Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie

Summary

Raman spectroscopie is een geschikte techniek voor de non-contact, label-free analyse van levende cellen, weefsel-engineering constructen en cellen. Bronspecifieke spectrale vingerafdrukken worden gegenereerd en geanalyseerd met multivariate analyse.

Abstract

Niet-destructieve, non-contact en label-free technologieën om cel-en weefselculturen monitoren nodig zijn op het gebied van biomedisch onderzoek. ^1-5 echter op dit moment beschikbaar zijn routinematige methoden vereisen de verwerking van stappen en te veranderen monster integriteit. Raman spectroscopie een snelle methode die de meting van biologische monsters kunnen zonder verdere processtappen. . Deze laser gebaseerde technologie detecteert de inelastische verstrooiing van monochromatisch licht ⁶ Zoals elk chemisch trilling wordt toegewezen aan een specifieke Raman band (golfgetal in cm ^-1), die elk biologisch monster beschikt over een typisch spectrale patroon vanwege hun specifieke biochemische samenstelling ^{7. - 9} Binnen Raman spectra, de piek intensiteiten correleren met het bedrag van de huidige moleculaire bindingen. ¹ Overeenkomsten en verschillen van de spectrale gegevens kan worden gedetecteerd door het gebruik van een multivariate analyse (bijvoorbeeld principal component analyse (PCA)) ^10.

Hier voeren we Raman spectroscopie van levende cellen en cellen. Cellen worden uitgezaaid hetzij op glas bodem schalen of in suspensie onder normale celcultuur condities (37 ° C, _5% CO2) voor meting. Natieve weefsels worden ontleed en opgeslagen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C voor metingen. Afhankelijk van de experimentele opstelling wij vervolgens gericht op de celkern of extracellulaire matrix (ECM) eiwitten zoals elastine en collageen. Voor alle studies, zijn een minimum van 30 cellen of 30 willekeurige punten van belang in de ECM gemeten. Verwerking van gegevens stappen te ondernemen die achtergrond aftrek en normalisatie.

Protocol

1. Voorbereiding van het biologische monster

1. Voorbereiding van levende cellen
   1. Bereiding van hechtende cellen
      1. Zaad in vitro gekweekte-of vers geïsoleerde cellen op een glazen onderste schaal (Greiner BioOne / Duitsland) en incubeer ze bij 37 ° C en _5% CO2 tot celhechting is voltooid.
      2. Verwijder de voedingsbodem en was voorzichtig drie keer met PBS voorafgaande meting. Houd de cellen bedekt met een PBS of celkweek medium in de gehele meetprocedure.
   2. Bereiding van cellen in suspensie
      1. Maak in vitro-gekweekte cellen op basis van gemeenschappelijke protocollen (bijvoorbeeld trypsine-EDTA, cel schrapen), centrifugeren de cellen en resuspendeer de verkregen celpellet in PBS of celkweek medium.
      2. Breng 100 pi van de celsuspensie (concentratie. Max 100.000 cellen / ml) aan een glazen onderste schaal.
2. Voorbereiding van native weefsels
   1. Na het oogsten van de weefsels, overbrengen naar steriele, ijskoude PBS en bewaar ze niet langer dan 12 uur bij 4 ° C of op ijs eerdere meting. Eerdere experimenten hebben aangetoond dat een langdurige opslag tijd (koude ischemie tijd> 12 uur bij 4 ° C) resulteerde in spectrale veranderingen door natuurlijke afbraakprocessen.
   2. De metingen moeten worden uitgevoerd met het weefsel bedekt met PBS of medium om beschadiging van de ECM eiwitten en cellen als gevolg van weefsels drogen te voorkomen.

2. Raman spectroscopie

Onze op maat Raman-spectrometer een combinatie van een standaard fluorescentie microscoop (Olympus IX 71) met een Raman-spectrometer dat de directe vergelijking van bright-field en fluorescentie beelden met de Raman-spectra kunnen. De basis set bestaat uit een 784 nm diodelaser (Toptica fotonica AG / Duitsland), een inkeping filter voor de scheiding van de Raman-verstrooide licht van het excitatielicht een microscoop eennd een spectrograaf (Kaiser Optical Systems Inc, Ann Arbor / USA) met een Charge Coupled Device (CCD-camera) geoptimaliseerd voor de detectie van spectrale informatie (F-uitzicht vanuit Soft Imaging Systems / Duitsland).

