Summary
미생물 eukaryotes 모두 영구 얼음으로 덮인 남극 호수에서 photosynthetically 파생 카본과 최고의 육식 종의 원천입니다. 이 보고서는 남극 호수, 호수 Bonney에서 metabolically 다양한 미생물의 eukaryotes를 분리하기 위해 농축 문화 접근법을 설명하고 Ribulose-1 ,5-bisphophate carboxylase의 oxygenase (RubisCO) 활동을 위해 방사성 동위 원소 분석을 사용하여 무기 탄소 고정 가능성을 평가합니다.
Abstract
호수 Bonney는 남극, 맥머도 드라이 계곡에 위치한 다수의 영구 얼음으로 덮인 호수 중 하나입니다. 다년생 얼음 커버는 화학적으로 층상 수주를 유지하고 물을 다른 내륙 기관과는 달리 주로 탄소와 스트림로부터 영양소의 외부 입력을 방지합니다. Biota는 겨울 한 동안 연중 심각한 영양 결핍, 낮은 온도, 극단적인 그늘, hypersalinity, 그리고 24 시간 어둠 등 다양한 환경적 스트레스에 노출됩니다. 이러한 극단적인 환경 조건이 미생물 2로 거의 대부분 호수 Bonney에 biota을 제한하고 있습니다.
단세포 미생물의 eukaryotes은 ( "protists")는 세계 biogeochemical 자전거 3의 중요한 선수이며, 수산물 식품 웹의 기본 및 차 역할을 모두 점령, 마른 계곡 호수에있는 탄소 사이클에서 중요한 생태적 역할을 재생합니다. 내가 문제를 해결 마른 계곡 수산물 식품 웹, protists에서norganic 탄소 (autotrophy)는 organotrophic 생물 유기 탄소 4, 2의 주요 생산자이다. Phagotrophic이나 박테리아와 작은 protists를 복용시킬 heterotrophic protists는 식품 웹에서 5의 최고 포식자 역할을합니다. 마지막으로, protist 인구의 알려지지 않은 비율이 결합된 mixotrophic 신진 대사 6, 7이 가능합니다. protists의 Mixotrophy가 육식 동물의 미생물의 phagotrophic 섭취와 함께 광합성 능력을 결합하는 능력을 포함한다. mixotrophy의이 양식은 일반적으로 이해 해산 탄소 분자를 포함 세균 종의 mixotrophic 대사, 다릅니다. 가 거의 protist의 분리는 영구 얼음 덮인 극지방 호수에서 현재,이 극한 환경에서 protist의 다양성과 생태 연구는 제한된 8, 4, 9, 10, 5되었습니다. 간단한 마른 계곡 호수 식품 웹에서 protist 대사 다양성의 더 나은 이해를 위해 R 모델의 개발에 도움이됩니다글로벌 탄소주기의 protists의 OLE.
우리는 호수 Bonney에서 잠재적으로 phototrophic 및 mixotrophic protists 격리시킬 농축 문화 방식을 채용. 물 열에 샘플링 깊이는 일차 생산 맥시멈 및 protist phylogenetic 다양성 4, 11의 위치뿐만 아니라 protist의 영양 모드에 영향을 미치는 주요 비생물적 요인의 다양성을 바탕으로 선정되었습니다 : 얕은 샘플링 깊이는 주요 영양소에 대한 제한됩니다 동안 깊이 샘플링 깊이 빛의 유무에 의해 제한됩니다. 또한, 호수 샘플은 phototrophic 생물의 다양한 성장을 촉진하는 성장 미디어의 여러 유형으로 보충했다.
RubisCO는 캘빈 벤슨 Bassham (CBB) 사이클, autotrophic 생물은 무기 탄소를 수정하고 수생 및 지상파 식품 거미줄 12 높은 영양 수준을위한 유기 탄소를 제공하는 주요 통로에 올라서 제한 속도를 catalyzes. 본 연구에서는 우e는 호수 Bonney 농축 문화의 탄소 고정 잠재력과 신진 대사 다양성에 대한 프록시로 최대 carboxylase 활동을 모니터링하기 위해 필터 샘플을 13으로 바뀌었 방사성 동위 원소 분석을 적용.
Protocol
1. 샘플 수집
- 선택하고 물에 열을 샘플링하기 전에 언젠가는 샘플링 사이트를 준비합니다. 이것은 물의 열의 층상 레이어 드릴링과 아이스 홀 용해에 의한 교란 후 개혁 수 있습니다. GPS에 의해 드릴 사이트의 위치를 파악합니다.
- 물에 열을 액세스하려면 4 인치 순간 항공편 확장과 절단 비트에 부착된 순간 얼음 송곳으로 얼음을 뚫고 구멍을 뚫는하여 시작합니다. 구멍의 드릴의 동결을 방지하기 위해 물을 칼럼의 맨 위에 시추 약 4~6인치을 중단하여 액체 물에 드릴링을 방지하려고합니다.
- 드릴 구멍은 이전 샘플링에 15~60센티미터의 직경으로 확대해야합니다. 이것은 구리 파이프를 통해 온수 폴리에틸렌 글리콜을 순환 구멍 melter (벗고 다니는 모델)을 사용하여 수행됩니다. 홀 용해는 일반적으로 18시간까지 걸립니다.
- 이전 물이 열을 샘플링에,되도록 모든 필요한 장비와 샘플 일orage 혈관이 샘플링 현장에서 조립한다. 샘플링 자료는 다음과 같습니다 Niskin 병 (5-10 패 용량), 깊이-보정 케이블 윈치, 메신저, 각 샘플링 깊이에 대한 충분한 샘플 병 및 샘플 전송 쿨러합니다.
- 호수 물 필터링 샘플링 당일 완료되어야으로 이른 시간에 (~ 5시)의 샘플링 시작합니다. 보정에 부착된 Niskin 샘플러를 사용 (6 미터, 15 미터, 얼음 구멍 piezometric 수위에서 측정한 18 미터 샘플링 깊이, 본 연구의 경우) 원하는 깊이에서 물을 샘플 (1-5 패)를 수집 핸드 윈치. 물 열의 교란을 방지하기 위해서는 더 깊은 것들 전에 얕은 깊이를 수집합니다.
- 스토어 호수 샘플 쿨러 및 샘플 사이트에서 ATV (모든 지형 차량)에 붙어 썰매를 사용하여 필드 실험실로 운반 인치 현장 실습 후 즉시 샘플링시 : 샘플 처리 또는 (액체 질소의 플래시 프리즈 예)를 안정화되어야한다.
2. Developme농축 문화 NT
- 농축 문화 재배의 경우 부드러운 여과를 (<0.3 ATM)를 사용하여 47mm 0.45 μm의 기공 크기 polyethersulfone 필터에 호수의 물이 0.5-1 L을 집중해라. 자연 지역 사회의 다양성을 원하는 경우, 47mm 0.45 μm의 기공 크기 polyethersulfone 필터에 두 번째 샘플을 필터링하고 4. 진핵세포 생물 phylogenetic 다양성에 대한 Bielewicz 외에 따라 프로토콜을 따릅니다.
- 필터와 같은 샘플링 깊이에서 수집한 필터링 호수의 물이 ~ 20 ML을 포함하는 50 ML 멸균 팔콘 튜브 필터를 전송합니다. 부드럽게 멸균 피펫을 사용하여 필터에서 세포를 씻는다.
- 25cm이 무균 세포 배양 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 45 ML로 문화 볼륨을 높이기 위해 각 시료 농도에서 수집한 필터링 호수를 추가합니다. 다른 문화 미디어 enrichments이 원하는 경우 여러 각 샘플링 깊이에 대한 복제 설정합니다.
- 50X의와 문화 flasks을 보완볼드의 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 매체, BG11 및 F / 2 : 다음의 문화 미디어 1X의 최종 농도로 terile 솔루션. mixotrophic 생물 배양은 세트 최대 두 F/2-supplemented 혈관 필요하며 flasks 중 하나에 무균 쌀로부터 2-3 알갱이를 추가하는 경우.
- 귀하의 미국 연구소에 출하하기 전에 남극의 최소 4 주 동안 온도 제어 성장 배양기에서 저온 (4 ℃)과 낮은 방사 (20 μmol m -2 광자들 -1)에서 문화 flasks을 품어. 2 주간 배양 후 적절한 성장 미디어를 포함하는 한천 플레이트에 농축 문화의 분리가 필요한 경우, 접시에 250 μL.
