ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Summary

ラマン分光法は、生きた細胞、組織工学の構造とネイティブの組織の非接触、ラベルフリー解析に適した手法です。ソース固有のスペクトル指紋が生成され、多変量解析を用いて分析することができます。

Abstract

細胞や組織文化を監視するための非破壊、非接触でラベルフリー技術は、生物医学研究の分野で必要とされる^1-5しかし、現在利用可能なルーチンの方法は処理ステップを必要とし、サンプルの整合性を変更します。ラマン分光法は、さらなる処理ステップを必要とせずに生物学的試料の測定を可能にする高速な方法です。このレーザーベースの技術は、単色光の非弾性散乱を検出する⁶すべての化学物質の振動は、特定のラマンバンド（cm ^-1で波数）に割り当てられているように、各生物試料がその固有の生化学的組成に起因する典型的なスペクトルパターンを備えています^{7。 -}ラマンスペクトル内の^9、ピーク強度が存在する分子の結合の量と相関する。スペクトルデータセットの¹の類似点と相違点が多変量解析（例えば、主成分分析（PCA））を用いることにより検出することができます¹⁰

ここでは、生きた細胞とネイティブ組織のラマン分光法を実行します。細胞は、いずれかのガラスボトムディッシュに播種し、測定する前に、正常な細胞培養条件（37℃、5％CO _2）の下で懸濁状態で保持されます。ネイティブの組織は、4°C、測定前に食塩水（PBS）を緩衝解剖し、リン酸塩に格納されています。我々の実験設定に応じて、我々は、どちらの細胞核や、エラスチンやコラーゲンなどの細胞外マトリックス（ECM）タンパク質に焦点を当てた。すべての研究のために、30細胞やECM内で関心のある30のランダムな点の最小値が測定されます。データ処理の手順は、背景差分法と正規化が含まれています。

Protocol

1。生体試料の調製

1. 生きた細胞の調製
   1. 付着細胞の調製
      1. ガラスボトムディッシュ（グライナーBioOne /ドイツ）、37でそれらをインキュベートに関する in vitro培養または新たに単離された細胞のシード℃、5％CO ₂の細胞接着が完了するまで。
      2. 培地を除去し、PBS、測定の前で穏やかに3回洗浄します。全体の測定手順を通してPBSまたは細胞培養培地のいずれかで覆われた細胞を保持します。
   2. 懸濁液中の細胞の調製
      1. 一般的なプロトコル（例えば、トリプシン-EDTA、細胞スクレイピング）に従ってin vitroで培養細胞中で切断し、細胞を遠心分離し、得られたPBSで細胞ペレットまたは細胞培養培地に再懸濁する。
      2. ガラスボトムディッシュに：細胞懸濁液100μl（最大100,000細胞/ mlの濃度）を転送します。
2. NATの準備IVEの組織
   1. 組織を収穫した後、4℃または氷上測定前に12時間以上滅菌、氷冷PBSに移し、もはやそれらを保つません。以前の実験では、長期保管時間（4℃冷虚血時間は> 12時間）、自然分解プロセスによるスペクトルの変化をもたらしたことを示している。
   2. 測定は、組織の乾燥に起因するECMタンパク質や細胞の損傷を避けるためにPBSで覆われた組織または媒体で実行する必要があります。

2。ラマン分光計

私達のカスタマイズされたラマン分光は、ラマンスペクトルを持つ明視野および蛍光画像の直接比較を可能にするラマン分光で標準的な蛍光顕微鏡（Olympus IX 71）を兼ね備えています。基本セットは、最大784 nmのダイオードレーザー（TopticaフォトニクスAG /ドイツ）、励起光からのラマン散乱光を分離するためのノッチフィルタ、顕微鏡で構成されていますスペクトル情報（ソフトイメージングシステム/ドイツからF-ビュー）の検出に最適化された電荷結合素子（CCDカメラ）とND分光器（カイザーオプティカルシステムズ、アナーバー/アメリカ）。

