Summary
Eucarioti microbiche sono sia una fonte di carbonio fotosinteticamente derivato e le prime specie di predatori in modo permanente coperti di ghiaccio dei laghi antartici. Questo rapporto descrive un approccio coltura di arricchimento per isolare metabolicamente eucarioti microbici versatili dal lago antartico, Bonney Lake, e valuta il potenziale fissazione del carbonio inorganico mediante un saggio di radioisotopi per la ribulosio-1 ,5-bisphophate carbossilasi ossigenasi (RuBisCo) attività.
Abstract
Bonney Lake è uno dei numerosi permanente coperti di ghiaccio laghi situati nelle McMurdo Dry Valleys, Antartide. La copertura di ghiaccio perenne mantiene una colonna d'acqua stratificata chimicamente e, a differenza di altri organi interni d'acqua, impedisce in gran parte input esterno di carbonio e sostanze nutritive dai flussi. Biota sono esposti a numerosi stress ambientali, tra cui tutto l'anno grave carenza di nutrienti, basse temperature, ombra estrema, hypersalinity, e 24 ore buio durante l'inverno 1. Queste condizioni ambientali estreme limitare il biota in Bonney Lake quasi esclusivamente ai microrganismi 2.
Unicellulari eucarioti microbica (chiamati "protisti") sono attori importanti cicli biogeochimici globali 3 e svolgono importanti ruoli ecologici del ciclo del carbonio nei laghi asciutti valle, occupando entrambi i ruoli primari e terziario nella catena alimentare acquatica. Nelle secche alimentari valle acquatici web, protisti, che fissano inorganic carbonio (autotrophy) sono i maggiori produttori di carbonio organico per gli organismi organotrophic 4, 2. Phagotrophic o protisti eterotrofi capaci di ingerire batteri e piccoli protisti agire come i predatori al vertice della rete alimentare 5. Infine, una percentuale sconosciuta della popolazione protista è in grado di combinata metabolismo mixotrophic 6, 7. Mixotrophy in protisti implica la capacità di combinare la capacità fotosintetica con l'ingestione di microrganismi phagotrophic preda. Questa forma di mixotrophy differisce dal metabolismo mixotrophic in specie batteriche, che in genere comporta l'assorbimento di molecole di carbonio disciolto. Ci sono attualmente isolati protisti poche in posti di ghiaccio-capped laghi polari, e gli studi della diversità protista ed ecologia in questo ambiente estremo sono stati limitati 8, 4, 9, 10, 5. Una migliore comprensione di protista versatilità metabolica nel semplice cibo secco web Valle del Lago sarà di aiuto nello sviluppo di modelli per la role di protisti nel ciclo globale del carbonio.
Abbiamo utilizzato un approccio coltura di arricchimento per isolare protisti potenzialmente fototrofi mixotrophic e dal Lago di Bonney. Profondità di campionamento nella colonna d'acqua sono stati scelti in base alla localizzazione della produzione primaria e massimi protista diversità filogenetica 4, 11, nonché alla variabilità nelle principali fattori abiotici che influenzano le modalità trofiche protisti: profondità di campionamento basse sono limitati per i nutrienti più importanti, mentre più profonde profondità di campionamento sono limitati dalla disponibilità luce. Inoltre, campioni di acqua lago sono stati integrati con diversi tipi di supporto di crescita per promuovere la crescita di una varietà di organismi fototrofi.
RuBisCo catalizza il fattore limitante nella Benson Calvin Bassham (CBB) il ciclo, la via principale attraverso il quale gli organismi autotrofi fissare il carbonio inorganico in carbonio organico e di fornire per i livelli trofici superiori nelle reti trofiche acquatiche e terrestri 12. In questo studio, we applicato un saggio di radioisotopo modificato per campioni filtrati da 13 a monitorare massima attività carbossilasi come proxy per il potenziale fissazione del carbonio e la versatilità metabolica nelle colture di arricchimento Bonney Lake.
Protocol
1. Esempio di acquisizione
- Scegli e prepara il sito di campionamento un giorno prima campionamento della colonna d'acqua. Ciò consentirà alle stratificazioni della colonna d'acqua di riformare dopo disturbo a causa di perforazione e ghiaccio foro di fusione. Identificare la posizione del sito di perforazione attraverso GPS.
- Per accedere alla colonna d'acqua, iniziare praticando un foro attraverso il ghiaccio con una coclea ghiaccio Jiffy attaccato ad una da 4 pollici di estensione Jiffy po 'di volo e di taglio. Per evitare il congelamento del trapano nel foro, cercare di evitare di perforazione in acqua liquida interrompendo perforazione di circa 4-6 cm sopra la parte superiore della colonna d'acqua.
- Il foro dovrà essere allargato da un diametro di 15 a 60 cm prima del prelievo. Ciò si ottiene mediante l'uso di un fusore foro (Modello Hotsy) che circola polietilene glicole riscaldata attraverso un tubo di rame. Hole di fusione richiede in genere fino a 18 ore.