- 미국, 멸균 50 ML 팔콘 튜브로 전송 농축 문화에 발송하십시오. 의 요청 선적 조건은 "동결 안"및 요청을 출하에 "쿨하게." 남극 대륙의 운송 과정이 비교적 빠르고 (이주 상업용 비행기로)과 신뢰성이 높은 반면, 까다로운 장기 손실의 가능성이 있습니다전송 과정에서 isms. 따라서 수사 당국은 운송 과정에서 특정 종류의 손실이 평가 수 있도록 선적하기 전에 subsample을 유지하는 것이 좋습니다.
- 미국에 도착 후, 125-ML 멸균 Erlenmeyer 플라스크에 적절한 성장 미디어 45 ML로 농축 문화의 양도 5 ML은 멸균 스폰지로 공을. 농축 문화는 4의 제어 환경의 성장 챔버 (낮의 성장 회의소, VWR) ° C/20 μmol m -2 광자의 -1 온도에서 문화를 서로 유지되어야합니다. 문화는 신선한 언론 매 30 일 이내에 양도해야한다.
3. 필터링 Enrichments에서 세포 Lysate 추출
- 부드러운 진공 (<10 PSI)를 사용하여 25mm 워트 먼지 GF / F 필터쪽으로 농축 문화의 필터 5 ML. 필터는 -80에서 몇 주 동안 저장될 수 있습니다 ° C에서 사전 RubisCO 활동을 시금 있습니다.
- 멸균 스틸 가위로 4-5 섹션으로 필터를 잘라전송이 ML 스크류 캡 튜브로 멸균 포셉있는 조각 0.1 밀리미터 직경 지르코니아 / 실리카 구슬로 가득 방법 중 하나 오분 가득.
- 10 MM NaHCO 3, 10 밀리미터 DTT, aminocaproic 3.3 MM : 신선한 추가, 필터 추출 버퍼의 1.25 ML을 (50 밀리미터 bicine, 10 밀리미터 MgCl 2, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 밀리그램 / ML BSA 및 0.1 % 트리톤 X-100 추가 산 0.7 밀리미터 benzamidine, 산도 7.8) 13과 속도 설정 48에서 30를 위해 Minibead 때리는 세 번 사용하여 세포를 방해. 1 분 얼음 보육과 샘플의 난방, 대체 beadbeating을 방지합니다.
- GF / F 필터 섬유와 세포 벽의 잔해의 느슨한 펠렛을 형성 4 ° C에서 3,000 XG에서 2 분 동안 필터 슬러리를 원심 분리기.
- 얼음처럼 차가운 90 % 아세톤 800 μL에 200 μL 나누어지는하고 잠그다를 제거합니다. 추출물 엽록소를 측정 (chl) 664 nm의 및 647 nm의 14 파장 값에서 분광 광도계에서. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- remaini을 원심 분리기4 번 NG 뜨는 °이 15,000 XG의 분 및 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 (불용성 세포 세포막의 펠렛 및 남은 GF / F 필터 섬유를 방지) 뜨는을 전송을위한 C #. 이 수용성 세포 lysate 이제 RubisCO의 carboxylase 활동 분석에 사용될 수 있습니다.
- Lysate는 -80 ° C에서 액체 질소에서 12.5 %의 글리세롤과 플래시 동결 외에 후 저장할 수 있습니다. 활동의 손실이 lysate에서 효소의 감도에 따라 여러 동결 / 해동 사이클 이후에 발생할 수 있습니다. 따라서 신선한 대 냉동 lysate의 활동은 대규모 세포 lysate extractions하기 전에 테스트해야합니다.
4. RubisCO Carboxylase 활동 필터 분석
- 빙판에 차게되어 15 ML 스크류 캡 microcentrifuge 튜브 (필요하지 캡)에 용해 lysate 125 μL를 전송합니다. 부정적인 컨트롤 샘플의 경우 15 ML 스크류 캡 microcentrifuge 튜브에 125 μL 용해 lysate를 추가하지만, (4.7 단계)을 기판을 추가하지 마십시오. 실행모든 샘플과 부정적인 컨트롤에 대한 반응을 중복.
- 10 신선한 분석 버퍼의 ML (50 MM Bicine-NaOH, 산도 8.0, 50 MM NaHCO 3, 25 밀리미터 MgCl 2) 얼음의 냉기를 준비합니다. 충분히 5 ML 관으로 샘플과 부정적인 컨트롤 (샘플 / 제어 플러스 100 μL 추가 당 100 μL)의 모든 분석 버퍼 나누어지는. 연기 후드 모든 후속 단계를 수행합니다.
- 14 CO 3 (500 μCi / ML) 당 ML aliquoted 버퍼에 대한 분석 버퍼의 아니 40 μL를 추가하고 얼음에 버퍼를 유지.
- 14 C를 포함하는 분석 완충액 10 μL를 제거하고 분석 완충액 1 ML에 희석. 섞어 반전 후, 섬광 유리병에 칵테일 계산 바이오 안전 II의 섬광 3 ML에 1:100 희석 혼합물의 100 μL를 추가합니다. 믹스하는 반전. 섬광 카운트 (Beckman LS6500)는 분석과 함께 계속하기 전에 18,000 노출당 비용 (CPM) 이상이어야합니다.
- 정도 아니 14 CO 3 검정 버퍼에 추가되었습니다 때,3-5 분 25 ° C와 부화 미리 건조한 목욕탕에 반응 튜브를 이동합니다.
- lysates에 100 μL 분석 버퍼를 추가하고 25 살에 5 분 동안 품어 ° C.
- 샘플로 15 밀리미터 Ribulose의 bisphosphate 20 μL를 추가하고 반응이 25에서 5-10 분 동안 진행하도록 ° C.
- 반응을 중지하여 100 μL 프로피 온산 (100 %) (피셔)를 추가합니다. 비법인 14 C를 소진 2,000 XG에서 1 시간 동안 원심
- 3 ML 바이오 안전 II의 섬광 계수 칵테일을 포함하는 섬광 유리병에 시료의 전체 볼륨을 전송합니다. 섬광 계수 (B. Witte, R. Tabita 개인 통신)에 의해 산성 안정적인 최종 제품의 CPM를 결정합니다.
- chl적으로 14 RubisCO 활동 률을 계산합니다.
5. 대표 결과
우리는 추위에 적응 phototrophic과 남극 L에 거주 mixotrophic protists을 분리 농축 culturing를 활용안으로 Bonney. 볼드의 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 (BBM) 15 F/2-Si 마린 중간 16, 17 BG11 중간 18 : 생물의 큰 다양성을 캡처하려면, 세 성장 미디어 유형을 테스트했습니다. 가벼운 현미경에 의한 농축 문화 영상 검사는 문화가 phototrophic의 protists (대부분의 세포에 엽록소 안료의 존재로 표시)에 의해 주도되고 있다고 발표하고 inoculum이 수행된있는 샘플링 깊이에 따라 세포 morphologies의 다양성과를 숨겨 문화에서 사용되는 미디어의 종류 (그림 1).
우리는 탄소 고정 가능성에 대한 프록시로서 효소에 의해 촉매 RubisCO carboxylase 활동의 최대 속도를 측정했습니다. Chl 풍요로움도 phototrophic의 protist의 바이오 매스 추정 (그림 2)로 모니터링했습니다. 같은 온도 / 라이트 정권 (ie. 4 ° C/20 μmol m -2들 -1), 탄소 고정 가능성 하에서 모든 문화권의 재배에도 불구하고그리고 phototrophic의 바이오 매스는 농축 문화 사이에 극적으로 변화. 문화가 4 전시 F / 2 성장 매체 (Enrichments 19, 21, 23)에 풍부하게하면서 최대 RubisCO 활동, BBM (Enrichments 4 및 6) 또는 BG11 (Enrichments 13 14) 성장 매체 중 하나에서 재배 농축 문화권에서 관찰되었다 - 34 배 낮은 최대 carboxylase 활동. carboxylase 활동 Chl 기초 표현 과정에서 이러한 차이는, F / 2 개 문화권의 낮은 바이오 매스 수준으로 인해 아니었다. 또한, RubisCO 활동 chl 농도 (., 그림 2, 삽입된 페이지 R = -0.023, P> 0.1)와 연관되지 않았다. 다른 모든 문화에 관계없이 RubisCO 효소 활동 (그림 2) 상대적으로 낮은 chl을 전시하면서 6m 15 M (Enrichments 4 및 5)에서 호수로 주사 BBM 문화는 최고의 chl 수준했다.
