-Immunantwort 3-4. Studien zur Tumor-assoziierte Leukozyten wurden in erster Linie aus Zellen isoliert konzentriert Tumor-drainierenden Lymphknoten oder der Milz aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten, ausreichende Zellzahlen und Reinheit aus dem Primärtumor. Während die Identifizierung der Mechanismen der Zell-Aktivierung und-handel durch das lymphatische System von tumortragenden Mäusen ist wichtig und kann Einblick in die Kinetik von Immunantworten gegen Krebs geben, nach unserer Erfahrung viele Leukozyten, einschließlich dendritischen Zellen (DCs), in der Tumor-Trockenlegung Lymphknoten haben einen anderen Phänotyp als jene, die Tumore infiltrieren 5,6. Darüber hinaus haben wir zuvor gezeigt, dass T-Zellen isoliert aus adoptiv-Übertragung der Tumor-Lymphknoten nicht toleriert und die imstande sind, sekundäre Stimulation in vitro im Gegensatz T-Zellen aus dem TME isoliert werden, die toleranten und unfähig Proliferation oder Cytokin sind Produktion 7,8. Interessanterweise haben wir gezeigt, dass eine Änderung der Tumor-Mikroumgebung, wie die Bereitstellung von CD4 + T-Helferzellen über adoptiven Transfer, fördert die CD8 + T-Zellen zur Aufrechterhaltung pro-inflammatorischen Effektorfunktionen 5. Die Ergebnisse von jedem der zuvor erwähnten Studien zeigen die Wichtigkeit der Messung zellulärer Reaktionen von TME-infiltrierenden Immunzellen, um Zellen, die in der Peripherie bleiben gegenüber. Um die Funktion von Immunzellen, die Tumoren mit der Miltenyi Biotech Isolation System 9 infiltrieren Studie haben wir geändert und diese Antikörper-basierte Isolierung Verfahren optimiert, um hohe e erhaltennriched Populationen von Antigen-präsentierenden Zellen und Tumor-Antigen-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten. Das Protokoll umfasst eine detaillierte Analyse der Maus Prostatagewebe aus einem spontanen Prostata-Tumor-Modell (transgene Adenokarzinom der Prostata-Maus TRAMP) 10 und eine subkutane Melanom (B16) Tumormodell durch anschließende Reinigung verschiedener Leukozytenpopulationen gefolgt.
Protocol
1. Isolierung von myeloischen Zellen von TRAMP Prostata-Tumoren
- Alle Arbeiten wurden unter der Leitung eines Tieres Review Board durchgeführt. TRAMP Mäuse bilden spontan autochthonen Prostatatumoren als Ergebnis eines Transgens (SV40) von der Probasin-Promotor 10 gesteuert. Jede männliche Maus für dieses Verfahren verwendet werden kann. Während TRAMP Tumoren in jedem Alter geerntet werden kann, ist anzumerken, dass TRAMP Prostatatumoren Allgemeinen klein bleiben, bis die Mäuse Alter größer als 20 Wochen zu erreichen. Einschläfern Mäuse durch CO 2-Erstickung. Entfernen Sie den Urogenitaltrakt (UGT), durch Aufschneiden der Bauchhöhle und Zurückziehen des Fettgewebes. Fettgewebe ist schaumig, glänzenden Gewebe suchen.
- Suchen Sie die Blase, es liegt direkt zwischen den beiden großen, weißen Samenblasen. Halten Sie auf der Blase mit einer Pinzette. Halten Sie die Schere geschlossen, glätten Fettgewebe und suchen Sie die Harnröhre. Reduzieren Sie vor dem uRethra als in der Nähe des Beckens wie möglich zu trennen das Vas deferens. Während das Abholzen, gleichzeitig nach oben ziehen auf die Blase. Hierdurch wird die gesamte UGT, die nun kann unter dem Mikroskop zerlegt zu jedem der Lappen der Prostata zu erhalten.
