Summary
A espectroscopia Raman é uma técnica adequada para o contato não, rótulo sem análise de células vivas, tecidos engenharia de construções e tecidos nativos. Fonte específicos impressões digitais espectrais podem ser gerados e analisados utilizando análise multivariada.
Abstract
Tecnologias não-destrutiva, sem contato e sem rótulo para monitorar células e culturas de tecidos são necessários no campo da pesquisa biomédica. 1-5 métodos de rotina No entanto, atualmente disponíveis exigem etapas de processamento e alterar a integridade da amostra. A espectroscopia Raman é um método rápido que permite a medição de amostras biológicas sem a necessidade de passos de processamento adicionais. . Esta tecnologia baseada em laser detecta o espalhamento inelástico de luz monocromática 6 Como cada vibração química é atribuído a uma banda específica de Raman (número de onda em cm -1), cada amostra biológica apresenta um padrão típico espectral devido à sua composição bioquímica inerente 7. - 9 Dentro espectros Raman, as intensidades de pico correlacionar com a quantidade das ligações presentes moleculares. 1 semelhanças e diferenças dos conjuntos de dados espectrais pode ser detectado através do emprego de uma análise multivariada (por exemplo, análise de componentes principais (PCA)). 10
Aqui, nós realizar espectroscopia de Raman de células vivas e tecidos nativas. As células são semeadas quer em pratos de fundo de vidro ou mantidos em suspensão sob condições de cultura de células normais (37 ° C, 5% de CO 2) antes da medição. Tecidos nativos são dissecados e armazenado em tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C medições anteriores. Dependendo do nosso conjunto experimental acima, nós então ou focado no núcleo da célula ou da matriz extracelular (ECM) proteínas tais como a elastina e colagénio. Para todos os estudos, um mínimo de 30 células ou 30 pontos aleatórios de interesse dentro do ECM são medidos. Etapas de processamento de dados incluído subtração de fundo e normalização.
Protocol
1. Preparação da amostra biológica
- Preparação de células vivas
- Preparação de células aderentes
- Sementes em células in vitro-cultivados ou recentemente isolado sobre um prato de fundo de vidro (Greiner BioOne / Alemanha) e incubar-los a 37 ° C e 5% de CO 2 até ligação de células é concluída.
- Remover o meio de cultura e lavar suavemente três vezes com PBS antes de medição. Manter as células cobertas com PBS ou meio de cultura celular em todo o procedimento de medição todo.
- Preparação das células em suspensão
- Retire in vitro em cultura de células de acordo com protocolos comuns (por exemplo, tripsina-EDTA, raspagem célula), centrifugar as células e re-suspender o sedimento celular obtido em PBS ou meio de cultura celular.
- Transferir 100 uL da suspensão de células (concentração: max. 100.000 células / ml) para um prato de fundo de vidro.
- Preparação de células aderentes
- Preparação de native tecidos
- Após a colheita dos tecidos, transferi-los para estéril, PBS gelado e mantê-los não mais do que 12 horas a 4 ° C, ou por medição gelo antes. As experiências anteriores demonstram que um tempo de armazenamento prolongado (tempo de isquemia fria de 12 horas a 4 ° C) resultou em alterações espectrais devido aos processos de degradação naturais.
- As medições devem ser realizadas com o tecido coberto em PBS ou meio para evitar danos das proteínas de ECM e células devido a secagem dos tecidos.
2. Raman Spectrometer
O nosso espectrómetro de Raman personalizado combina um microscópio de fluorescência padrão (Olympus IX 71) com um espectrómetro de Raman, que permite a comparação directa das imagens de campo brilhante e fluorescência com os espectros de Raman. O conjunto de base até consiste de um 784 nm diodo laser (Toptica fotónica AG / Alemanha), um filtro de entalhe para a separação da luz Raman-dispersa a partir da luz de excitação, um microscópio umand a. espectrógrafo (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / EUA) com um dispositivo de carga acoplado (CCD da câmera) otimizado para a detecção de informação espectral (F-vista do Soft Systems imagem / Alemanha)
3. Controle da Função Laser
- Inicie o software Andor Solis (Andor / Reino Unido) e ajustar a temperatura da câmara CCD a -60 ° C para minimizar o ruído causado pelas correntes termicamente induzidas na câmara.
- Colocar uma bolacha de silício sobre a platina do microscópio para o procedimento de calibração.
- Ligar o laser e definir o poder de 85 mW.
- Use o software Célula B (Olympus / Alemanha) para focalizar o laser sobre a bolacha até parece XY.
- Medir a bolacha de silício com um tempo de integração única de 1 seg usando um objectivo ar 60x.
- Alterar a unidade do eixo-x a partir do número de pixels para mudança de Raman (cm -1) no software Solis Andor.
- Variar o foco do laser do pico de silício a 520 cm -1 emo espectro recolhido a fim de encontrar a intensidade máxima possível para esta banda Raman. A quantidade mínima de contagens deve ser superior a 11.000 para ter uma calibração bem sucedida.
4. Raman medições espectroscópicas
Todas as medições são realizadas à temperatura ambiente.
- As definições básicas
- Usar uma objectiva de imersão em água 60x (Olympus / Alemanha) com uma abertura numérica de 1,2 para recolher o espectro das amostras.
- Alterar as configurações de aquisição a 10 integrações / 10 segundos para um total de 100 segundos por medições.
- Medição de células aderentes
- Pegue o prato com fundo de vidro com as células e colocá-lo no palco microscópio.
- A fim de obter um melhor sinal e garantir a reprodutibilidade, foco do laser sobre o núcleo da célula, transformar a luz do microscópio fora e iniciar a recolha do espectro.
- Meça um espectro de referência do fundo emuito espectros 10, movendo o foco do laser ao lado da célula. É importante considerar que ao mudar o foco um novo fundo devem ser recolhidos para cada profundidade de foco.
- Medição de células em suspensão
- Transferir 100 uL da suspensão de células numa cápsula de fundo de vidro e colocá-la na platina do microscópio.
- Foco do laser sobre o centro da célula, transformar a luz do microscópio fora e iniciar a recolha do espectro.
- Meça um espectro de referência do fundo todos os espectros de 10, movendo o foco do laser ao lado da célula. Ao mudar o foco, um novo fundo devem ser recolhidos para a profundidade novo foco.
- Medição dos tecidos nativas
- Leve a amostra e colocá-lo em um prato fundo de vidro. A região de interesse (RDI) devem ser orientados de frente para o fundo do prato.
- Encha o prato com PBS suficiente para cobrir a amostra.
- Coloque um vidro de cobertura sobre a amostra para evitar qualquer movement da amostra durante as medições.
- Definir o foco do laser na estrutura de interesse (resolução de profundidade é a laser e tecido-dependente) e começar a recolher os espectros.
- Recolher um espectro de referência do fundo todos os espectros de 10 movendo-se o laser de se concentrar para fora da área do tecido todo. Ao mudar o foco, um novo fundo devem ser recolhidos para a profundidade novo foco.
- Medição de imunofluorescência (IF)-rotulados criossecções
- Seção fresco, congelado amostras de tecido usando um cryotom padrão e montá-los em vidros de sílica revestidos de cobertura.
- Manchar os criossecções seguindo um protocolo de rotina para IF, empregando apenas um passo de fixação curto (máximo 10 minutos, com paraformaldeído a 4%) e utilizando anticorpos adequados para a detecção da proteína de interesse.
- Realizar medições Raman centrados na área onde ocorre a fluorescência.
- Degradação experimentos elastina
- Place o ventricularis dos dissecados folhetos aórticos porcinos válvula (elastina-rico, a camada de sangue influxo lado do folheto da válvula cardíaca) voltados para o fundo do prato de fundo de vidro.
- Medir o tecido nativo como um 'de controlo não-incubada' menos 30 pontos aleatórios em toda a superfície do tecido todo focagem nas estruturas fibrilares.
- Dividir a amostra em 3 secções e colocá-los em separados 2,5 tubos Eppendorf ml cheios com 2 ml de uma solução de elastase (5 U / ml, Worthington / Alemanha).
- Incubar o tecido para 15 ou 30 minutos a 37 ° C.
- Após incubação durante 15 ou 30 minutos, remover os tecidos a partir do tubo de Eppendorf e lavar cuidadosamente com PBS, a fim de parar completamente a reacção enzimática.
- Meça cada amostra em 30 pontos aleatórios, concentrando-se nas estruturas fibrilares.
5. Processamento de Dados e Análise
- Processamento de espectros Raman
O pré-tratamento doOs espectros de gerado foi realizada usando software OPUS (Bruker Optik GmbH / Alemanha).- A fim de reduzir sinais de interferência a partir do vidro e médio bem como para evitar variações provocadas por alterações no foco durante as medições, subtrair o espectro de fundo correspondente a partir dos espectros recolhidos.
- Reduzir o espectro para a região número de onda entre 400-1800 cm -1, que oferece a maior quantidade de informações.
- Se necessário, normalizar os espectros para o pico máximo. Fatores de normalização fora das flutuações de intensidade e falhas sistemáticas, simplificando a detecção de mudanças estruturais no espectro da amostra.
- Realizar uma correção de linha de base para aumentar a comparabilidade entre diferentes experimentos.
- Análise dos espectros Raman
Os espectros Raman foram analisados utilizando PCA com o software Unscrambler (CAMO / Noruega). Esta análise multivariada detecta diferenças e semelhanças nos dados espectraisconjuntos. Cada espectro é plotado como um ponto único em um espaço multidimensional com base nas contagens coletados para cada turno Raman. Cada componente de princípio (PC) descreve uma certa quantidade, o total de informação contida nos dados originais. O primeiro PC é a que contém a maior fonte de variação. Cada PC a seguir contém, na ordem, menos informação do que o anterior. Cada variável tem uma pontuação e uma carga em cada PC. Ao traçar PCs (= pontos), correlações importantes amostras podem ser expostos. As cargas descrever a contribuição de cada variável analisada para o PCA.- Rotular cada grupo de medidas, criando faixas de linha para cada grupo de amostra.
- Utilize as seguintes definições básicas para o PCA: validação cruzada, o algoritmo NIPALS, sem rotação e iniciar a análise. Essas configurações são espectros dependente.
- Execute o PCA.
6. Os resultados representativos
Raman spECTRA gerada a partir de células aderentes revelam frequentemente uma relação sinal-ruído baixo e uma intensidade de sinal global baixo (Fig. 1). 11 Devido ao facto de que o foco do laser tem de ser definido perto do fundo do vidro, a influência da interferindo sinal de vidro é bastante elevado, causando mascaramento do sinal de amostra real. Por conseguinte, o sinal da amostra pode ser minimizada ou eliminada, mesmo durante um subsequente fundo subtracção. Assim, nós preferimos usar células em suspensão para a nossa análise espectroscópica de Raman, uma vez que permitem a detecção de uma informação mais detalhada espectral. No entanto, os espectros de células aderentes e suspensão exibem os mesmos picos principais diferindo apenas nas suas intensidades.
Para a caracterização de tipos de células diferentes dentro de uma suspensão, sem pré-tratamento é necessário. Os espectros de Raman média e desvio padrão de fibroblastos humanos, células estaminais mesenquimais (MSCs), condrócitos e queratinócitos medido em suspensão sãorepresentado na Figura 2. Todos os espectros de Raman são similarmente estruturado, com picos proveniente de biomoléculas típicos, tais como proteínas, ácidos nucleicos e lípidos (ver Tabela 1). 12 Para estes tipos de células, a região espectral entre 600 e 1800 cm -1 contém mais relevante informação espectral, por qual as diferenças claras são detectáveis entre os diferentes tipos de células (Fig. 2A). Exemplar, destacamos uma região espectral (1280-1350 cm -1) apresentando claras diferenças estruturais, que pode ser atribuído às vibrações moleculares de colágeno e lipídios. Em contraste, as alterações morfológicas não são adequados para a identificação e distinção da maioria das células (Fig. 2B-I). Embora a diferença entre os condrócitos e células da pele é observável (Fig. 2D, H versus B, F e E, I), os fibroblastos e os MSCs são difíceis de separar usando unicamente de campo brilhante micrsocopiar (Fig. 2B, F versus C, G). 13
Análise espectroscópica de Raman do tecido nativo, particularmente das proteínas da MEC, requer que um ROI pode ser visualizado por brilhante-campo de imagem, a fim de ser capaz de se concentrar na respectiva estrutura. Para a atribuição de uma proteína a um espectro de impressão digital específica, geramos espectros Raman de proteínas disponíveis comercialmente puros e criosecções immunohistologically manchadas. Aqui, identificamos os espectros de impressões digitais das fibras elásticas em tecidos nativos comparando elastina liofilizado e imunofluorescência manchadas criosecções empregando um anticorpo contra elastina. No entanto, uma vez que a elastina possui uma autofluorescência elevada, o que se reflecte no espectro de Raman, a análise dos dados é um desafio (Fig. 3A). Para reduzir o fracasso sistemático devido à amostra propriedades específicas, tais como, autofluorescência um processamento adequado dos conjuntos de dados é crucial. Em nossos dados de umalyses, utilizou-se a normalização para eliminar a intensidade do sinal significativamente mais elevado da proteína pura de elastina, e assim, fomos capazes de gerar espectros de Raman comparável (Fig. 3B). A elastina é uma das proteínas de ECM mais estáveis do corpo e é, portanto, muito difícil de se degradar. 14 No nosso conjunto experimental acima, nós induzida degradação da elastina em saudáveis suína folhetos da válvula aórtica através da realização de uma digestão enzimática. Aplicando a análise multivariada PCA, identificou-se diferenças significativas entre os espectros de Raman do enzimaticamente tratados com as amostras e controlos nativas (Fig. 3C). Estas diferenças espectrais foram observados no espectro de carregamento em 861, 1003 e 1664 cm1. Esperados alterações estruturais nas fibras de elastina contendo devido aos tempos de exposição prolongados para elastase foram mostradas através de coloração de Hart (Fig. 4), que foram também se reflecte no mais grupos distintos de pontuação separáveis (Fig. 3C).
