I dette arbeidet skal vi forklare fabrikasjon og bruk av en microfluidic mikser stand til å blande to løsninger i ~ 8 μs. Vi har også demonstrere bruken av disse miksere med spektroskopiske deteksjon ved hjelp av UV fluorescens og fluorescens resonans energi overføring (FRET).
Den prosessen som et protein brettes inn i sitt opprinnelige eksteriør er svært relevant for biologi og helse likevel dårlig forstått. En årsak til dette er at folding foregår over et bredt spekter av tidsskalaer, fra nanosekunder til sekunder eller lenger, avhengig av protein 1. Konvensjonelle stoppet-flow miksere har tillatt måling av folding kinetikk som starter på ca 1 ms. Vi har nylig utviklet en microfluidic mikser som utvanner denaturant ~ 100 ganger i ~ 8 μs to. I motsetning til en stoppet-flow mikser, driver denne mikseren i laminær regime der turbulens ikke forekommer. Fraværet av turbulensen gjør nøyaktig numerisk simulering av alle renn i mikseren med utmerket avtale for å eksperimentere 3-4.
Laminær oppnås for Reynolds tall Re ≤ 100. For vandige løsninger, krever dette mikron skala geometrier. Vi bruker en hardt underlag, for eksempel silisium eller smeltet Silica, for å lage kanaler 5-10 mikrometer brede og 10 mm dyp (se figur 1). De minste dimensjoner, ved inngangen til miksing regionen, er i størrelsesorden 1 mikrometer i størrelse. Brikken er forseglet med et tynt glass eller smeltet silisiumdioksid dekkglass for optisk tilgang. Typiske totalt lineære strømningshastigheter er ~ 1 m / s, noe som gir Re ~ 10, men protein forbruket er bare ~ 0,5 NL / s eller 1,8 mL / hr. Protein konsentrasjon avhenger påvisningsmetoden: For tryptofan fluorescens den typiske konsentrasjonen er 100 mM (for en Trp / protein) og for FRET den typiske konsentrasjonen er ~ 100 nM.
Den sammenleggbare prosessen er initiert av rask fortynning av denaturant fra 6 M til 0,06 M Guanidine hydroklorid. Proteinet i høy denaturant renner ned en sentral kanal og blir møtt på hver side på å blande regionen ved buffer uten denaturant flytte ~ 100 ganger raskere (se figur 2). Dette geometri forårsaker rask innsnevring av proteinet flyten inn i en trangjet ~ 100 nm bred. Diffusjon av de lyse denaturant molekylene er meget rask, mens spredningen av den tunge proteinmolekyler er mye tregere, spre mindre enn 1 mikrometer i 1 ms. Forskjellen i spredningen konstant av denaturant og protein resulterer i rask fortynning av denaturant fra protein bekk, reduserer den effektive konsentrasjonen av denaturant rundt protein. Proteinet jet strømmer med en konstant rate nedover observasjon kanalen og fluorescens av protein i løpet av folding kan observeres med en scanning confocal mikroskop 5.
Rapid blanding har vært en utvikling mål for feltet av protein folding i mange år fordi det har lenge vært anerkjent at molekylære prosesser av biomolekyler skje over tidsskalaer fra picoseconds til sekunder. Konvensjonelle stoppet-flow miksere har døde tider 1-5 ms som primært begrenset av turbulens. Turbulente kontinuerlig flyt blandebatterier med blanding tider 30-300 μs har blitt utviklet de siste 15 årene av et lite antall grupper, men generelt krever høye strømningshastigheter å oppnå disse blande tider og derfor bruker mye av prøven 6-8.
Denne protokollen beskriver bruken av microfluidic blande chips å oppnå rask fortynning i laminær regimet. Det er flere fordeler med å jobbe innenfor dette regimet, men en primær en er evnen til å simulere hele blandeprosessen med høy presisjon som gjør det mulig å endre blanding respons. T-miksere utviklet av andre grupper med enkel Geometries har demonstrert blande ganger av 100-200 μs som primært ble begrenset av størrelsen på kanalene 9-10. Ved å skalere størrelsen på kanalene til 10 mikrometer Knight reduserte miksing tid til ~ 10 μs 11. Yao og Bakajin viste at små endringer i geometri kan føre til betydelige forbedringer i røretiden 4. Imidlertid viste at arbeid som akselerasjon blanding kan også føre til tregere faser også. Utformingen som brukes i dette arbeidet 12-13 er et kompromiss mellom de to beste design i referanse 4 for å minimere tregere eksponentiell i denaturant konsentrasjon og også for å gjøre funksjonen mer reproduserbar i Drie etsing.