- Legen Sie die UGT in Raumtemperatur PBS. Verwenden Sie ein Binokular, um die UGT visualisieren und zu beseitigen überschüssiges Fettgewebe. Mit einer Pinzette, auf die Harnröhre zu halten und sammeln die ventralen, lateralen und vorderen Lappen der Prostata. Platzieren Sie das Gewebe in PBS während Sie den Rest der Lappen zu sammeln.
- Entfernen Sie die Samenblasen und zu verwerfen.
- Drehen Sie das verbleibende Gewebe 180 °. Sammeln Sie die ampulläre Drüse und dorsalen Prostata-Lappen.
- Mit einer Pinzette, necken abgesehen das Prostatagewebe und legen Sie sie in die Verdauung (Dissoziation) Puffer.
- Platz Tumorgewebe in 1 ml Dissoziationspuffer (100 U / ml Collagenase Typ IV und 100 pg / ml DNase in RPMI + 10% FBS). Jeder Tumor kann require einzigartige Dissoziation Bedingungen; für TRAMP Prostatatumoren, verwenden Sie 1 ml und für B16 Tumoren, verwenden Sie 5 ml (siehe unten). Hinweis: der Grad der Collagenase (I-IV) wird auf der Zell-Population abhängig zu sein, isoliert; myeloischen Zelle isoliert ist am besten mit Typ IV, während Lymphozyten-Ertrag ist höher mit Typ I.
- Das Röhrchen bei 37 ° C-Inkubator für 30 min.
- Und Abpipettieren mit einer 1 ml Pipette, um eine leicht fließende Einzelzellsuspension bekommen.
- Filter Suspension durch 70-Mikron-Filter und wäscht mit MACs Trennpuffer mit 10% FBS für myeloische Zellisolation ergänzt 3x.
- Zentrifuge Zellsuspension bei 400 × g für 10 min. Dann spülen Sie das Pellet mit 10 ml MACS-Puffer und zentrifugieren wieder mit den gleichen Einstellungen.
- Zellpellet in 100 ul MACS-Puffer. Als Nächstes fügen 1 pg anti-CD16/32 Antikörper (Ak) pro 10 8 Zellen (200 ul 2.4.G2 Hybridomkulturüberstand) und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. Hinweis: ter Menge von FcR-γ blockieren Antikörper (Ak), die zugegeben werden kann in Abhängigkeit von der Frequenz / Anzahl der FcR-γ +-Zellen in dem Gewebe und dem Volumen der Zellsuspension, daher kann dieser Schritt optimiert werden müssen.
- Zugabe von 100 ul "Pan-DC" oder 10 ul anti-CD11b, CD11c Anti-oder Anti-PDCA-1 MicroBeads pro 10 8 gesamten Zellen, abhängig von der gewünschten Zellpopulation. Hinweis: die Menge an MicroBeads variieren kann in Abhängigkeit von der Frequenz / Anzahl der Zellen der gewünschten Population im Gewebe, daher kann dieser Schritt optimiert werden müssen.
- Gut mischen, indem Sie vorsichtig flicking Rohr (nicht vortexen) und Inkubation für 15 min bei 4-8 ° C, vor Licht geschützt. Nicht auf Eis inkubieren.
- Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml von MACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 xg für 10 min.
- Überstand abgießen und vollständig resuspendieren Zellen in 500 ul MACS-Puffer. Tumor-Zell-Suspensionen fließen besser durch die LC-Säulen. (AndereAuswahl: MS, LS, LD).
- Tragen Sie eine frische Spalte auf den Magnet-Separator. Prime die Säule durch Spülen mit einer entsprechenden Menge an MACS-Puffer für die Spalte ausgewählt: Für die LC-und MS-Spalten verwenden 500 pl. Für LS-oder LD-Spalten verwenden 1 ml. Nach der Grundierung der Spalte gelten Zellsuspension auf den Kopf der Kolonne. Verwendung einer Spalte pro 1 x 10 8 Zellen.