3。レーザー機能の制御

1. ソフトウェアアンドールソリス（アンドール/イギリス）を起動して、°Cカメラの熱誘起電流によるノイズを最小限に抑えるために-60 CCDカメラの温度を設定します。
2. キャリブレーション手順については、顕微鏡ステージ上にシリコンウエハを配置します。
3. 上にレーザーをオンにし、85 mWまでのパワーを設定します。
4. XYが表示されるまで、ウェハ上にレーザーの焦点を合わせるために、ソフトウェアセルB（オリンパス/ドイツ）を使用します。
5. 60倍の空気対物レンズを用いて1秒の単一の積分時間で、シリコンウェーハを測定します。
6. 画素数からアンドールソリスソフトウェアのラマンシフト（cm ^-1）を、x軸の単位を変更します。
7. の520 cm ^-1にシリコンピークのレーザーの焦点を変えるこのラマンバンドのために最大限の強度を見つけるためにスペクトルを収集。カウントの最小量は、キャリブレーションの成功を持っている11000以上でなければなりません。

4。ラマン分光測定

すべての測定は室温で行われます。

1. 基本的な設定
   1. サンプルのスペクトルを収集するために1.2の開口数で60倍の水浸対物レンズ（オリンパス/ドイツ）を使用します。
   2. 測定は100秒の合計10の統合/ 10秒に取得の設定を変更します。
2. 付着細胞の測定
   1. 細胞をガラス底皿を取り、顕微鏡ステージ上に置きます。
   2. 優れた信号を取得し、再現性を確保するために、細胞核にレーザーの焦点を、顕微鏡の光をオフにし、スペクトルの収集を開始します。
   3. 背景電子の参照スペクトルを測定セルの横にレーザーフォーカスを移動することにより、非常に10スペクトルを示す。それは、フォーカスを変更したときに新しい背景がそれぞれの焦点深度のために収集する必要があることを考慮することが重要です。
3. 懸濁液中の細胞の測定
   1. ガラスボトムディッシュに細胞懸濁液の100μlを移し、顕微鏡ステージ上に置きます。
   2. セルの中心にレーザーの焦点を、顕微鏡の光をオフにし、スペクトルの収集を開始します。
   3. セルの横にレーザーフォーカスを移動することによって、バックグラウンドの参照スペクトルすべての10のスペクトルを測定します。フォーカスを変更する場合は、新しいバックグラウンドは新しいフォーカスの深さのために収集する必要があります。
4. ネイティブの組織の測定
   1. サンプルを取り、ガラス底皿に置きます。関心領域（ROI）は、皿の底に直面して配向されるべきである。
   2. サンプルをカバーするのに十分なPBSで皿を記入してください。
   3. 任意の楽章を避けるために、サンプル上のカバーガラスを置き測定中にサンプルのement。
   4. 興味のある構造（深さ分解能はレーザーや組織に依存します）にレーザーの焦点を設定し、スペクトルの収集を開始します。
   5. 全体の組織領域のレーザー外にフォーカスを移動することにより、バックグラウンドの参照スペクトルすべての10のスペクトルを収集します。フォーカスを変更する場合は、新しいバックグラウンドは新しいフォーカスの深さのために収集する必要があります。
5. 免疫蛍光の測定（IF）で標識した凍結切片
   1. 標準cryotomを使用してセクション新鮮、スナップ凍結組織サンプルとシリカ被覆カバーガラス上にマウントします。
   2. 短い固定ステップ（4％パラホルムアルデヒドで最大10分）を用い、目的のタンパク質を検出するための適切な抗体を用いて、IFのルーチンプロトコルに従って凍結切片を染色する。
   3. 蛍光が発生する領域で焦点ラマン測定を行う。
6. エラスチンの分解実験
   1. ナンプラーCEガラス底皿の底に面した解剖ブタの大動脈弁尖（エラスチンが豊富な、心臓弁尖の血液流入側の層）のventricularis。
   2. 線維構造に焦点を当て、全体の組織表面を横切って30のランダムな点で "非インキュベートしたコントロールなどのネイティブ組織を測定します。
   3. 3つのセクションにサンプルを分割し、エラスターゼ溶液（5 U / mlと、ワージントン/ドイツ）の2ミリリットルを充填した独立した2.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに入れます。
   4. 37℃で15または30分のいずれかに組織をインキュベートします。
   5. 15または30分間インキュベートした後、エッペンドルフチュー​​ブから組織を除去し、完全に酵素反応を止めるためにPBSで丁寧に洗い流してください。
   6. 線維構造に焦点を当て、30のランダムな点で、各サンプルを測定します。