1 그림.대표 미생물의 진핵세포 생물 농축 다른 생물의 성장을 위해 선택한 문화. 문화의 정체성은 패널의 왼쪽 하단에 있습니다. 모든 이미지는 1000X 확대 기름 침지를 사용하여 생성된 빛이 micrographs를 나타냅니다.
그림 2. 잠재적인 탄소 고정 용량 및 추출물 엽록소 호수 Bonney 격리 및 각종 문화 매체에 성장 남극 미생물의 진핵세포 생물 농축 문화의 수준. 문화 자세한 내용은 표 1을 참고 삽입된 페이지 :. 엽록소 사이의 피어슨 상관 관계 남극 미생물의 진핵세포 생물 농축 문화의 풍요로움과 탄소 고정 가능성을.
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Discussion
최근 분자 연구 환경 3, 19, 20의 범위에 걸쳐 단세포 eukaryotes의 높은 다양성을 보고된 바 있으나, protist의 서식지의 전체 범위에 걸쳐 분리의 부족으로 이러한 개인 종의 기능적 역할은 식품 거미줄에 주로있다 알 수없는. 본 연구에서 우리는 상대적으로 undersampled 환경, 영구 얼음으로 덮인 남극 호수에서 대사 다양성을 전시 미생물 진핵세포 생물 종에 대해 풍부하게하는 방법을 설명했습니다. 호수 Bonney의 다른 샘플링 깊이에서 풍부한 문화의 성장 중간 의존했고 차동 탄소 고정 속도를 전시. 예를 들어, BBM 또는 BG 11 성장 미디어 비해 F / 2에 풍부한 문화의 낮은 탄소 고정의 잠재적 가능성이 protist의 다양성과 신진 대사 능력의 차이를 반영합니다. BBM 성장 매체는 녹색 algal 종 (또는 chlorophytes)에 대한 선택과 우리의 문화는 (그림 녹색 algal 종 monoculture 것으로 나타1A, B). 이러한 생물은 대체로 photoautotrophy에 의존하는 것으로 알려져 있습니다. 하나는 유일한 에너지원 하나 같이 가벼운 대한 엄격한 요구 사항을 가진 호수 Bonney 전시 순수 photoautotrophic 대사로부터 분리. 반대로, F / 2 성장 매체는 잠재적 mixotrophic 생물 12을 포함한 해양 protists, 광범위한 풍부하게하기 위해 설계되었습니다. 우리가 완전히 F / 2 문화의 다양성을 탐구하지 않았지만, 이러한 enrichments의 미세한 전망은 분명히 다양한 세포 morphologies의 protists의 컨소시엄 (그림 1C, D)를 보여줍니다. 따라서, F / 2 문화의 RubisCO 활동은 대체 탄소 / 에너지 수집 모드의 활용으로 인해 될 수 감소. 이러한 예측의 지원에 photoautotrophic 남극 분리의 순수 문화는 남극 그 전시 mixotrophy (Dolhi & 모건에 키스, 게시되지 않은 결과를) 분리에 비해 훨씬 높은 최대 RubisCO의 carboxylase 속도를 나타냅니다. heterotrophic enz의 추가 연구이러한 샘플에 yme 활동이 완전히 protist 농축 문화 대사 다양성을 특성화하는 데 도움이 우리의 연구실에서 현재 진행되고있는 것이다. 또한, 본 논문에서 설명하는 생리적 데이터는 phylogenetic과 지구 Microbiome 프로젝트라는 전세계 미생물 커뮤니티를 특성화하기 위해 대규모 시퀀싱 노력의 일환으로 metagenomic 시퀀스 정보 (구비됩니다 http://www.earthmicrobiome.org/~~V ) .