- Sammle unmarkierten Zellen (Pass-Through) und waschen Sie die Spalte ein Minimum von drei (bis fünf) mal mit 500 ul Volumen von insgesamt 1,5 bis 2,5 ml Flüssigkeit zu waschen. Den Waschschritt 1 durch die MACS-Puffer auf die Säule, es ist wichtig, dass die Säule fließen. Sobald die Säule auf den letzten Tropfen tropft, fügen Sie mehr Puffer. Lassen Sie sich nicht Säulenstativ ohne Strömung oder lassen Sie es trocken laufen (dieser ist nicht zu unterschätzen, wie Trocknen der Säule werden kann Reinheit zerstören und führen zu signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen.). Für Waschschritt 2, spülen Sie die Säule mit Dissoziationspuffer Mix (mit Collagenase + DNase als debeschrieben in Schritt 1.7), dies dient als "härter" Waschschritt zu spülen, klebrige Ablagerungen von toten oder sterbenden Tumorzellen. Den Waschschritt 3 mit MACS-Puffer, wenn der Durchfluss durch sieht nicht so ganz klar nach Waschschritt 3, weiterhin für 2 zusätzliche Waschschritte mit MACS-Puffer (für insgesamt 5 Wäschen) zu waschen. Für große subkutane Tumoren (zB B16-Melanom), während der letzten Waschschritt unter leichtem Druck mit einem behandschuhten Finger an den Kopf der Kolonne, das löst zusätzliche Trümmer für eine saubere, gereinigte Zellpopulation. Dieser Schritt ist nicht für festes Gewebe Tumoren wie Prostata erforderlich, verwenden Sie stattdessen zusätzliche Waschschritte, Waschen mit insgesamt mindestens 5-6 mal.
- Entfernen Sie die Spalte aus dem Magnetabscheider und legen Sie es auf ein geeignetes Auffanggefäß. 2 ml Puffer auf die Säule. Sammeln Sie die magnetisch markierten Zellen durch Anlegen des Kolbens fest mit der Säule zugeführt.
- Count Zellzahl und bestätigen Reinheit für das ausgewählte Zellpopulation durchDie durchflusszytometrische Analyse. Für die Identifizierung von DC-Populationen, sind vorgeschlagen Marker CD45, CD11c, PDCA-1, B220 und CD11b. Vorgeschlagene Makrophagen-Marker sind CD45, CD11b, F4-80 und Ly6C.
2. Isolierung von adoptiv übertragen T-Zellen aus Subkutane B16 Melanom-Tumoren
Dieses Protokoll arbeitet am besten mit Tumoren, die 250 mm 2 oder weniger (geschätzt durch Messung halbiert Durchmesser des Tumors) sind.
- B16 Tumorzellen wurden subkutan in C57BL injiziert / 6 Mäusen und Tumor-Messungen wurden alle 2 Tage 8. Mäuse mit Tumoren messen 250 mm 2 werden durch CO 2-Erstickung getötet. Verwendung autoklaviert chirurgische Instrumente mit 70% EtOH gewaschen, geschnitten Tumor in kleine (<3 mm) Stück und Inkubieren in 5 ml Dissoziationslösung (RPMI-Medium mit 5% FBS, Collagenase Typ I (200 U / ml) und DNase I (100 ug ergänzt / ml)) für 30 min bei 37 ° C, Pipettieren (unter Verwendung einer 1000 μl Pipettenspitze) und Vortexen alle 10 Minuten während der Inkubation. Wenn myeloischen Zellen anschließend isoliert werden, ersetzen 5% FBS und Collagenase Typ I mit 10% FBS und Kollagenase vom Typ IV (200 U / ml), jeweils.
- Nach der Inkubation passieren Zellsuspension durch ein 70 um Zellsieb und waschen zweimal mit 10 ml MACS-Puffer (vorbereitet Anweisungen des Herstellers, Miltenyi Biotech). Optional - bei sehr großen Tumoren (> 300 mm 2), können Entzündungszellen im Voraus angereichert werden mittels Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll oder Percoll).
