라만 분광법은 비 접촉에 적합한 기술, 살아있는 세포, 조직 – 엔지니어링 구조와 기본 조직의 라벨이없는 분석입니다. 소스 고유의 스펙트럼 지문가 생성 및 복수 변수 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다.
세포와 조직 문화를 모니터링하는 비 파괴적인, 비 접촉 및 레이블이없는 기술은 생명 의학 연구 분야에서 필요합니다. 1-5 단, 현재 사용 가능한 일상적인 방법은 처리 단계를 필요로하고 샘플 무결성을 변경하지 않습니다. 라만 분광법은 추가 처리 단계없이도 생물 학적 시료의 측정을 가능하게 빠른 방법입니다. .이 레이저 기반의 기술은 단색 빛의 비탄성 산란을 감지 6 모든 화학 진동은 특정 라만 밴드 (cm -1에서 wavenumber)에 할당된으로, 각각의 생물 학적 샘플들은 본질적으로 생화 학적 조성에 의한 전형적인 스펙트럼 패턴을 갖추고 7. – 라만 스펙트럼 내에서 9, 피크 농도는 현재 분자 채권의 금액과 상관 관계 1. 유사점과 스펙트럼 데이터 세트의 차이는 다변수 분석 (예, 주요한 구성 요소 분석 (PCA)을) 채용에 의해 감지가 가능하다 10. </suP>
여기서는 살아있는 세포 및 기본 조직의 라만 분광을 수행합니다. 세포 중 유리 바닥 접시에 놓는 또는 정상 세포 배양 조건에서 현탁액에 보관 (37 ° C에서 5 % CO 2) 측정하기 전에합니다. 기본 조직은 4 ° C에서 사전 측정에 (PBS) 식염수를 버퍼 해부 및 인산염에 저장됩니다. 우리의 실험적인 함정에 따라, 우리는 다음 중 세포 핵이나 엘라스틴과 콜라겐 등 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질에 집중했다. 모든 연구 내용은, 30 셀 또는 ECM 내에서 이익의 30 임의의 지점의 최소 측정합니다. 데이터 처리 단계는 배경 제거 및 정상화가 포함되어있었습니다.
라만 분광법은 네이티브 조직 내에서 체외 – 교양 세포와 ECM 단백질뿐만 아니라 세포와 같은 생물 학적 샘플을 분석하는 적합한 도구입니다. 여기 11,15,16, 우리는이 비 접촉, 레이블이없는 기술을 허용하는 입증 다른 세포 유형의 차별과 전적으로 이러한 생물 학적 샘플의 본질 biomolecular 구성을 기반으로 ECM 단백질 저하의 감지.
라만 분광법의 주요한 이점은 비 invasively 그 결과로 라만 스펙트럼에 의한 시료의 생화 학적 지문을 계량하는 기능입니다. 유사한 정보를 얻을 적외선 분광법, 달리, 라만의 스펙트럼은 약한 물에서 라만 산란으로 수성 샘플에서 수집한 수 있습니다. 또한, 라만 분광법은 전적으로 단색 광을 backscattering의 검출을 기반으로하므로, 어떤 시료 처리 전에 측정을 필요하지 않습니다. 이러한 특성은 라스하다생체내 이미징 애플 리케이션에서 가능성을위한 사람 분광법은 유망한 대안. 보다 빠르고 실험에서 널리 같은 vibrational 신호를 기반으로 데이터를 더욱 민감한 취득 가능하게 때문에이 안부에서 일관된 반 스톡스 라만 분광법은 (대) 매우 흥미로운 기술입니다. multiphoton 유발 autofluorescence 포함한 15,16 다른 대안 방법 와 두 번째 고조파 생성 이미지는 이전에 다음 ID 17는 그러나 이러한 이미징 modalities가 매우 높은 비용과 연결되어 있습니다. 비 또는 최소한의 invasively 생물 학적 샘플을 모니터하는 데 적합한 것으로 입증되었으며 autofluorescence 창출 분자로 제한됩니다. 또한, 라만 분광계는 종래의 광학 현미경과 결합하기 쉽다. 이러한 특성은 라만 분광법 생리적 환경에서 생물 학적 샘플을 공부하는 유용한 도구합니다.
