Raman-Spektroskopie ist eine geeignete Technik für die berührungslose, Label-freie Analyse lebender Zellen, Tissue-Engineering-Konstrukten und nativen Geweben. Quellenspezifische spektralen Fingerabdrücke können generiert und analysiert werden mit multivariaten Analyse.
Zerstörungsfreie, berührungslose und Label-freien Technologien zur Zell-und Gewebekulturen zu überwachen sind auf dem Gebiet der biomedizinischen Forschung benötigt werden. 5.1 jedoch derzeit verfügbaren Methoden erfordern Routine Verarbeitungsschritte und die Integrität der Probe verändern. Raman-Spektroskopie ist ein schnelles Verfahren, das die Messung von biologischen Proben ermöglicht, ohne die Notwendigkeit für weitere Verarbeitungsschritte. . Dieser Laser-basierte Technologie erkennt die inelastische Streuung von monochromatischem Licht 6 Wie jede chemische Schwingung zu einem bestimmten Raman-Bande (Wellenzahl in cm -1) zugeordnet ist, verfügt jeder biologischen Probe eines typischen spektralen Muster aufgrund ihrer inhärenten biochemische Zusammensetzung 7. – 9 Im Raman-Spektren, die Peakintensitäten korreliert mit der Menge der vorliegenden molekularen Bindungen. 1 Ähnlichkeiten und Unterschiede der spektralen Datensätze unter Verwendung einer multivariaten Analyse (zB Hauptkomponentenanalyse (PCA)) detektiert werden kann. 10 </sup>
Hier führen wir die Raman-Spektroskopie an lebenden Zellen und nativen Geweben. Die Zellen werden entweder auf Glasboden ausgesät oder in der Schwebe gehalten unter normalen Bedingungen der Zellkultur (37 ° C, 5% CO 2) vor der Messung. Native Gewebe präpariert und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C vorherigen Messungen. Je nach unserer experimentellen Aufbau, wir dann entweder auf dem Zellkern oder extrazellulären Matrix (ECM) Proteine, wie Elastin und Kollagen konzentriert. Bei allen Untersuchungen werden mindestens 30 Zellen oder 30 zufällige Punkte von Interesse innerhalb des ECM gemessen. Daten Bearbeitungsschritte enthalten Hintergrund-Subtraktion und Normalisierung.
Raman-Spektroskopie ist ein geeignetes Instrument, um biologische Proben, wie In-vitro-kultivierten Zellen und ECM-Proteine sowie Zellen in natürlichem Gewebe analysieren. 11,15,16 Hier haben wir gezeigt, dass dieses berührungslose, ermöglicht Label-freien Technik der Unterscheidung verschiedener Zelltypen und der Nachweis von ECM Proteinabbau die ausschließlich auf der biomolekularen Zusammensetzung dieser biologischen Proben.
Der große Vorteil der Raman-Spektroskopie ist die Fähigkeit, nicht invasiv zu quantifizieren die biochemische Fingerabdruck einer Probe durch die entstehende Raman-Spektren. Im Gegensatz zu Infrarot-Spektroskopie, die ähnliche Informationen liefert, können Raman-Spektren von wässrigen Proben gesammelt werden, wie die Raman-Streuung von Wasser ist schwach. Darüber hinaus wird die Raman-Spektroskopie ausschließlich auf dem Nachweis der Rückstreuung von monochromatischem Licht basiert, weshalb keine Probe Verarbeitung wird vor Messung erforderlich ist. Diese Attribute machen RaMann-Spektroskopie eine vielversprechende Alternative für potenzielle In-vivo-Imaging-Applikationen. In dieser Hinsicht ist kohärente Anti-Stokes Raman-Spektroskopie (CARS) eine sehr interessante Technik, da sie schneller und empfindlicher Erfassung von Daten auf den gleichen Schwingungs-Signale in unseren Experimenten verwendeten Basis ermöglicht. 15,16 Andere alternative Methoden, einschließlich Multiphotonen-induzierter Autofluoreszenz und Erzeugung der zweiten Harmonischen Bildgebung wurden zuvor als geeignet erwiesen für die Überwachung der biologischen Proben nicht-oder minimal invasiv. 17 Allerdings sind diese bildgebenden Verfahren sind mit sehr hohen Kosten verbunden und werden an Autofluoreszenz-erzeugenden Moleküle beschränkt. Darüber hinaus ist Raman-Spektrometer leicht mit herkömmlichen optischen Mikroskopen verbinden. Diese Eigenschaften machen die Raman-Spektroskopie ein wertvolles Werkzeug, um biologische Proben in physiologischen Umgebungen zu studieren.