- Saugen Sie den Überstand Wäsche und fügen 1 pg anti-CD16/32 antibody/10 8 Zellen (200 ul von Klon 2.4.G2 Kulturüberstand) und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
- Ohne Waschen, fügen Sie 1 pg anti-Thy1.1 PE Antikörper pro 10 8 Zellen zugeben, durch leichtes anstossen das Rohr und Inkubation für 30 Minuten auf Eis, vom Licht abgeschirmt.
- Waschen Sie die Zellen, um ungebundene pri entfernenMary Antikörper durch Zugabe von 10 ml MACS-Puffer und Zentrifuge bei 400 xg für 5 Minuten.
- Den Überstand aspirieren und mit 20 ul Anti-PE-Mikroperlen (Miltenyi Biotech) pro 10 7 Zellen insgesamt, nach den Anweisungen des Herstellers.
- Gut mischen, indem Sie vorsichtig flicking Rohr (nicht vortexen) und Inkubation bei 4 ° C (kein Eis) für 15 Minuten, vom Licht abgeschirmt. Achtung: Verwirbelung kann die Integrität der Kügelchen zu verringern.
- Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml MACS-Puffer und Zentrifuge bei 400 xg für 5 Minuten.
- Absaugen des Überstandes und Resuspendieren Sie die Zellen in 500 ul MACS-Puffer. Bei Tumoren von einer größeren Größe (> 300 mm 2), 1 ml Puffer verwenden.
- Platzieren Sie ein LC (Large Cell)-Spalte in der Magnetfeld-Separator. Tumor-Zell-Suspensionen fließen am besten durch diese Spalten. Spülen Sie die Säule mit 500 ul MACS-Puffer, um die Spalte zu entlüften. Die meisten Tumoren werden auch durch LS und LD Spalten fließen, müssen jedoch weiter die Verdauung und mechanische disruption, um die angemessene Höhe der einzelnen Zell-Suspension zu erreichen. Die Säule wird mit 1 ml MACS-Puffer, um die Spalte zu entlüften.
- Bewerben Zellsuspension auf die Säule und lassen Sie sie vollständig durchfließen (ohne dass die Säule laufen trocken). Als nächstes mit 500 ul MACS-Puffer waschen, und wiederholen Sie 3x Waschen. Nur neue Puffer, wenn die Spalte leer ist, aber lass nicht zu, die Säule ohne Strömung stehen. Dies führt zu Verstopfungen und verminderte Reinheit.
- Dies ist ein entscheidender Schritt für große subkutane Tumoren: Nach dem letzten Waschschritt mit einem behandschuhten Finger Spitze, sanften Druck auf den Kopf der Kolonne noch auf dem Magnetabscheider. Dadurch wird zusätzliche Trümmer für eine rein angereicherte Population. Anschließend waschen Sie die Spalte 1 mehr Zeit mit 500 ul MACS-Puffer.
- Entfernen Sie die Spalte aus dem Abscheider und legen Sie sie in einem sauberen 15 ml konischen Röhrchen, 2 ml MACS-Puffer auf die Säule. Spülen Sie die magnetisch markierte cells einsetzen, indem er den Kolben in die Spalte.
- Zentrifuge der eluierten Fraktion bei 400 × g für 5 min. Reinheit bei diesem Schritt liegt typischerweise zwischen 75-80%. Auf> 90% Reinheit zu erreichen, wiederholen Sie die magnetische Trennung wie in Schritt 1,10-1,12 beschrieben unter Verwendung eines neuen MS-Säule. Die MS-Säule ist kleiner und kompakter, so dass die Suspension langsamer ausgeführt wird durch die Säule, aber höhere Zahlen und Reinheit der Zelle von Interesse zu erhalten.