우리 라만 분광법의 현재 한계 중 하나는 설정높은 수치 조리개 목표 (NA가 = 1.2)에 의해 만들어진 비교적 적은 레이저 초점 (250 nm의 전체 폭 절반 최대 (FWHM) 수평 700 nm의 FWHM 축). 높은 수치 조리개가 높은 신호 대 노이즈 비율에 항복 방출 라만 빛의 적당량을 충당하기 위해 수 있지만, 높은 NA는 일반적으로 세포보다 훨씬 작은 샘플에서만 작은 컬렉션 초점을 생산하고 있습니다. 다른 세포의 라만 스펙트럼을 비교하기 위해서, 대표적인 스펙트럼의 컬렉션 작은 초점 영역으로 얻기 어려운하는 것이 필수적입니다. 이 문제를 해결하기 위해 평균 및 대표 스펙트럼에 항복 스펙트럼의 결과로 세포 내에서 다양한 포인트 (= 라만 spectroscopic 매핑)에서 신호 수집을 자동화하는 절차에 노력하고 있습니다. 또한이 기술은 세포 내에서 단백질 배포판의 예를 들어, 특정 라만 밴드의 배포에 대한 개요를 제공합니다.
Biological 샘플이 매우 복잡하며 수집된 라만 스펙트럼에 기여 biomolecules의 이기종 혼합 구성되어 있습니다. 따라서 스펙트럼 패턴은 매우 복잡하고 라만 스펙트럼 내에서 분자의 단일 유형의 모니터링은 다른 분자 신호의 중복으로 달성하기 어렵습니다. 또한 샘플의 본질적인 형광이 약한 라만 신호의 귀중한 정보를 숨길 수 있습니다. 흥미롭게도, 우리의 이전 연구의 일부로, 우리는 적절한 분석 도구를 사용하여 셀 타입 (MSCS와 섬유아 세포) 사이의 주요 차별화 요소로 라만 스펙트럼에 autofluorescence 밝혀졌습니다. 13 저희는 또한 전체 라만 신호 강도의 변화가 될 수있는 식별 콜라겐과 대동맥 밸브 전단지의 ECM 내의 콜라겐 섬유의 상태에 대한 표시가 9. 그러나 이러한 조직에서 엘라스틴의 상태를 분석했을 때, 우리는 비슷한 결과를 검색할 수 없습니다. 마찬가지로 결과에 언급의 섹션, 우리는 네이티브 컨트롤에 비해 엘라스타제-대우 샘플에서 특정 라만 밴드의 변경을 감지할 수 있었다. 우리는 예상대로 효소 처리 – 처리 샘플에 전체 라만 신호의 감소를 보지 못했어요. 이러한 관찰은 이전 연구에서 본대로 명확한 클러스터 형성을 밝히지 않았 점수 음모에 결과. 반면 9, 효소 치료의 영향 PCA 결과 내에서 감지되었다. 우리는 두 ECM 단백질, 엘라스틴과 콜라겐 사이에 이러한 차이는 형태학의 차이와 다양한 효소 저하 프로세스를 기반으로하는 것으로 가정합니다 : 대동맥 밸브 전단지 내에 콜라겐이 풍부한 영역 (fibrosa)은 인해에 느슨하게된다 지속적인 레이어이다 효소 치료, 약자 영역 (ventricularis)이있는 엘라스틴이 엘라스타제에 노출 (그림 4) 후 조각 나타나는 네트워크 구성을 가지고 있습니다. 단일 스폿 측정 따라서 appropri 아니었엘라스틴 네트워크 내에서 이러한 작은 파열을 감지 먹었다. 여기서 조직의 라만 매핑은 네트워크 고장을 식별하는 데 도움이 될 것이다.
생물 학적 샘플의 라만 분광에 대한 도전은 측정 시간을 줄이는 것입니다. 하나의 솔루션은 생물 학적 샘플 사진 손상에 의해 영향을받지 않는 동안에는 적합한 레이저의 파워를 늘리는 것입니다. 현재 실험의 모든 기초 연구에 초점을 증명 원리 연구가 있지만, 우리의 전반적인 목표는 재생 의료 (조직 – 공학 제품의 예 : 품질 관리), 사전 이식 이식 모니터링 등 임상 응용을위한 라만 분광법을 구현하는 것입니다 암 진단.
The authors have nothing to disclose.
우리는 원고에 대한 자신의 유용한 제안을 위해 자신의 기술 지원과 섀넌 리 Layland (Fraunhofer IGB 모두 슈투트가르트)에 대한 Steffen 코흐 감사드립니다. 이 작품은 재정적 Fraunhofer-Gesellschaft와 BMBF (KS-L까지 모두.)의 유치 프로그램에 의해 지원되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
elastase | Worthington | LS006363 | |
anti-elastin antibody | Sigma | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
PBS | Lonza | 17-512F | |
glass bottom dishes | Greiner BioOne | 627860 | |
The Unscrambler | CAMO | ||
Opus | Bruker |