5。データ処理と解析

1. ラマンスペクトルの処理
   の前処理生成されたスペクトルは、OPUSソフトウェア（ブルカーオプティック社/ドイツ）を用いて行った。
   1. 測定時の焦点の変化による変動を避けるために、ガラスやメディアなどからの干渉信号を低減するために、収集したスペクトルから対応するバックグラウンドスペクトルを減算します。
   2. 情報の最大量を提供しています400〜1800センチメートル^-1の波数領域にスペクトルを減らすことができます。
   3. 必要に応じて、最大ピークスペクトルを正規化します。サンプルのスペクトルの構造変化の検出を簡素化強度の変動と系統の故障、外正規化因子。
   4. 異なる実験間の比較可能性を高めるために、ベースライン補正を行います。
2. ラマンスペクトルの解析
   ラマンスペクトルは、Unscrambler（CAMO /ノルウェー）のソフトウェアとPCAを用いて分析した。この多変量解析は、スペクトルデータ内の類似点と相違点を検出セット。すべてのスペクトルは、すべてのラマンシフトのために収集されたカウントに基づいて、多次元空間内の単一の点としてプロットされます。各主成分（PC）は、元のデータに含まれる全情報の一定量を示しています。最初のPCは、バリエーションの最高のソースを含むものである。次の各PCは、順番に、以前のものより少ない情報が含まれています。すべての変数は、スコアと各PCの負荷を持っています。パソコン（=スコア）をプロットすることにより、重要なサンプルの相関が露出することができます。負荷は、PCAの各分析変数の寄与を説明します。
   1. すべてのサンプルグループの行の範囲を作成することによって、測定値の各グループにラベルを付けます。
   2. PCAは、以下の基本的な設定を使用します。クロスバリデーション、NIPALSアルゴリズム、回転させないし、分析を開始します。これらの設定は、スペクトルに依存しています。
   3. PCAを実行します。

6。代表的な結果

ラマンSPectraは、しばしば低信号対雑音比と低全体的な信号強度（ 図1）を明らかにした接着細胞から生成された。レーザーの焦点は、ガラス底の近くに設定する必要がありますという事実のために¹¹は、干渉の影響をガラス信号は、実際のサンプル信号のマスキングを引き起こして、かなり高いです。その後のバックグラウンド減算中にその結果、サンプル信号が最小化されるかもしれない、あるいは排除した。したがって、我々は、彼らがより詳細なスペクトル情報の検出を可能として、我々のラマン分光分析のために懸濁液中で細胞を使用することを好む。しかし、付着および浮遊細胞のスペクトルはその強度のみが異なる同一の主ピークを示す。

サスペンション内の異なる種類の細胞の特性については、全く前処理は必要ありません。懸濁液中で測定したヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞（MSC）、軟骨細胞およびケラチノサイトの平均ラマンスペクトルと標準偏差である図2に示す。すべてのラマンスペクトルは、同様に（ 表1参照）のピークがそのようなタンパク質、核酸、脂質などの典型的な生体分子に由来すると、構造化されています。これらの細胞型は^{12、600、1800} cm ^-1の間のスペクトル領域にすることにより、最も関連性のスペクトル情報が含まれていますその明確な違いは、異なる種類の細胞（ 図2A）との間で検出可能である。典型的な、我々は、コラーゲンと脂質の分子振動に割り当てることが明確な構造の違いを表示1スペクトル領域（1280〜1350センチメートル^-1）を 、強調した。対照的に、形態素解析は、ほとんどの細胞の同定および区別（ 図2B-I）には適していません。軟骨細胞や皮膚細胞の間に差がある（ 図2D、H対B、FとE、I）観測されていますが、線維芽細胞とMSCは単に明るいフィールドmicrsocを使用して分離することは困難であるOPY（ 図2B、F対^C、G）13

特にECMタンパク質のネイティブ組織のラマン分光分析では、ROIは、それぞれの構造に焦点を当てることができるようにするために明視野イメージングにより可視化することができている必要があります。特定の指紋スペクトルへのタンパク質の割り当てについては、我々は市販の純粋なタンパク質と免疫組織染色した切片のラマンスペクトルを生成します。ここでは、凍結乾燥したエラスチン、エラスチンに対する抗体を用いる免疫蛍光染色した切片を比較して、ネイティブの組織内の弾性線維の指紋スペクトルを同定した。しかし、エラスチンは、ラマンスペクトルに反映されて高い蛍光を備えているので、、データ解析は困難である（ 図3A）。により、そのような蛍光等の試料固有のプロパティに体系的障害を軽減するために、データ·セットの適切な処理が重要である。私たちのデータでalyses、我々は純粋なエラスチンタンパク質の有意に高い信号強度を排除するために正規化を使用し、従って、我々は同等のラマンスペクトル（ 図3B）を生成することができました。エラスチンは、体の中で最も安定したECMタンパク質の一つであるため、低下させることは非常に困難である¹⁴私たちの実験的なセットアップでは、酵素消化を行うことにより、健康なブタ大動脈弁尖にエラスチンの分解を誘導した。多変量解析主成分分析を適用して、我々は、酵素処理したサンプルとネイティブコントロール（ 図3C）のラマンスペクトルの間に有意差を同定した。これらのスペクトルの違いは、861、1003と1664センチメートル^-1でローディングスペクトルで観察された。エラスターゼに拡張された露光時間に起因するエラスチン含有繊維で期待される構造変化は、より明確な分離スコアクラスタに反映されたHARTの染色（ 図4）、（図3C）によって示された。

図1：戸建てとの接着線維芽細胞のラマンスペクトルを意味します。

図2（A）のラマンスペクトルと、4つの異なる主要な単離された細胞型（線維芽細胞、MSCは、軟骨細胞とケラチノサイト）の標準偏差を意味します。構造的な違いは^-1 1350センチメートル-フレームは1280のスペクトル領域を強調表示します。戸建（B）の線維芽細胞（BE）の明視野像、（C）MSCは、（D）軟骨細胞および（E）ケラチノサイト。スケールバーは20μmに相当します。付着性（F）の線維芽細胞（FI）明視野像、（G）MSCは、（H）軟骨細胞および（I）ケラチノサイト。スケールバーは200μmに相当します。

図3。lyophiliの正規化せずに（A）のラマンスペクトルZEDエラスチン（青線）、免疫蛍光法（IF）で標識した凍結切片（オレンジライン）とネイティブ大動脈弁尖の中で測定した弾性線維（赤線）。凍結乾燥したエラスチンの高信号強度は蛍光によって引き起こされます。 （B）正規化後のラマンスペクトル全身の障害を排除するため。 （C）スコアおよび非処理コントロール（赤）と酵素的に分解し（青、緑）ネイティブ組織内の弾性線維の間の比較の負荷。

図4。HART's染色ブタの大動脈弁尖。弾性線維は黒で表示されている。 （A）と（B）非処理対照と（C）を示し、（D）30分間エラスチン分解酵素エラスターゼにさらされた組織サンプルを表しています。

cm -1で波数	割り当て12
717から719	CN	リン脂質
785から788	DNA / RNAの塩基、 OPOのバックボーン	DNA / RNA
1003 - 1005	フェニルアラニン	タンパク質
1220-1280	アミドIII	タンパク質
1445-1447	CH 2	タンパク質/脂質
1655-1680	アミドIC = C	タンパク質の脂質

表1。すべての種類の細胞（線維芽細胞、MSCは、軟骨細胞とケラチノサイト）のスペクトル内で検出されたラマンバンド。

Discussion

ラマン分光法は、ネイティブの組織内のin vitroで培養細胞やECMタンパク質など細胞内などの生体試料を分析するのに適したツールです。ここでは^11,15,16、我々は、この非接触では、ラベルフリー技術ができることを実証異なる細胞型の差別ともっぱらこれらの生物学的サンプルの本質的な生体分子の組成に基づいてのECMタンパク質分解の検出。

ラマン分光法の主な利点は、非侵襲的にその結果のラマンスペクトルで、サンプルの生化学的指紋を定量化する能力である。水からのラマン散乱が弱いのと同様の情報が得られる赤外分光法とは対照的に、ラマンスペクトルは、水性試料から収集することができます。さらに、ラマン分光法は、単に単色光の後方散乱の検出に基づいています。したがって、試料処理前に測定をする必要はありません。これらの属性はRaを作る男分光in vivoイメージングアプリケーションの潜在的な有望な代替。それは速く有効になり、我々の実験で利用したのと同じ振動信号に基づいてデータのより敏感なので、この買収に関しては、コヒーレント反ストークスラマン分光（CARS）は非常に興味深い技術です。多誘起蛍光を含む^15,16その他の代替方法と第二高調波発生イメージングが以前に非侵襲的に、または最小限の生体試料を監視するために適していることが実証されている^17。しかし、これらの画像診断法は、非常に高いコストが関連付けられており、自家蛍光を発生する分子に限定されています。さらに、ラマン分光は、従来の光学顕微鏡と組み合わせることは簡単です。これらの特性は、ラマン分光法の生理的環境での生体試料を研究する貴重なツールとなっています。