이 보고서에 설명된 수정 필터는 분석도 필터링된 호수 시료에서 추출한 세포 lysate에 적용할 수 있습니다. 그러나,이 분석의 새로운 애플 리케이션을 위해 최적의 lysate 볼륨이 세 가지 다른 볼륨을 시금 적어도 3-4 배 부정적인 컨트롤 위에 CPM 듭니다 것을 이용하여 결정되어야합니다. heterotrophic activi의 효소 분석과 함께 탄소 고정 가능성 분석천연 protist 커뮤니티의 타이 protist 영양 능력 및 수생 환경에서 탄소 순환의 역할에 대한 자세한보기를 제공합니다. 현재 호수 Bonney 및 기타 남극 호수에서 protist 대사 다양성에 비생물적 환경 요인의 역할을 이해하기 위해이 방법을 적용하고 있습니다. RubisCO의 carboxylase 필터 분석 방법은 소규모 농축 문화뿐만 아니라, 전체 호수의 시스템에 잠재적인 탄소 고정 및 신진 대사 다양성을 연구하기위한 귀중한 도구가 될 것입니다.
재배 독립 분자 도구의 개발 이전 protists은 전통적으로 재배에 의해 식별되었고 taxonomically 자신의 세포 형태학을 기반으로 분류. 따라서, 농축 및 서식지 다양한에 거주 protists의 고립의 오랜 역사가있다. 특히 초기 수사 자세한 taxonomic 식별 (: 21, 22에서 검토)에 대한 역사적으로 가치가있다. 동안 protists의 분리농축 기반의 접근법을 사용하면 남극 바닷물의 농축에서 여러 해양 protist의 분리가 23-26 사용할 수 남극 담수 환경에서 비교적 드뭅니다. 또한, 여러 문화 컬렉션 protist 및 microalgal 분리 (Provasoli-Guillard 문화 수령 예 용을 다하고 있습니다 https://ncma.bigelow.org/~~V ). 신뢰할 수있는 싸구려 시퀀싱 기술은 미개 protistan 시퀀스의 거대한 유전자 데이터베이스를 제작했습니다. 이러한 데이터베이스는 미생물이 중요한 그룹의 다양성과 분포에 관한 매우 유익한어야하지만, protist의 생태 및 생리학에 대한 우리의 이해와 시퀀스 데이터 연결의 확대 차이가있다. 따라서 특히 이러한 극지 해양 서식지와 같은 undersampled 환경에서 전통적인 재배 기법, 중요성과 생태 역할을 이해 향해 중요한 역할을 계속글로벌 geochemical 사이클링의 protists니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
저자 J. Priscu, A. Chiuchiolo과 수집 및 남극의 샘플의 보존에 도움을 맥머도 LTER 호소학 팀 감사합니다. 우리는 병참 지원을 Ratheon 폴라 서비스 및 PHI 헬기를 감사드립니다. 가벼운 micrographs는 고급 현미경 및 이미징 센터 마이애미의 센터에서 발생했다. 이 작품은 폴라 프로그램 보조금 0,631,659 및 1,056,396의 NSF 사무실에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBM | Sigma-Aldrich | B5282 | |
| BG11 | Sigma-Aldrich | C3061 | |
| F/2 | Sigma-Aldrich | G9903 | |
| GF/F filter, 25 mm | Fisher Scientific | 09-874-64 | |
| GF/F filter, 47 mm | Fisher Scientific | 09-874-71 | |
| Polyethersulfone filter, 0.45 μm pore, 47 mm | Pall Corporation | 61854 | |
| Sterile cell culture flask, 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Diurnal growth chamber | VWR international | 35960-076 | |
| Zirconia/silica beads, 0.1 mm diamter | Biospec Products | 11079101z | |
| Mini-Bead beater | Biospec Products | 3110BX | |
| Screw-cap microcentrifuge tube (1.5 μL) | USA Scientific, Inc. | 1415-8700 | |
| NaH14CO3 | ViTrax | VC 194 | Keep in aliquots of 400 μL at -20°C |
| RuBP | Sigma-Aldrich | R0878-100mg | Dissolve in 10 mM Tris-propionic acid (pH 6.5) |
References
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