Figura 1. A média de espectros Raman de fibroblastos destacados e aderente.
Figura 2. (A) A média de espectros Raman e desvios-padrão de quatro diferentes tipos de células isoladas primárias (fibroblastos, células mesenquimais, condrócitos e queratinócitos). A armação destaca a região espectral de 1280 - 1350 cm1 com diferenças estruturais. (BE) de campo brilhante imagens de geminadas (B) fibroblastos, (C) MSCs, (D) condrócitos e (E) queratinócitos. Barra de escala é igual a 20 microns. (FI) de campo brilhante imagens de aderentes (F) fibroblastos, (G) MSCs, (H) e condrócitos i) queratinócitos. Barra de escala é igual a 200 mM.
Figura 3. (A) Os espectros de Raman sem normalização da lyophilized elastina (linha azul), imunofluorescência (IF)-rotulados criosecções (linha laranja) e fibras elásticas (linha vermelha) medidos dentro folhetos da válvula aórtica nativa. A intensidade de sinal de alta da elastina liofilizado é causada por autofluorescência. (B) Os espectros de Raman após a normalização, a fim de eliminar falhas sistémicas. (C) Resultados e cargas da comparação entre controle não-tratado (vermelho) e enzimaticamente degradado (azul e verde) elásticas fibras dentro do tecido nativo.
Figura 4. HART's manchadas de suínos folhetos da válvula aórtica. As fibras elásticas são visualizados em preto. (A) e (B) mostram controle não-tratado e (C) e (D) mostram amostras de tecido que foram expostos a enzima elastase elastina-degradantes para 30 minutos.
| Número de onda em cm -1 | Atribuição de 12 | |
| 717-719 | CN | Fosfolipídios |
| 785-788 | ADN / ARN bases, Backbone OPO | DNA / RNA |
| 1003 - 1005 | Fenilalanina | Proteína |
| 1220-1280 | III amida | Proteína |
| 1445-1447 | CH 2 | Proteína / lípido |
| 1655-1680 | Amida IC = C | Lipídeos |
Tabela 1. Bandas Raman que são detectados dentro de espectros de todos os tipos de células (fibroblastos, MSCs, condrócitos e queratinócitos).
Discussion
A espectroscopia Raman é uma ferramenta adequada para analisar amostras biológicas, tais como in vitro em cultura de células e proteínas de ECM, bem como células nos tecidos nativas. 11,15,16 Aqui, foi demonstrado que este contacto não-,-label livre técnica permite que o discriminação de diferentes tipos de células e na detecção de ECM degradação de proteínas exclusivamente com base na composição biomolecular intrínseca dessas amostras biológicas.
A principal vantagem da espectroscopia de Raman é a capacidade de não-invasiva quantificar a impressão digital bioquímica de uma amostra por sua espectros Raman resultante. Em contraste com a espectroscopia no infravermelho, o que produz informação semelhante, espectros de Raman podem ser recolhidos a partir de amostras aquosas, como a dispersão de Raman a partir de água é fraca. Além disso, espectroscopia de Raman é unicamente com base na detecção de retroespalhamento de luz monocromática, portanto, não é necessário o processamento da amostra de medição anterior. Estes atributos fazem Raespectroscopia homem uma alternativa promissora para o potencial em aplicações de imagem in vivo. Neste âmbito, coerente anti-stokes espectroscopia Raman (CARS) é uma técnica muito interessante, pois permite mais rápido e mais sensível aquisição de dados com base nos mesmos sinais vibracionais utilizadas em nossos experimentos. 15,16 Outros métodos alternativos, incluindo multifotônica induzida por autofluorescência e de imagem de segunda geração harmónica tenham sido previamente demonstrado ser adequada para a monitorização amostras biológicas não-invasiva ou mínima. 17 No entanto, estes métodos de imagem estão associados com custos muito elevados e são limitados a autofluorescência geradoras de moléculas. Além disso, espectrómetro de Raman é fácil de se combinar com microscópios ópticos convencionais. Estas características tornam a espectroscopia Raman uma ferramenta valiosa para estudar amostras biológicas em ambientes fisiológicos.
Uma das limitações atuais do nosso espectroscopia Raman é criadoo foco do laser relativamente pequeno (250 nm máximo meia largura total (FWHM) lateral e 700 nm FWHM axial) que é criado por um objectivo alta abertura numérica (NA = 1,2). Embora uma alta abertura numérica permite cobrir uma boa quantidade de luz emitida Raman rendendo em uma relação sinal-ruído elevado, o NA elevada produz apenas um foco de recolha pequena dentro da amostra que é tipicamente muito menor do que uma célula. A fim de comparar os espectros Raman de células diferentes, a recolha de um espectro representativo é essencial, que é difícil de obter, com uma área de focagem pequeno. Para resolver este problema, estamos trabalhando em um processo para automatizar a coleta de sinal em diferentes pontos dentro da célula (= mapeamento Raman espectroscópica), resultando em uma média espectral e ceder a um espectro representativo. Além disso, esta técnica irá fornecer uma visão geral da distribuição de bandas específicas de Raman, por exemplo da distribuição da proteína dentro de uma célula.
BiolAs amostras ogical são altamente complexas e consistem de uma mistura heterogénea de biomoléculas que contribuem para os espectros de Raman recolhidos. Portanto, o padrão espectral é altamente complexa e no controlo de um único tipo de uma molécula dentro de um espectro de Raman é difícil de realizar com a sobreposição de sinais de moléculas diferentes. Além disso, a fluorescência intrínseca da amostra pode mascarar informação valiosa de mais fracos sinais de Raman. Curiosamente, em alguns de nossos estudos anteriores, identificamos autofluorescência nos espectros Raman como o principal fator de diferenciação entre tipos de células (MSCs e fibroblastos), utilizando uma ferramenta de análise apropriado 13. Também identificamos que as mudanças na intensidade do sinal Raman global pode servir como um indicador para o estado de colágeno e fibras de colágeno dentro do ECM de folhetos da válvula aórtica. 9 No entanto, ao analisar o estado de elastina nestes tecidos, não foram capazes de detectar resultados semelhantes. Como mencionado no resultadoseção s, que só foram capazes de detectar alterações específicas de bandas Raman nas amostras tratadas com elastase quando comparados com os controles nativos. Nós não vimos uma diminuição do sinal global Raman nas amostras tratadas enzimaticamente como esperado. Estas observações resultou em uma trama pontuação que não revelou uma formação de aglomerados claro como pode ser visto no estudo anterior. 9 Em contraste, a influência do tratamento enzimático foi detectável dentro dos resultados do APC. Supomos que essas discrepâncias entre as duas proteínas de ECM, elastina e colágeno, são baseadas em diferenças morfológicas e diferentes processos de degradação enzimática: dentro do folheto da válvula aórtica, a zona rica em colágeno (fibrosa) é uma camada contínua que fica solta devido à tratamento enzimático, através do qual o elastina contendo zona (ventricularis) tem uma configuração de rede que aparece fragmentado após a exposição a elastase (Fig. 4). Medições pontuais individuais não eram, portanto, aprocomeu para detectar tais pequenas rupturas dentro da rede de elastina. Aqui, um mapeamento de Raman do tecido iria ajudar a identificar avarias de redes.
Um outro desafio em espectroscopia de Raman de amostras biológicas é reduzir os tempos de medição. Uma solução consiste em aumentar a potência do laser, que é adequado, desde que as amostras biológicas não são afectados por foto-danos. Todas as nossas experiências em curso são a prova de princípio de estudos com foco em pesquisa básica, no entanto, nosso objetivo geral é implementar a espectroscopia Raman para aplicações clínicas, incluindo a medicina regenerativa (por exemplo, controle de qualidade do tecido de produtos), pré-transplante de monitorização do enxerto e diagnóstico de câncer.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Steffen Koch por seu apoio técnico e Shannon Lee Layland (ambos Fraunhofer IGB Stuttgart) por suas sugestões úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo programa Atrair da Fraunhofer-Gesellschaft e do BMBF (tanto para KS-L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| elastase | Worthington Biochemical | LS006363 | |
| anti-elastin antibody | Sigma-Aldrich | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
| PBS | Lonza Inc. | 17-512F | |
| glass bottom dishes | Greiner Bio-One | 627860 | |
| The Unscrambler | CAMO | ||
| Opus | Bruker Corporation |
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