私たちのラマン分光の現在の制限の一つは、設定高開口数対物レンズ（NA = 1.2）で作成された比較的小さなレーザーフォーカス（250nmで半値全幅（FWHM）の横、700 nmのFWHM軸）。高開口数の高い信号対雑音比で得放出されるラマン光の良い量をカバーすることができますが、高NAは、通常細胞よりもはるかに小さいサンプル内のわずかなコレクションのフォーカスを生成します。異なる細胞のラマンスペクトルを比較するために、代表的なスペクトルのコレクションは、小さな焦点領域で得ることが困難である、が不可欠である。この問題を解決するために、我々は平均して代表的なスペクトルに得たスペクトルで得られた細胞内のさまざまなポイント（=ラマン分光マッピング）において、信号収集を自動化するプロセスに取り組んでいます。さらに、この技術は、細胞内のタンパク質の分布、例えば、特定のラマンバンドの分布の概要を提供します。

Biologicalサンプルは非常に複雑であり、収集されたラマンスペクトルに寄与する生体分子の不均一な混合物で構成されています。したがって、スペクトルパターンは非常に複雑であり、ラマンスペクトル内の分子の単一のタイプの監視は、さまざまな分子信号の重なりで達成することは困難である。さらに、サンプルの本質的な蛍光が弱いラマン信号の貴重な情報をマスクする可能性があります。興味深いことに、私たちの以前の研究のいくつかで、我々は適切な分析ツールを使用して、セルタイプ（MSCおよび線維芽細胞）の間の主な差別化要因としてのラマンスペクトルの蛍光を同定した¹³我々はまた、全体的なラマン信号強度の変化として役立つことができることが確認さ大動脈弁尖のECM内のコラーゲンとコラーゲンの繊維の状態のインジケータ^。9しかし、これらの組織においてエラスチンの状態を分析するとき、我々は同様の結果を検出することができませんでした。結果で述べたようにのセクションでは、我々は唯一のネイティブコントロールと比較した場合、エラスターゼ処理したサンプルでは、​​特定のラマンバンドの変化を検出することができました。我々は予想通り酵素処理したサンプルの全体的なラマン信号の減少を見ませんでした。これらの観察結果は、先行研究に見られるように明確なクラスター形成を明らかにしなかったスコアプロットになりました。これとは対照的に^9は 、酵素処理の影響はPCAの結果内で検出可能であった。我々は2つ​​のECMタンパク質、エラスチンとコラーゲンの間にこれらの不一致が形態の違いや異なる酵素分解プロセスに基づいていることを前提としています。大動脈弁尖の中で、コラーゲンが豊富なゾーン（線維）が原因に緩めになる連続層であるエラスチンは、ゾーンを含むことにより酵素処理は、（ventricularis）エラスターゼ（ 図4）への暴露後に断片化して表示されるネットワーク構成を持っています。単一のスポット測定には、したがって、appropriませんでしたエラスチンのネットワーク内でこのような小さな破裂を検出するために食べました。ここでは、組織のラマンマッピングは、ネットワークの故障を識別するために役立つだろう。

生体試料のラマン分光法の更なる課題は、測定時間を削減することです。解決策の一つは、生物学的サンプルは写真の損傷に影響されません限りに適しているレーザパワーを、増大させることである。私たちの現在の実験のすべては、基礎研究に焦点を当てて証明の原理研究であるが、我々の全体的な目標は、再生医療（組織工学製品の例：品質管理）などの臨床応用のためにラマン分光法を実装することで、事前に移植移植のモニタリングと癌の診断。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
elastase	Worthington Biochemical	LS006363
anti-elastin antibody	Sigma-Aldrich	HPA018111	1:75; citrate buffer
PBS	Lonza Inc.	17-512F
glass bottom dishes	Greiner Bio-One	627860
The Unscrambler	CAMO
Opus	Bruker Corporation