- Count Zellzahl für weitere Experimente zu überprüfen und Reinheit durch durchflusszytometrische Analyse. Für die Isolierung von T-Zellen adoptiv übertragen, wie sie in diesem Protokoll beschrieben, umfassen allelischer Marker für die Identifizierung CD45 und Thy1.1 (überführt Zellen) und Thy1.2 (Wirts-T-Zellen).
3. Repräsentative Ergebnisse
Die Ausbeute an eine bestimmte Zellpopulation (zB Makrophagen, DC, T-Zelle, etc.) variieren je nach der Größe des Tumors und Behandlungen, die Administrator wareneingetragene während des Tumorwachstums. Eine Prostata von einer unbehandelten 14-16 Wochen alten TRAMP-Maus sollte zwischen 8x10 5-1x10 6 CD11c + / PDCA-1 + (DC)-Zellen bei 90-95% Reinheit oder 1x10 6-1.5x10 6 F4/80 + / CD11b nachgeben + (Makrophagen) bei 80-90% Reinheit von 300 mg Gewebe nach der Trennung Protokoll oberhalb wie in 1 gezeigt. Die Anzahl der jedem dieser Zellen leicht erhöht auf adoptiven Transfer von Tumor-Antigen-spezifischen T-Zellen. Schlechte Reinheit ist meist eine Folge von zu wenig Wäsche, so dass die Spalte, um zu trocknen (die in Tumor Abfallrückhaltungsstrukturen in der Spalte führen) oder unzureichende Fc-Rezeptor blockiert.
In ähnlicher Weise werden die gesamten Zellen von B16 Tumoren isoliert auch in Abhängigkeit von der Tumorgröße bei der Gewebeentnahme und adoptiven Transfer von T-Zellen (Übertragung von 5x10 6) mit oder ohne DC-Impfstoff (Übertragung von 1x10 5). Nur sehr wenige Antigen-speT-Zellen infiltrieren cific den Tumor sei denn, eine Antigen-gepulsten DC-Impfstoff wird auch einen Tag nach T-Zell-Transfer gegeben. Wenn eine DC-Impfstoff zu einer Maus, die ein kleines, tastbare (<50 mm 2) Tumor, eine Ausbeute von etwa 3x10 5 Thy1.1 + T-Zellen, mit einer Reinheit von 80-85% verabreicht wird, würde ein "gut betrachtet werden "ernten, wie in 2A gezeigt. Allerdings, wenn größere Tumoren geerntet werden, werden insgesamt Ausbeute und Reinheit reduziert werden.
Makrophagen (F4/80 + / CD11b +) sind in der Regel ein kleinerer Prozentsatz der gesamten Zellen in Tumoren B16. 2B zeigt, dass die Verwendung von CD11b, von einem Tumor, dass 250 mm 2 ist, ergibt ca. 1x10 6 Makrophagen bei 90-95% Reinheit . Zusätzlich 2B zeigt, dass die DC-Population in B16 Tumoren heterogen sind. Anders als bei Prostatatumoren, zwei Subpopulationen: CD11c + / PDCA-1 + (plasmazytoiden DC) und CD11c+ / PDCA-1 - (konventionellen DC) kann von B16 Melanom-Tumoren erreicht werden. Schätzungsweise 2x10 6 pDC und 4x10 6 CDC von 250 mm 2 B16 Tumoren bei 80-90% Reinheit erwartet. Geringere Reinheit ist in der Regel eine Folge der nicht Räumung der Tumorzellen von der Säule. Schritt 2.12 ist ein kritischer Schritt, um die kleine Gruppe von Melanomzellen, die an der Basis der Säule besteht entfernen. Nach diesem Schritt verbessert die Wirksamkeit der Waschschritte und führt zu einer besseren Reinheit.
Abbildung 1. DCs (CD11c + / PDCA-1 +) und Makrophagen (F4/80 + / CD11b +) wurden aus einer TRAMP Prostata-Tumor isoliert. Dot-Plot-Werte repräsentieren Prozentsatz an Zellen von Interesse Pre-oder Post-Reinigung.