Det har vært noen uenighet innen ultrarapid blande over definisjonen av røretiden. Det er viktig å anerkjenne forskjellen mellom "å blande tid" og "dødtid". Den døde tid er definert i en turbulent mikser som den tiden en measurement kan ikke gjøres og kan faktisk være betydelig lengre enn den faktiske røretiden. Det er vanligvis bestemmes ved å gjøre flere målinger av en pseudo-første bestillingen bimolecular reaksjon (for eksempel dempe tryptofan fluorescens ved N bromosuccinate) ved ulike konsentrasjoner. De observerte eksponential henfall er montert, samles i en enkelt verdi antas å være t = 0 s og tiden mellom det punktet og første målte punktet er dødtiden. For laminær miksere, kan målinger gjøres under miksingen prosessen så det er ingen dødtid, bare en blanding gangen. Blandetiden er rett og slett tid til å kombinere to løsningene til tilstrekkelig ensartethet er nådd. Vi har tidligere definert miksing tid til å være en 90/10 tid, tiden for konsentrasjonen av denaturant å redusere fra 90% til 10% av ublandet verdi. Imidlertid er formen på miksing kurven ikke perfekt symmetrisk med halen av forfallet ha en liten eksponensiell komponent. Videre har proteinfolding ensvært ulineær avhengighet denaturant konsentrasjonen slik at folding kan ofte begynne selv om denaturant reduseres kun med to ganger. Derfor har vi mer nylig definert blanding som tiden for å redusere denaturant konsentrasjonen med 80%. Gjerne andre definisjoner kan brukes avhengig av kravene i forsøket.
Bruken av denne mikseren for å studere protein folding konsekvent har avdekket overraskende resultater. Folding av cytokrom c og apomyoglobin har lenge blitt studert for å ha flere folding trinn og tidlige resultater med kontinuerlig flyt miksere viste kollaps å oppstå på ~ 100 μs tidsskala 10,14-15. Våre målinger med denne mikseren viste det å være minst 2 trinn på denne tidsskalaen, en veldig rask, sannsynlig uspesifikk, kollaps (målt ved Trp fluorescens spektral skift) innen røretiden av mikseren etterfulgt av en langsommere fase (som målt ved quenching av totalt Trp utslipp) som er egnet til den first dannelsen av innfødte struktur fem. Vi har også observert en 50 μs prosess i B1 domenet av protein L, kullkaste den konvensjonelle tolkning at dette proteinet er en to-stat-mappen 13.
En fordel med denne raske mikseren er at det kan sondere folding av de raskeste folding proteiner som vanligvis bare vært målbart ved nanosekund T-jump instrumenter. T-jump krever vanligvis observasjon av modell / utbrettet avslapping nær smeltetemperaturen av protein og derfor aldri følger folding av hele befolkningen. Med denne mikseren har vi sett på folding av γ-repressor (λ 6-86) med både Trp totale utslipp og spektral skift og har funnet bevis for at protein har ingen barriere å brette under sterk folding forhold som ikke var tilgjengelige for tidligere T -hoppe målinger 12. Endelig har vi målt folding av villin headpiece HP-35, en av than raskest mapper ennå målt og funnet ut at folding hastigheten målt etter blanding er ~ 5 ganger langsommere enn målt ved T-hopp på samme vilkår 16. Dette tyder på at folding kinetikk avhenger av start forhold, velt en stor forutsetning i feltet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av National Science Foundation FIBR (NSF EF-0623664) og IDBR (NSF DBI-0754570). Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra National Science Foundation FIBR Grant 0623664 administreres av Senter for Biophotonics, en NSF Science and Technology Center, i regi av University of California, Davis, under samarbeidsavtale PHY 0.120.999. Forskningen av Lisa Lapidus, Ph.D. støttes delvis av en Career Award ved Scientific Interface fra Burroughs Welcome fondet.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
Microscope | Olympus | IX-51 | |
Microscope Objective | Thor Labs | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
Microscope Objective | Olympus | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
GaAsP Photon Counter | Hamamatsu | H7421-40 | |
Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
CCD camera | Andor Technology | iDus 420A-BU | |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |