Summary
I dette arbeidet skal vi forklare fabrikasjon og bruk av en microfluidic mikser stand til å blande to løsninger i ~ 8 μs. Vi har også demonstrere bruken av disse miksere med spektroskopiske deteksjon ved hjelp av UV fluorescens og fluorescens resonans energi overføring (FRET).
Abstract
Den prosessen som et protein brettes inn i sitt opprinnelige eksteriør er svært relevant for biologi og helse likevel dårlig forstått. En årsak til dette er at folding foregår over et bredt spekter av tidsskalaer, fra nanosekunder til sekunder eller lenger, avhengig av protein 1. Konvensjonelle stoppet-flow miksere har tillatt måling av folding kinetikk som starter på ca 1 ms. Vi har nylig utviklet en microfluidic mikser som utvanner denaturant ~ 100 ganger i ~ 8 μs to. I motsetning til en stoppet-flow mikser, driver denne mikseren i laminær regime der turbulens ikke forekommer. Fraværet av turbulensen gjør nøyaktig numerisk simulering av alle renn i mikseren med utmerket avtale for å eksperimentere 3-4.
Laminær oppnås for Reynolds tall Re ≤ 100. For vandige løsninger, krever dette mikron skala geometrier. Vi bruker en hardt underlag, for eksempel silisium eller smeltet Silica, for å lage kanaler 5-10 mikrometer brede og 10 mm dyp (se figur 1). De minste dimensjoner, ved inngangen til miksing regionen, er i størrelsesorden 1 mikrometer i størrelse. Brikken er forseglet med et tynt glass eller smeltet silisiumdioksid dekkglass for optisk tilgang. Typiske totalt lineære strømningshastigheter er ~ 1 m / s, noe som gir Re ~ 10, men protein forbruket er bare ~ 0,5 NL / s eller 1,8 mL / hr. Protein konsentrasjon avhenger påvisningsmetoden: For tryptofan fluorescens den typiske konsentrasjonen er 100 mM (for en Trp / protein) og for FRET den typiske konsentrasjonen er ~ 100 nM.
Den sammenleggbare prosessen er initiert av rask fortynning av denaturant fra 6 M til 0,06 M Guanidine hydroklorid. Proteinet i høy denaturant renner ned en sentral kanal og blir møtt på hver side på å blande regionen ved buffer uten denaturant flytte ~ 100 ganger raskere (se figur 2). Dette geometri forårsaker rask innsnevring av proteinet flyten inn i en trangjet ~ 100 nm bred. Diffusjon av de lyse denaturant molekylene er meget rask, mens spredningen av den tunge proteinmolekyler er mye tregere, spre mindre enn 1 mikrometer i 1 ms. Forskjellen i spredningen konstant av denaturant og protein resulterer i rask fortynning av denaturant fra protein bekk, reduserer den effektive konsentrasjonen av denaturant rundt protein. Proteinet jet strømmer med en konstant rate nedover observasjon kanalen og fluorescens av protein i løpet av folding kan observeres med en scanning confocal mikroskop 5.
Protocol
1. Fabrikasjon av Microfluidic Blanding Chips
Figur 3 viser de grunnleggende fabrikasjon trinnene.
- Rengjør 4 tommer (100 mm) smeltet silisiumdioksid wafere med fersk Piranha løsning (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2): i) Varm svovelsyre til 130 ° C og hell i peroxide. Merk at overflateruhet og planhet av smeltet silisiumdioksid wafere brukes spille en viktig rolle for den endelige bonding trinnet. ii) dypp wafere i minst 30 minutter. iii) Skyll i 5 minutter med vann og tørk. Påfør en polysilisium (poly) belegg, ~ 1 mikrometer tykke per hver beregnet 10 mikrometer dybde av de endelige microfluidic kanaler, ved hjelp av et lavtrykk kjemisk damp nedfall (LPCVD) ovn.
- Rengjør wafere og maske ved hjelp av Piranha protokollen i trinn 1.1. Rengjør masken på samme måte, skyll med aceton, metanol og isopropanol og blåse tørr umiddelbart. Tørke wafere på en varm plate på 150 ° C i ~ 10 minutter (bruk en aluminiumsfolie telt for å holde støv borte) eller i en 120 ° C ovn i minst 120 minutter (over natten helst). For å øke fotoresist vedheft, straks avsløre de varme wafere til HMDS damp i 5 minutter. Spin strøk de wafere med en ~ 900 nm tykt lag av AZ5214 fotoresist og myk stek ved 90 ° C direkte på en kokeplate i 1 minutt eller i en ovn ved 110 ° C i 30 min (figur 3, trinn 1).
- Juster masken og gjøre en hard og vakuum kontakt. Utsettes for UV-lys i flere sekunder (total energi: ~ 103 mJ / cm 2) (figur 3, trinn 2). Utvikle med AZ400K utbygger, fortynnet 4:01 med DI vann i ~~~HEAD=NNS 50 sekunder (inntil fotoresist er fullt utviklet) mens forsiktig omrøring. Skyll med vann i 2 minutter. Inspiser funksjoner med mikroskop (figur 3, trinn 3). Hvis funksjoner er dårlig løst, stripe fotoresist og begynne på nytt fra 1.2. Hard 115 bake ° C direkte på en kokeplate for tominutter.
- Descum wafers med Asher eller O 2 plasma for 2,5 minutter ved 100 W RF power. Ved hjelp av en dyp reaktiv ion etcher (Drie), etse polysilisium laget hele veien gjennom til smeltet silisiumdioksid nedenfor. Stripp gjenværende fotoresist med PRS2000 motstå stripper ved 75 ° C i 10 minutter. Skyll og tørk. Mål etch dybde for å sikre at det er hele veien gjennom poly belegg (figur 3, trinn 4).
- Bruke en oksid stand Drie som en ULVAC NLD-6000 etcher, etch smeltet silisiumdioksid til en dybde på ~ 10 mm pr micron tykkelse av poly belegg (figur 3, trinn 5). Dette poly belegg vil bli slitt bort i løpet av etsing, så det kan være nødvendig å sjekke integriteten av belegget periodisk under etsing prosessen. Hvis bevisst særpreg regioner av wafer overflaten har blitt strippet nakne av beskyttende poly belegg under etsing, har overflaten mest sannsynlig bli satt opp og vil ikke lenger være egnet for limingi de siste trinnene i produksjonen. I dette tilfellet wafer er mest sannsynlig ikke lenger levedyktig. Rengjør med Matrix Asher i 4 minutter, 100 W RF power. Stripe polysilisium med en XEF 2 etcher (figur 3, trinn 6). Det kan være nødvendig å gjenta trinn 1,4 og dette trinnet noen ganger for å fjerne alle de fotoresistens og poly belegg.
- Spinn strøk wafere med en ny ~ 1 mikrometer lag fotoresist å beskytte kanalene under påfølgende håndtering. Bor inngang og utgang hull i hver brikke ved hjelp av en datastyrt diamant-tipped drill eller manuelt med en sandblaster (figur 3, trinn 7). Hvis du bruker en drill, monter wafer (funksjonsrike side ned) på en oppofrende glassplate med Aqua Bond 55, ta vare å holde bøndene fri for bobler. Kjøl drillen med micro-90 rengjøringsmiddel. Dette holder små biter av glass fra stikker til de kanalene som deretter tilstoppe chip under bruk.
- Skyll wafer med DI vann ved hjelp av en sprøyte til å injisere water i hvert hull. Sug i lunkent vann i en time. Fjern fotoresist og Aqua Bond med PRS 2000 ved 60 ° C i flere timer til overflaten er ren. Skyll wafer med DI vann og varmt såpevann. Skyll hvert hull igjen med en sprøyte, unngå etset funksjoner. Tørr wafer med nitrogen og i et vakuum ovn satt til 120 ° C. Inspiser hull for å sikre at de er fri for grus og gjenta rengjøring skritt som er nødvendig. Mål dybden av kanalene med enten en optisk eller mekanisk overflate Profiler (figur 3, trinn 8).
- Rene wafere og et tilsvarende antall på 170 mikrometer tykke smeltet silisiumdioksid dekker briller med 1) Piranha løsning (1-2 timer i henhold til prosedyren i 1.1), 2) RCA to (05:01:01 DI: HCl: H 2 0 2 ) løsning for 10 minutter ved 75 C, 3) RCA en løsning (05:01:01 DI: NH 4 OH: H 2 0 2) i 22 minutter ved 75C). Skyll med DI vann i 5 minutter mellom hver løsning.
- Sett en wafer funksjoner siden opp på toppen aven bunke med 3-4 renrommet våtservietter plassert på toppen av et hardt flatt underlag, for eksempel en liten glassrute. Tørk wafer grundig med nitrogen gass i minst 5 minutter. Gjenta med deksel glass. Plukk opp glasset med kanten og invertere slik at den polerte siden er ansiktet ned avholdt i wafer og juster de flate kantene. Forsiktig slippe glasset på wafer og la det avgjøre. Nudge horisontalt bare å justere justering. Trykk ned med en finger på midten av wafer. Man bør se en bonding foran begynner å stråle utover. Hvis nødvendig, påfør ytterligere press til andre posisjoner rundt wafer å fremme binding foran (figur 3, trinn 9).
- Plasser de forseglede wafere i en høy temperatur ovn satt til rampen fra rom temp til 800 ° C over 3 timer, deretter 800-1100 ° C over en annen 1.2 timer. Hold ved 1100 ° C i 2 timer, og deretter trappe ned til romtemperatur over en annen 1,5 timer.
- Dice med en wafer dicing så inn individual chips (figur 3, trinn 10).
- Protokollen beskriver fabrikasjon av kanaler i det relativt uvanlige smeltet silisiumdioksid underlaget som er nødvendig for UV deteksjon. Men denne protokollen kan også tilpasses for en silisium substrat som krever bare en etsning trinn 2. Et glass (men ikke smeltet silisiumdioksid) deksel glass kan limes til wafer med anodisk bonding.
2. Montering og Lasting Chips
- Manifolden å holde blande chip og løsninger kan være laget av plast, som for eksempel Lexan eller plexiglass, eller aluminium for temperaturkontroll (se figur 4). Hvis du bruker aluminium, bør løsningen reservoarene være belagt med parylene å hindre oppløsning av aluminium av saltløsninger i reservoarene. Temperaturen av hele manifolden, løsninger og chip kan kontrolleres med termoelektriske enheter montert på sidene og en elektronisk kontrolleren.
- Brikken er parret med Manifold av små o-ringer og en holdt på plass med en støttemur ring som gjør at en klar optisk utsikten over sentrum av brikken. De o-ringspor bør være grunnere enn standard for å sikre god parring uten å bruke altfor mye press til chip, det vil si, en 002 o-ring være 0,025 "dyp. Når brikken er montert, legger løsninger til sentrum og side reservoarer , ta vare å slippe eventuelle bobler fanget på bunnen av brønnene.
- Fordi volumene brukes i denne mikseren er så små, kan flyten styres med lufttrykk brukt over løsningen brønnene. Figur 4 viser trykket manifolden parret til toppen av chip manifolden ved O-ringer. Trykket manifold er koblet til datamaskinen-kontrollerte trykk transdusere som kan opprettholde presset fra ~~~HEAD=NNS 2-80 PSI. Brikken er utformet slik at like presset på sentrum og side kanaler produsere en ~ 100 ganger forholdet i de lineære strømningshastighetene. Ved 20 PSI, er den lineære strømningshastighet i avkjørselen kanal ~ 1 m/ S.
- Plasser manifold på en omvendt mikroskop og undersøke blande region med okularet eller kameraet utgang. En glødende lommelykt plassert på toppen av manifolden vil gi nok lys. Bruk en farge eller høy brytningsindeks løsning (dvs. 6 M Guanidine hydroklorid) i sentrum kanal for å vise av jet.
- På lik press på sentrum og side-kanaler, vil strålen være vanskelig å se med øyet så starter med siden kanalen trykket på 0 PSI og langsomt øke til lik press. Hvis en side kanal er tett, vil strålen bli skjøvet mot en av veggene i avkjøringen kanalen. Hvis en synlig tette vises, kan det løsne ved å bruke press eller vakuum til avkjørselen kanal med en sprøyte.
- Hvis protein eller annet organisk materiale tetter chip, kan det rengjøres ved å dyppe i Pirhana løsning over natten.
3. Datainnsamling
Figur 5 viser den grunnleggende optiske instrumentet layout.
- Ta en kollimert laserstråle inn i en forsknings-grade mikroskop med en dichroic speil enten innenfor eller like utenfor mikroskop. Juster laser slik at fokus kan ses i okularet eller kameraet noe nær miksing regionen.
- Fluorescens fra proteinet i mikseren blir samlet inn av objektiv og sendt over dichroic speilet, fokusert ved en objektiv til et pinhole og avbildes på et foton teller. Skann chip med en piezoelektrisk skanner i x og y til bilde blande regionen (typisk steg størrelse er 2 mikrometer). Velg en posisjon på jet og skanning i x og z for å finne fokus i midten av kanalen vertikalt. Dybdeskarpheten av mikroskopet er mye mindre enn kanalen dybde og strømningshastigheten er ensartet i kanalen bortsett innen 1 mikrometer fra veggene. Derfor tidsmessige oppløsningen av den observerte fluorescens er hovedsakelig bestemt av størrelsen på confocal flekken.
- Skann horisontalt innen utgangen kanal (typisk trinn s.ize er 0,2 mikrometer i over jet, 2 mikrometer langs jet) i 100 mikrometer trinn langs jet, pass for ~ 1 ms per stilling (se figur 6). Flytt mikroskop scenen med 80-90 mikrometer langs jet til fange senere tider.
- Alternativt kan lett bli oppdaget av en spektrograf og CCD etter dichroic speilet med en linse for å fokusere lyset på inngangen slit. Siden datainnsamling er tregere enn for fotonet telleren (1 sekund per stilling), er vanligvis den jet avbildes først med foton disken og deretter langs strålen er målt med spektrograf (se figur 7).
- Data fra fotonet telleren er analysert ved å summere 3-5 piksler rundt strålen ved hver posisjon til å skape en tomt på intensitet vs avstand. Regnes fra avstand med en beregnet hastighet basert på anvendt trykk (se figur 8).
- Data fra spektrograf kan analyseres et par måter. For FRET, channels utpekt som "donor" og "akseptor" kan hver summeres og nærhet forholdet E = Jeg A / (jeg D + I D) beregnes (se figur 9). Alternativt kan enkelt verdi nedbrytning bli utført for å se på uavhengige spektrale komponenter vs tid, for eksempel skift i tryptofan utslipp spektrum som et protein folder.
- Avstand innenfor avkjørselen kanalen kan konverteres til annen bruk av konstant strømningshastighet bestemt fra anvendt trykk til sidene kanalene. Innen de første 2 mikrometer i avkjøringen kanalen, akselererer strømningshastighet av protein jet ~ 100x og tidene i denne regionen må beregnes med finite element analyse av strømlinjene (produsere ganger plottet i Figur 8). Dette akselerasjon gir en forskyvning på ~ 1-2 μs etter at hastigheten blir konstant og kan vanligvis ignorert i å måle kinetikk mye tregere enn miksing.
4. Representative Resultater
Figur 6 viser en kontur plott av intensiteten i miksing regionen målt ved fotonet telleren. Bakgrunnen i avkjørselen kanalen utsiden av jet bør være nær støyen gulvet i detektoren og er vanligvis ikke trekkes fra. En høyere bakgrunn kan tyde på dårlig justering eller at proteinet stikker til veggene i kanalen. En jet som ser bøyd eller krokete, spesielt nær miksing regionen, indikerer en dårlig etch av dysene.
Figur 7 viser tiden løst spektra fra protein acyl-koenzym A-bindende protein (ACBP) merket med Alexa 488 og Alexa 647. Disse dataene har blitt bakgrunn trukket for å fjerne mørke kostnad og laser signal. Bakgrunnen signal ble tatt med senterkanalen presset satt til 0 PSI.
Blandetiden kan måles ved å måle en rask reaksjon som er mye raskere enn å blande for eksempel Trp fluorescens leskende by KI eller sammenbrudd av single DNA, merket med FRET fargestoffer, med tillegg av NaCl. Fordi jet er mindre enn den optiske oppløsningen av mikroskopet, er det en stor intensitet dråpe i blanding regionen som jet former. Dette instrumentet respons kan fjernes ved å gjøre en kontroll måling der ingen løsning forholdene endres. Figur 8 viser forholdet mellom blanding (til 400 mm KI) og ikke-blanding eksperimenter av N-acetyl tryptofan amide fluorescens. Linjen viser spådd konsentrasjonen av KI fra COMSOL simuleringer. Blandetiden, målt som tiden for konsentrasjonen å redusere 80%, er 8 μs.
Siden dataene er samlet i 100 mikrometer trinn langs den 500 mikrometer lange exit kanal, må dataene limes sammen fra flere visninger. Det er stundom små forskyvninger i signal mellom disse visningene, trolig på grunn av små endringer i fokus som brikken er flyttet av mikroskop scenen. Ved å flytte scenen 80 eller 90mikrometer per visning, kan disse forskyvninger bli eliminert ved å undersøke overlappende data. Vanligvis samles inn med minst to hastigheter og dataene kombineres for å bekrefte noe signal endringene skyldes reelle spektroskopiske endringer i protein, i stedet for optisk eller flyt effekter. Figur 9 viser FRET endringer i protein ACBP etter fortynning av denaturant fra 6 M til 0,06 M. Denne informasjonen trenger ikke en kontroll eksperiment siden FRET er allerede en ratio og instrumentet responsen er allerede fjernet. Den raske hopp nær T = 0 representerer en rask endring i FRET signal innenfor røretiden.
Figur 1. Layout av blande-regionen målt ved elektronmikroskopi.
Figur 2. Skjematisk av hydrodynamiske blanding for å studere protein folding. The protein,oppløst i høy denaturant å utfolde det, renner ned i midten kanalen mot å blande regionen hvor den møter buffer flyter ~ 100 ganger raskere. Laminær tvinger proteinet strømmen inn i en smal stråle som denaturant molekyler kan raskt spres. Som jet renner ned avkjøringen kanalen, kan proteinet bli observert med høy romlig og tidsoppløsning ved hjelp av en confocal mikroskop.
Figur 3. Smeltet silisiumdioksid fabrikasjon. 1) Prosessen starter med en blankpolert 500 mikrometer tykk smeltet silisiumdioksid substrat (a) med et lag av silisium (poly) deponert på topp og bunn overflater (b) og spin-belagt med et lag av fotoresist (c). 2) En photomask (e) er brakt int o hard kontakt med wafer og fotoresist utsettes for UV lys (d). 3) Den wafer er plassert i en utvikler bad og mønsteret er åpenbart i fotoresist. 4) Den wafer er plassert i en Drie og funksjonene er etset inn i toppen poly belegg. Den fotoresist blir deretter fjernet. 5) Den poly fungerer da som en maske når wafer er plassert i en oksid etcher og funksjonene er etset 10-40 mikrometer i smeltet silisiumdioksid underlaget. 6) Den poly belegget blir deretter fjernet i en XEF 2 etcher. 7) Den wafer er bundet til en oppofrende glassplate med en varme-aktivert fugemasse (g), funksjoner side ned, og en diamant bor (f) abrasively øvelser gjennom hull fra baksiden. 8) En overflate Profiler (h) så måler direkte etset funksjonen dypet. 9) En 170 mikrometer tykk smeltet silisiumdioksid dekkglass wafer er direkte limt på toppen overflaten av wafer. 10) Den wafer er terninger i enkelte microfluidic chips.
3976/3976fig4.jpg "/>
Figur 4. Blandebatteriet manifold. Den microfluidic-brikken er festet til løsningen manifold med en maskinert aluminium frontplate og fire o-ringene under ~~~HEAD=NNS 200 mL reservoarer. Et stort hull er frest gjennom sentrum av manifolden rett ovenfor blanding regionen i festet microfluidic-chip, slik at overflødig UV lys for å unnslippe uten tilbakespredning, hemme noen auto-fluorescens fra manifolden selv og tillate direkte belysning av chip ved øyet eller kamera for justering. Luften manifold pakninger hver av reservoarene slik at lufttrykket i hvert kan kontrolleres via en ytre press kontroll boks.
Figur 5. Skjematisk fremstilling av optisk confocal mikroskop.
Figur 6. Contour tomt på tryptofanfluorescens i microfluidic mikseren. Blandeskapet regionen ligger på ~ 90 mikrometer på y-aksen.
Figur 7. Tidsavhengig fluorescerende spektra hentet innen mikseren. De grønne og røde rektangler viser de bølgelengdene utpekt som donor og akseptor kanaler, henholdsvis.
Figur 8. Mixing tid målt ved fluorescens quenching av tryptofan ved kaliumjodid (poeng og høyre akse) og beregnes av finite element analyse (linje og venstre akse).
Figur 9. FRET endringer målt ved folding av proteinet ACBP. Den raske veksten nær t = 0 representerer en burst fase innen miksing tid og tregere vekst representerer en gradvis akkumulertsjon av struktur som protein folder. Dataene ble tatt på to forskjellige strømningshastigheter og kledde, som fører til ulik tetthet av målinger på ulike tidspunkt.
Discussion
Rapid blanding har vært en utvikling mål for feltet av protein folding i mange år fordi det har lenge vært anerkjent at molekylære prosesser av biomolekyler skje over tidsskalaer fra picoseconds til sekunder. Konvensjonelle stoppet-flow miksere har døde tider 1-5 ms som primært begrenset av turbulens. Turbulente kontinuerlig flyt blandebatterier med blanding tider 30-300 μs har blitt utviklet de siste 15 årene av et lite antall grupper, men generelt krever høye strømningshastigheter å oppnå disse blande tider og derfor bruker mye av prøven 6-8.
Denne protokollen beskriver bruken av microfluidic blande chips å oppnå rask fortynning i laminær regimet. Det er flere fordeler med å jobbe innenfor dette regimet, men en primær en er evnen til å simulere hele blandeprosessen med høy presisjon som gjør det mulig å endre blanding respons. T-miksere utviklet av andre grupper med enkel Geometries har demonstrert blande ganger av 100-200 μs som primært ble begrenset av størrelsen på kanalene 9-10. Ved å skalere størrelsen på kanalene til 10 mikrometer Knight reduserte miksing tid til ~ 10 μs 11. Yao og Bakajin viste at små endringer i geometri kan føre til betydelige forbedringer i røretiden 4. Imidlertid viste at arbeid som akselerasjon blanding kan også føre til tregere faser også. Utformingen som brukes i dette arbeidet 12-13 er et kompromiss mellom de to beste design i referanse 4 for å minimere tregere eksponentiell i denaturant konsentrasjon og også for å gjøre funksjonen mer reproduserbar i Drie etsing.
Det har vært noen uenighet innen ultrarapid blande over definisjonen av røretiden. Det er viktig å anerkjenne forskjellen mellom "å blande tid" og "dødtid". Den døde tid er definert i en turbulent mikser som den tiden en measurement kan ikke gjøres og kan faktisk være betydelig lengre enn den faktiske røretiden. Det er vanligvis bestemmes ved å gjøre flere målinger av en pseudo-første bestillingen bimolecular reaksjon (for eksempel dempe tryptofan fluorescens ved N bromosuccinate) ved ulike konsentrasjoner. De observerte eksponential henfall er montert, samles i en enkelt verdi antas å være t = 0 s og tiden mellom det punktet og første målte punktet er dødtiden. For laminær miksere, kan målinger gjøres under miksingen prosessen så det er ingen dødtid, bare en blanding gangen. Blandetiden er rett og slett tid til å kombinere to løsningene til tilstrekkelig ensartethet er nådd. Vi har tidligere definert miksing tid til å være en 90/10 tid, tiden for konsentrasjonen av denaturant å redusere fra 90% til 10% av ublandet verdi. Imidlertid er formen på miksing kurven ikke perfekt symmetrisk med halen av forfallet ha en liten eksponensiell komponent. Videre har proteinfolding ensvært ulineær avhengighet denaturant konsentrasjonen slik at folding kan ofte begynne selv om denaturant reduseres kun med to ganger. Derfor har vi mer nylig definert blanding som tiden for å redusere denaturant konsentrasjonen med 80%. Gjerne andre definisjoner kan brukes avhengig av kravene i forsøket.
Bruken av denne mikseren for å studere protein folding konsekvent har avdekket overraskende resultater. Folding av cytokrom c og apomyoglobin har lenge blitt studert for å ha flere folding trinn og tidlige resultater med kontinuerlig flyt miksere viste kollaps å oppstå på ~ 100 μs tidsskala 10,14-15. Våre målinger med denne mikseren viste det å være minst 2 trinn på denne tidsskalaen, en veldig rask, sannsynlig uspesifikk, kollaps (målt ved Trp fluorescens spektral skift) innen røretiden av mikseren etterfulgt av en langsommere fase (som målt ved quenching av totalt Trp utslipp) som er egnet til den first dannelsen av innfødte struktur fem. Vi har også observert en 50 μs prosess i B1 domenet av protein L, kullkaste den konvensjonelle tolkning at dette proteinet er en to-stat-mappen 13.
En fordel med denne raske mikseren er at det kan sondere folding av de raskeste folding proteiner som vanligvis bare vært målbart ved nanosekund T-jump instrumenter. T-jump krever vanligvis observasjon av modell / utbrettet avslapping nær smeltetemperaturen av protein og derfor aldri følger folding av hele befolkningen. Med denne mikseren har vi sett på folding av γ-repressor (λ 6-86) med både Trp totale utslipp og spektral skift og har funnet bevis for at protein har ingen barriere å brette under sterk folding forhold som ikke var tilgjengelige for tidligere T -hoppe målinger 12. Endelig har vi målt folding av villin headpiece HP-35, en av than raskest mapper ennå målt og funnet ut at folding hastigheten målt etter blanding er ~ 5 ganger langsommere enn målt ved T-hopp på samme vilkår 16. Dette tyder på at folding kinetikk avhenger av start forhold, velt en stor forutsetning i feltet.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av National Science Foundation FIBR (NSF EF-0623664) og IDBR (NSF DBI-0754570). Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra National Science Foundation FIBR Grant 0623664 administreres av Senter for Biophotonics, en NSF Science and Technology Center, i regi av University of California, Davis, under samarbeidsavtale PHY 0.120.999. Forskningen av Lisa Lapidus, Ph.D. støttes delvis av en Career Award ved Scientific Interface fra Burroughs Welcome fondet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
| Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
| AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
| 500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
| 170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
| Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
| Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
| Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX-51 | |
| Microscope Objective | Thorlabs Inc. | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
| Microscope Objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
| Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
| Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
| GaAsP Photon Counter | Hamamatsu Corp. | H7421-40 | |
| Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
| CCD camera | Andor | iDus 420A-BU | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |
References
- Eaton, W. A. Fast kinetics and mechanisms in protein folding. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).
- Hertzog, D. E. Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding. Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).
- Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics. Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).
- Yao, S., Bakajin, O. Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics. Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).
- Lapidus, L. J. Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).
- Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions. Review of Scientific Instruments. 76, (2005).
- Chan, C. -K. Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing. PNAS. 94, 1779-1784 (1997).
- Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).
- Pollack, L. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).
- Takahashi, S. Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing. Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).
- Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds. Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).
- DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).
- Waldauer, S. A.
- Shastry, M. C. R., Roder, H. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).
- Uzawa, T. Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).
- Zhu, L. Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain. The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).