3. Controle van de Laser Functie

1. Start de software Andor Solis (Andor / Verenigd Koninkrijk) en de temperatuur van de CCD-camera tot -60 ° C instellen om het geluid veroorzaakt door thermisch geïnduceerde stromen in de camera te minimaliseren.
2. Plaats een siliciumplak de microscoop fase voor de kalibratie.
3. Zet de laser op en zet de stroom tot 85 mW.
4. Gebruik de software Cell B (Olympus / Duitsland) om de laser te richten op de wafer tot XY verschijnt.
5. Meet de silicium wafer met een integratietijd van 1 seconde met een 60x lucht doelstelling.
6. De eenheid van de x-as van het aantal pixels met Raman verschuiving (cm ^-1) in de Andor Solis software.
7. Verschillen van de laser focus van de silicium piek bij 520 cm ^-1 inde verzamelde spectrum om de maximale intensiteit voor dit Raman band vinden. Het minimumbedrag van de tellingen moet hoger zijn dan 11.000 voor een succesvolle kalibratie hebben.

4. Raman spectroscopische metingen

Alle metingen zijn uitgevoerd bij kamertemperatuur.

1. Basisinstellingen
   1. Gebruik 60x water immersie-objectief (Olympus / Duitsland) met een numerieke apertuur van 1,2 tot het spectrum van de monsters.
   2. Wijzig de overname instellingen tot 10 integraties / 10 seconden voor een totaal van 100 seconden per metingen.
2. Meting van hechtende cellen
   1. Neem de glazen bodem schotel met de cellen en plaats het op de microscoop podium.
   2. Om een ​​beter signaal te krijgen en zorgen voor de reproduceerbaarheid, de focus van de laser op de celkern, zet de microscoop licht uit en beginnen met het verzamelen van het spectrum.
   3. Meet een referentie spectrum van de achtergrond ezeer 10 spectra in door de laser gericht naast de cel. Het is belangrijk aan te nemen dat bij het veranderen van de focus van een nieuwe achtergrond moet worden verzameld voor iedere focus diepte.
3. Meting van cellen in suspensie
   1. Breng 100 pi van de celsuspensie in het glas onderste schaal en leg hem op de microscoop podium.
   2. Richt de laser op het midden van de cel, zet de microscoop licht uit en beginnen met het verzamelen van het spectrum.
   3. Meet een infraroodspectrum van de achtergrond elke 10 spectra in door de laser gericht naast de cel. Bij het wijzigen van de focus, moet er een nieuwe achtergrond worden verzameld voor de nieuwe focus diepte.
4. Meting van inheemse weefsels
   1. Neem het monster en plaats deze in een glazen bodem schaal. Het gebied van belang (ROI) moet gericht naar de bodem van de schotel.
   2. Vul de schaal met voldoende PBS om het monster te dekken.
   3. Plaats een deksel glas over het monster aan een mov te voorkomenement van het monster gedurende metingen.
   4. Stel de laser aandacht in de structuur van belang (diepte resolutie is met een laser-en weefsel-afhankelijk is) en beginnen met het verzamelen van de spectra.
   5. Verzamel een referentie spectrum van de achtergrond elke 10 spectra door het bewegen van de laser zich uit van het hele weefsel gebied. Bij het wijzigen van de focus, moet er een nieuwe achtergrond worden verzameld voor de nieuwe focus diepte.
5. Meting van immunofluorescentie (IF)-gemerkte vriescoupes
   1. Sectie verse, snap-bevroren weefsel monsters met behulp van een standaard cryotom en monteer ze op silica-gecoate dekglaasjes.
   2. Vlek de cryosecties na routine protocol voor IF, gebruik een korte fixatie stap (max. 10 minuten met 4% paraformaldehyde) met een geschikt antilichamen voor de detectie van het eiwit van interesse.
   3. Voer Raman metingen richten in het gebied waar fluorescentie optreedt.
6. Elastine degradatie experimenten
   1. Place de ventricularis van de ontleed varkens aortaklep folders (elastine-rijk, bloed instroom-side laag van de hartklep folder) naar de bodem van het glas onderste schaal.
   2. Meet de natuurlijke weefsel als een 'niet-bebroede control' bij 30 willekeurige punten over het gehele weefsel oppervlak waarbij de aandacht met de fibrillaire structuren.
   3. Verdeel het monster in 3 secties en plaats ze in aparte 2,5 ml Eppendorf-buisjes gevuld met 2 ml van een elastase oplossing (5 U / ml, Worthington / Duitsland).
   4. Incubeer de weefsel voor 15 of 30 minuten bij 37 ° C.
   5. Na incubatie gedurende een 15 of 30 minuten de weefsels van de eppendorfbuisje en wassen zorgvuldig met PBS om volledig stoppen enzymatische reactie.
   6. Meet elk monster bij 30 willekeurige punten, met de nadruk op de fibrillaire structuren.