Eines der aktuellen Einschränkungen unserer Raman-Spektroskopie ist eingerichtetDie relativ kleine Laserfokus (250 nm Halbwertsbreite (FWHM) seitliche und 700 nm FWHM axial), die von einer hohen numerischen Apertur Objektiv (NA = 1,2) erzeugt wird. Obwohl eine hohe numerische Apertur ermöglicht, eine gute Menge des emittierten Raman-Licht was in einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu decken, erzeugt die hohe NA nur eine kleine Auswahl Fokus innerhalb der Probe, die typischerweise viel kleiner als eine Zelle. Um Raman-Spektren von verschiedenen Zellen vergleichen zu können, ist die Sammlung von einer repräsentativen Spektrum wesentlich, das ist schwierig, mit einem kleinen Schwerpunkt zu erhalten. Um dieses Problem anzugehen, sind wir auf einem Prozess, um das Signal Sammlung an verschiedenen Stellen innerhalb der Zelle (= Raman-spektroskopische Mapping), was zu einer spektralen Mittelung und Nachgeben gegenüber einem repräsentativen Spektrum automatisieren arbeiten. Darüber hinaus wird diese Technik einen Überblick über die Verteilung der spezifischen Raman-Banden, zum Beispiel des Proteins innerhalb einer Zelle.
Biol.miologische Proben sind sehr komplex und bestehen aus einem heterogenen Gemisch von Biomolekülen, die mit dem gesammelten Ramanspektren wirken. Daher ist die spektrale Muster sehr komplex und die Überwachung eines einzigen Typ eines Moleküls in einem Raman-Spektrum nur schwer mit der Überlagerung verschiedener Signale Molekül zu erreichen. Darüber hinaus kann intrinsische Fluoreszenz der Probe zu maskieren wertvolle Informationen schwächerer Raman-Signale. Interessanterweise wird in einigen unserer früheren Studien haben wir festgestellt, in den Raman-Spektren Autofluoreszenz als wichtigste Unterscheidungsmerkmal zwischen Zelltypen (MSCs und Fibroblasten) mit einem geeigneten Analyse-Tool. 13. Wir auch festgestellt, dass die Veränderung der gesamtwirtschaftlichen Raman-Signalintensität kann als dienen ein Indikator für den Zustand von Kollagen und kollagenen Fasern innerhalb der ECM von Aortenklappensegel. 9 jedoch bei der Analyse des Zustandes von Elastin in diesen Geweben, waren wir nicht in der Lage, ähnliche Ergebnisse zu erkennen. Wie in der Folge genanntens Abschnitt waren wir nur in der Lage, Veränderungen der spezifischen Raman-Banden in den Elastase-behandelten Proben erkennen, wenn auf die nativen Kontrollen verglichen. Wir haben nicht einen Rückgang des gesamten Raman-Signal in den enzymatisch behandelten Proben wie erwartet. Diese Beobachtungen führten zu einem Score-Diagramm, das nicht verraten wollte eine klare Cluster-Bildung wie in der vorherigen Studie beobachtet. 9 Im Gegensatz dazu der Einfluss der enzymatischen Behandlung wurde im Rahmen der PCA Ergebnisse nachweisbar. Wir gehen davon aus, dass diese Diskrepanzen zwischen den beiden ECM-Proteine, Elastin und Kollagen, auf morphologischen Unterschieden und unterschiedlichen enzymatischen Abbauprozessen beruhen: innerhalb der Aortenklappe Flugblatt, ist die Kollagen-reiche Zone (fibrosa) eine durchgehende Schicht, die durch das Lösen wird enzymatische Behandlung, wobei das Elastin enthaltende Zone (ventricularis) eine Netzwerk-Konfiguration, führen nach der Exposition gegenüber Elastase (4) angezeigt wird. Einzel-Messungen vor Ort waren daher nicht entspreaß, solche kleinen Brüche innerhalb der Elastin-Netzwerk zu erkennen. Hier würde ein Raman-Mapping des Gewebes zu helfen, um Netzwerk-Übersicht zu identifizieren.
Eine weitere Herausforderung bei Raman-Spektroskopie von biologischen Proben ist, die Messung zu reduzieren. Eine Lösung ist, die Laserleistung, die geeignet, solange die biologischen Proben nicht durch Photo-Schäden betroffen ist zu erhöhen. Alle unsere aktuellen Experimente sind Proof-of-principle-Studien mit Schwerpunkt auf der Grundlagenforschung, allerdings ist unser übergeordnetes Ziel zu Raman-Spektroskopie für klinische Anwendungen einschließlich der regenerativen Medizin (z. B. Qualitätskontrolle von Tissue-Engineering-Produkten), vor der Transplantation Transplantat Überwachung und Umsetzung Krebsdiagnostik.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei Steffen Koch für seine technische Unterstützung und Shannon Lee Layland (beide Fraunhofer IGB Stuttgart) für seine hilfreichen Anregungen zum Manuskript. Diese Arbeit wurde finanziell von der Attract-Programm der Fraunhofer-Gesellschaft und des BMBF (beide KS-L.) Unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
elastase | Worthington | LS006363 | |
anti-elastin antibody | Sigma | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
PBS | Lonza | 17-512F | |
glass bottom dishes | Greiner BioOne | 627860 | |
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