Abbildung 2. (A) AdoptivEly übertragen Thy1.1 + / CD8 + T-Zellen und (B) myeloischer Zellen einschließlich CD11c + / PDCA-1 + plasmazytoide DCs, CD11c + / PDCA-1 - konventionelle DCs und F4/80 + / CD11b + Makrophagen wurden aus subkutanen isoliert B16-Melanom Tumor aus Thy1.2 + Mäuse. Dot-Plot-Werte repräsentieren Prozentsatz an Zellen von Interesse Pre-oder Post-Reinigung.
Discussion
Dieses Protokoll kann geändert werden, basierend auf der Größe und Herkunft des Tumors (subkutane, spontane Tumor, oder orthotopen Tumoren). Bei größeren Tumoren, wird empfohlen, um die Menge an Dissoziationspuffer, MACS-Puffer, und die Anzahl der Spülgänge erhöhen. Die Herzlichkeit von Zellen isoliert kann auf der TME, aus denen sie angereichert sind abhängen. Zum Beispiel, in unserer Erfahrung, isolierten Zellen aus spontaner Prostatatumoren sanftere Dissoziation als Zellen aus subkutane B16 Melanom-Tumoren isoliert erfordern. Bei der Präparation des Tumors, so viel Fett, Haut oder andere Ablagerungen, die wirksam verhindern kann eine enzymatische Dissoziation zu beseitigen. Es ist wichtig, vollständig zu verdauen und zu erhalten Tumormassen eine Einzelzellen-Suspension, um eine ordnungsgemäße Ab Kennzeichnung zu gewährleisten und Spalten aus Verstopfen zu verhindern. Für myeloiden Zellen isoliert wurde die Menge von fötalem Kälberserum im MACs Isolierungspuffer empfohlen von 2% bis 10% erhöht werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Es ist auch essential bis alle Puffer und Zellen Kälte gesamten Protokoll zu halten, um nicht-spezifische Bindung und Ab ein Verstopfen der Säule zu verhindern. Abschließend, um hoch angereicherte Population von Antigen-präsentierenden Zellen und Tumor-Antigen-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten zu erhalten, haben wir modifiziert und optimiert eine Antikörper-basierte Verfahren zur Isolierung unter Verwendung des Miltenyi Biotech-Technik. Mit Hilfe dieses Protokolls kann beide adoptiv übertragen und endogene Leukozyten-Populationen angereichert mit ABS gegen Zelltyp-spezifische Oberflächenmarker gerichtet werden. Ein Vorteil der beschriebenen Verfahren ist die Reduktion der Tumor Schutt Carry-Over nach einer umfassenden und gründlichen Waschen. Dies schließt die Verwendung von Collagenase zur Waschpuffer sowie die Identifizierung eines Punktes, bei welchem Druck auf die Säule gegeben kann Spalte Clogs von Tumorzellen zu eliminieren. Erhalten einer ausreichenden Anzahl von Immunzellen aus Geweben, insbesondere in einer Reinheit, die für die funktionelle Analyse ist, kann eine schwierige Aufgabe sein.Aber nach unserer Erfahrung das Protokoll hier ergibt sich die höchste Anzahl von Zellen, an der größten Reinheit, mit der die meisten Konsistenz.
Disclosures
Die Autoren haben keine entsprechenden Angaben.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Scott Durham für Durchsicht des Manuskripts und Video danken. Diese Arbeit wird in-part von der intramuralen Forschungsprogramm des NIH, NCI unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase I | GIBCO, by Life Technologies | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
| Collagenase IV | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | Use for myeloid selection |
| DNase | Calbiochem | 260913 | |
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | 21870 | |
| Dulbecco’s PBS | Lonza Inc. | 17-5158 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza Inc. | 14-501F | |
| MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
||
| Thy1.1 PE | eBioscience | 551401 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-294 | |
| Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotec | 120-003-183 | |
| Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-300 | |
| LC column | Miltenyi Biotec | 130-042-202 | |
| MS column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 |
References
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