5. Gegevensverwerking en-analyse

1. Raman spectra verwerking
   De voorbehandeling van hetgegenereerde spectra werd uitgevoerd met behulp van OPUS software (Bruker Optik GmbH / Duitsland).
   1. Om storende signalen van het glas en medium en het reduceren van variaties veroorzaakt door veranderingen in de concentratie tijdens metingen te voorkomen, trekt de overeenkomstige achtergrond spectrum van de verzamelde spectra.
   2. Verminder de spectra van de golfgetalgebied gebied tussen 400-1800 ^cm-1, die de grootste hoeveelheid informatie biedt.
   3. Indien nodig, normaliseren van de spectra van de maximale piek. Normalisatie factoren die de intensiteit schommelingen en systematische fouten, de vereenvoudiging van de detectie van structurele veranderingen in de steekproef spectra.
   4. Voer een basislijn correctie op de vergelijkbaarheid van de verschillende experimenten te verhogen.
2. Raman spectra analyse
   De Raman spectra werden geanalyseerd met behulp van PSO met The Unscrambler (CAMO / Noorwegen) software. Deze multivariate analyse detecteert verschillen en overeenkomsten binnen de spectrale gegevenssets. Elke spectrum is uitgezet als een punt in een meerdimensionele basis van de verzamelde telt elke Raman verschuiving. Elke principe component (PC) beschrijft een bepaalde hoeveelheid van de totale informatie in de oorspronkelijke data. De eerste PC is degene die de grootste bron van variatie bevat. Elke volgende pc bevat, in volgorde, minder informatie dan de vorige. Elke variabele heeft een score en een belasting op elke PC. Door het uitzetten van pc's (= scores) kunnen belangrijke monster correlaties worden blootgesteld. De belasting beschrijven de bijdrage van elke variabele geanalyseerd aan de PSO.
   1. Label elke groep van de metingen door het creëren van rij varieert voor ieder monster groep.
   2. Gebruik de volgende basisinstellingen voor de PCA: cross validatie, de NIPALS algoritme, geen rotatie en start de analyse. Deze instellingen zijn afhankelijk van spectra.
   3. Voer de PSO.

6. Representatieve resultaten

Raman spEctra gegenereerd hechtende cellen vaak blijkt een lage signaal-ruisverhouding en een lage totale signaalintensiteit (Fig. 1). ¹¹ Door het feit dat de laser aandacht worden dicht bij de glazen bodem, de invloed van de storende glas signaal is vrij hoog, waardoor maskeren van het werkelijke monster signaal. Bijgevolg kan de steekproef signaal worden geminimaliseerd of zelfs geëlimineerd tijdens een latere achtergrond aftrekken. Zo wij de voorkeur aan cellen in suspensie gebruikt voor onze Raman spectroscopische analyse, aangezien zij de detectie van meer gedetailleerde spectrale informatie. De spectra van hechtende en suspensie cellen vertonen dezelfde belangrijkste pieken slechts verschillen in hun intensiteit.

Voor de karakterisering van de verschillende celtypes in een schorsing, is er geen voorbehandeling nodig. De gemiddelde Raman-spectra en standaarddeviaties van de menselijke fibroblasten, mesenchymale stamcellen (MSC's), chondrocyten en keratinocyten gemeten in suspensie zijnin figuur 2. Alle Raman spectra dezelfde structuur met toppen uit typische biomoleculen zoals eiwitten, nucleïnezuren, lipiden (zie Tabel 1). ¹² Voor deze celtypen het spectrale gebied tussen 600 en 1800 ^cm1 bevat meest relevante spectrale gegevens van die duidelijke verschillen worden waargenomen tussen de verschillende celtypes (Fig. 2A). Voorbeeldige, hebben we gewezen op een spectrale gebied (1280-1350 cm ^-1) tonen duidelijk structurele verschillen, dat is toewijsbaar aan moleculaire vibraties van collageen en lipiden. Daarentegen morfologische analyses zijn niet geschikt voor de identificatie en onderscheid van de meeste cellen (Fig. 2B-I). Het verschil tussen chondrocyten en huidcellen waarneembaar (Fig. 2D, H tegenover B, F en E I), fibroblasten en MSC's zijn moeilijk te scheiden met uitsluitend helder veld micrsocopy (fig. 2B, F ten opzichte van C, G). ¹³

Raman spectroscopische analyse van natuurlijke weefsel, in het bijzonder van ECM eiwitten vereist dat ROI kan worden gevisualiseerd door helder veld beeldvorming te kunnen richten op de respectieve structuur. Bij het toekennen van een eiwit met een bepaalde vingerafdrukspectrum genereerden we Ramanspectra commercieel beschikbare zuivere eiwitten en immunohistologisch gekleurd cryosecties. Hier hebben we gewezen op de vingerafdruk spectra van de elastische vezels in eigen weefsels te vergelijken gevriesdroogde elastine en immunofluorescentie-gekleurde vriescoupes het gebruik van een antilichaam tegen elastine. Echter, omdat elastine beschikt over een hoge autofluorescentie, hetgeen tot uiting komt in de Raman-spectra, de data-analyse is een uitdaging (fig. 3A). Om het systematische falen te verminderen als gevolg van sample-specifieke eigenschappen zoals autofluorescentie, een juiste verwerking van de gegevens is van cruciaal belang. In onze data eenalyses gebruikten we normalisatie de aanzienlijk hogere signaalsterkte van het zuivere elastine eiwit heffen en dus konden we vergelijkbaar Ramanspectra genereren (Fig. 3B). Elastine is een van de meest stabiele ECM eiwitten in het lichaam en bijgevolg zeer moeilijk vermindert. ¹⁴ de experimentele opstelling wij geïnduceerd elastine afbraak in gezonde varkens aortaklep folders door het uitvoeren van een enzymatische afbraak. Het toepassen van de multivariate analyse PCA, identificeerden we significante verschillen tussen de Raman-spectra van enzymatisch behandelde monsters en inheemse controles (fig. 3C). Deze spectrale verschillen waargenomen bij het ​​laden spectrum 861, 1003 en 1664 ^cm-1. Verwachte structurele veranderingen in de elastine-bevattende vezels als gevolg van langdurige blootstelling keer om elastase werden getoond door kleuring HART's (afb. 4), die ook tot uiting in meer verschillende scheiden score clusters (fig. 3C).

Figuur 1. De gemiddelde Raman-spectra van vrijstaande en aanhanger fibroblasten.

Figuur 2. (A) De gemiddelde Raman-spectra en standaarddeviaties van de vier verschillende primaire geïsoleerde soorten cellen (fibroblasten, MSC, chondrocyten en keratinocyten). Het frame benadrukt de spectrale gebied van 1280 - 1350 cm ^-1 met structurele verschillen. (BE) Helder-gebied beelden losse (B) fibroblasten (C) MSC's (D) chondrocyten en (E) keratinocyten. Schaal bar is gelijk aan 20 urn. (FI) Helder-gebied beelden van hechtende (F) fibroblasten (G) MSC's (H) en chondrocyten (I) keratinocyten. Schaal bar is gelijk aan 200 micrometer.

Figuur 3. (A) Raman spectra zonder normalisering van de lyophilized elastine (blauwe lijn), immunofluorescentie (IF)-gemerkt vriescoupes (oranje lijn) en elastische vezels (rode lijn) gemeten binnen inheemse aortaklep folders. De hoge signaal intensiteit van gevriesdroogde elastine wordt veroorzaakt door autofluorescentie. (B) Raman spectra na normalisatie, om storingen in het systeem te elimineren. (C) Scores en belastingen van de vergelijking tussen de niet-behandelde controle (rood) en enzymatisch-afgebroken (blauw en groen) elastische vezels in het eigen weefsel.

Figuur 4. HART's-gekleurde varkens aortaklep folders. Elastische vezels worden gevisualiseerd in zwart. (A) en (B) aantonen dat niet-behandelde controle en (C) en (D) tonen weefselmonsters werden de elastine afbrekend enzym elastase blootgesteld 30 minuten.

Golfgetal in cm -1	Opdracht 12
717-719	CN	Fosfolipiden
785-788	DNA / RNA basen, OPO ruggengraat	DNA / RNA
1003 - 1005	Fenylalanine	Eiwit
1220-1280	Amide III	Eiwit
1445-1447	CH2	Eiwit / Lipid
1655-1680	Amide IC = C	Eiwit Lipid

Tabel 1. Raman banden die zijn gedetecteerd spectra van celtypen (fibroblasten, MSC, chondrocyten en keratinocyten).

Discussion

Raman spectroscopie is een geschikt hulpmiddel om biologische monsters, zoals het analyseren van in vitro-gekweekte cellen en ECM eiwitten en cellen in cellen. ^11,15,16 Hier hebben we aangetoond dat deze non-contact, label-free techniek maakt het mogelijk de discriminatie van verschillende celtypes en de detectie van ECM afbraak van eiwitten uitsluitend gebaseerd op de intrinsieke biomoleculaire samenstelling van deze biologische monsters.

Het grote voordeel van Raman spectroscopie is het vermogen om niet-invasief meten van de biochemische vingerafdruk van een monster door de resulterende Raman spectra. In tegenstelling tot infrarood spectroscopie, die vergelijkbare informatie oplevert, kan Raman spectra worden verzameld uit waterige monsters, zoals de Raman verstrooiing uit het water zwak is. Bovendien wordt Raman spectroscopie uitsluitend gebaseerd op de detectie van terugverstrooiing van monochromatisch licht, dus geen monster verwerking vereist voor meting. Deze attributen maken Raman spectroscopie een veelbelovend alternatief voor potentiële in vivo imaging-toepassingen. In dit gebied, coherent anti-Stokes Raman spectroscopie (CARS) is een zeer interessante techniek omdat het in staat stelt sneller en meer gevoelige verwerving van gegevens op basis van dezelfde vibratie signalen gebruikt in onze experimenten. ^15,16 Andere alternatieve methoden, met inbegrip multifoton-geïnduceerde autofluorescentie en tweede frequentieverdubbeling beeldvormende eerder gebleken geschikt voor het bewaken biologische monsters niet of weinig invasief ^17. Maar deze beeldvorming geassocieerd met zeer hoge kosten en zijn beperkt tot autofluorescentie genereren moleculen. Bovendien Raman spectrometer gemakkelijk te combineren met conventionele optische microscoop. Deze eigenschappen maken Raman spectroscopie een waardevol instrument om biologische monsters te studeren in fysiologische omgevingen.

Een van de huidige beperkingen van onze Raman spectroscopie opgezet isde relatief kleine laser focus (250 nm volle breedte half maximum (FWHM) lateraal en 700 nm FWHM axiale) dat is gemaakt door een hoge numerieke apertuur doel (NA = 1,2). Hoewel een hoge numerieke apertuur toelaat betrekking op een goede hoeveelheid van het uitgezonden licht Raman waardoor een hoge signaal-ruisverhouding hoge NA produceert slechts een verzameling aandacht in het monster die doorgaans veel kleiner dan een cel. Om vergelijken Raman spectra van verschillende cellen, het verzamelen van een representatieve spectrum essentieel, die moeilijk te verkrijgen met een focusgebied. Om dit probleem aan te pakken, werken we aan een proces om het signaal collectie te automatiseren op verschillende punten in de cel (= Raman spectroscopische mapping), wat resulteert in een spectraal gemiddeld en toegeven aan een representatief spectrum. Bovendien kan deze techniek geven een overzicht van de verdeling van specifieke Raman banden, bijvoorbeeld van het eiwit verdeling in een cel.

Bioltief voor farmacologische monsters zijn zeer complex en bestaan ​​uit een heterogeen mengsel van biomoleculen die bijdragen aan de verzamelde Raman spectra. Daarom is de spectrale patroon is zeer complex en het toezicht op een type van een molecuul in een Raman spectrum is moeilijk te bereiken met de overlapping van verschillende molecuul signalen. Daarnaast kan de intrinsieke fluorescentie van het monster te maskeren waardevolle informatie van de zwakkere Raman signalen. Interessant is dat in sommige van onze vorige studies hebben we geïdentificeerd autofluorescentie in de Raman-spectra als de belangrijkste onderscheidende factor tussen celtypes (MSC's en fibroblasten) met behulp van een geschikte analyse-instrument. ¹³ We stelden ook vast dat veranderingen in de algemene Raman intensiteit van het signaal kan dienen als een indicator voor de staat van collageen en collageen vezels in de ECM van aortaklep folders. ⁹ Echter, bij het ​​analyseren van de toestand van elastine in deze weefsels, waren we niet in staat om vergelijkbare resultaten te detecteren. Zoals in het resultaats paragraaf wordt konden alleen veranderingen in bepaalde Raman banden detecteren in de elastase-behandelde monsters in vergelijking met de oorspronkelijke controles. We niet van een afname van de totale Raman signaal in het enzymatisch behandelde monsters verwacht. Deze waarnemingen resulteerde in een score plot die niet blijkt duidelijk clustervorming zoals in de vorige studie. ⁹ daarentegen de invloed van de enzymatische behandeling detecteerbaar in de PCA resultaten. We veronderstellen dat deze verschillen tussen de twee ECM eiwitten elastine en collageen, zijn gebaseerd op morfologische verschillen en verschillende enzymatische afbraak processen: in de aortaklep bijsluiter het collageen rijk gebied (fibrosa) een continue laag die raakt los door de enzymatische behandeling, waarbij de elastine met zone (ventricularis) een netwerkconfiguratie weergegeven gefragmenteerd na blootstelling aan elastase (Fig. 4). Single ter plekke metingen waren dus niet appropriaten om dergelijke kleine breuken te detecteren binnen het elastine netwerk. Hier zou een Raman in kaart brengen van het weefsel te helpen om te netwerken storingen te identificeren.

Een ander probleem bij Raman spectroscopie van biologische monsters is om de meettijden. Een oplossing is om de laservermogen, dat geschikt is zolang de biologische monsters niet beïnvloed door foto-schade. Al onze huidige experimenten zijn proof-of-principle studie zich richt op fundamenteel onderzoek, maar onze algemene doel is om Raman spectroscopie te voeren voor klinische toepassingen, zoals regeneratieve geneeskunde (bv. kwaliteitscontrole van tissue-engineered producten), pre-transplantatie graft monitoring en diagnose van kanker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
elastase	Worthington Biochemical	LS006363
anti-elastin antibody	Sigma-Aldrich	HPA018111	1:75; citrate buffer
PBS	Lonza Inc.	17-512F
glass bottom dishes	Greiner Bio-One	627860
The Unscrambler	CAMO
Opus	Bruker Corporation