- Prima di campionamento della colonna d'acqua, in modo che tutte le attrezzature necessarie e st campioneorage vasi sono assemblati presso il sito di campionamento. Materiali di campionamento sono: bottiglia Niskin (capacità L 5-10), Winch con profondità calibrata cavo, Messenger, bottiglie di un campione sufficiente per ogni profondità di campionamento e scambiatori di calore per il trasporto del campione.
- Inizia campionamento nelle prime ore del giorno (~ 5 del mattino), il filtraggio delle acque del lago dovrebbe essere completata il giorno del prelievo. Raccogliere campioni di acqua (1-5 L) dalla profondità desiderata (per questo studio: 6-m, 15 me 18 m profondità di campionamento, misurata dal livello dell'acqua piezometrico nel buco del ghiaccio) utilizzando un campionatore Niskin collegata a un calibrato argano a mano. Per evitare disturbi della colonna d'acqua raccolgono basse profondità prima di quelli più profondi.
- Conservare i campioni di lago in dispositivi di raffreddamento e dei trasporti dal sito del campione al laboratorio campo utilizzando una slitta attaccato ad un ATV (All Terrain Vehicle). I campioni devono essere trattati o stabilizzati (ad es: freeze flash in azoto liquido) presso il laboratorio di campionamento campo immediatamente successivo.
2. SVILUPPOnt di colture di arricchimento
- Per la coltivazione di colture di arricchimento, concentrato 0,5-1 litri di acqua del lago sul 47 mm a 0,45 micron filtri dalle dimensioni dei pori polietersolfone con filtrazione leggera (<0,3 atm). Se la diversità della comunità naturale si desidera, filtrare un secondo campione su 47 mm 0,45 filtri dimensioni dei pori um polietersolfone e seguire protocolli secondo Bielewicz et al. 4 per diversità filogenetica eucariote.
- Trasferire filtro 50 provetta sterile falcon mL contenente ~ 20 mL di acqua filtrata lago raccolti dalla profondità di campionamento stesso filtro. Lavare delicatamente le cellule dal filtro con una pipetta sterile.
- Trasferire sospensione cellulare in un centimetro 25 2 beuta sterile coltura cellulare. Aggiungere l'acqua filtrata lago raccolto da ciascun campione profondità per aumentare il volume di cultura a 45 mL. Impostare replica multipli per ogni profondità di campionamento se arricchimenti su diversi terreni di coltura si desiderano.
- Supplemento palloni di coltura con 50X sterile soluzioni ad una concentrazione finale di 1X dei seguenti terreni di coltura: Medio Bold Basal, il BG11 e F / 2. Se la coltura di organismi mixotrophic è richiesto, set-up due navi F/2-supplemented e aggiungere 2-3 grani di riso sterile a uno dei fiaschi.
- Incubare fiasche di coltura a bassa temperatura (4 ° C) e basso irraggiamento (20 fotoni micromoli m -2 s -1) a temperatura controllata crescita incubatore per almeno 4 settimane in Antartide prima della spedizione al laboratorio degli Stati Uniti. Se si desiderano isolati, piatto 250 microlitri della coltura di arricchimento su piastre di agar contenenti terreni di coltura appropriati dopo 2 settimane di incubazione.
- Per la spedizione verso gli Stati Uniti, colture di arricchimento di trasferimento a sterili da 50 mL tubi falcon. Richiesta di spedizione requisito "non congelare" e "mantenere la calma" su spedizione richiesta. Mentre il processo di spedizione dall'Antartide è relativamente veloce (2 settimane aereo commerciale) e altamente affidabile, vi è la possibilità di perdita di dell'organo fastidiosoismi durante il processo di trasporto. Così, gli investigatori potrebbero voler mantenere un sottocampione prima della spedizione in modo che la perdita di alcune specie durante il processo di spedizione può essere valutata.
- Al suo arrivo negli Stati Uniti, il trasferimento 5 ml di coltura di arricchimento in 45 ml di terreni di crescita appropriati in un 125 mL beuta sterile ricoperto con una spugna sterile. Colture di arricchimento devono essere mantenute in piedi le culture in una camera di crescita a temperatura controllata ambientale (camera di crescita Diurno, VWR) a 4 ° C/20 fotoni micromoli m -2 s -1. Le colture dovrebbero essere trasferiti in mezzi freschi ogni 30 giorni.
3. Cella Estrazione del lisato da arricchimenti filtrati
- Filter 5 ml di coltura di arricchimento su un 25 mm Whatman GF / F filtro utilizzando vuoto dolce (<10 psi). Il filtro può essere conservato per diverse settimane a -80 ° C prima di essere analizzati attività RuBisCo.
- Tagliare il filtro in sezioni 4-5 con le forbici in acciaio sterili etrasferire i pezzi con pinza sterile ad un tubo 2 tappo a vite mL riempito un quinto del modo pieno, con 0,1 mm di diametro in ossido di zirconio / silice perline.
- Aggiungere 1,25 ml di tampone di estrazione filtro (50 bicina mM, 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, e 0,1% Triton X-100; aggiungere fresco: 10 mM NaHCO 3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminocaproico acido, 0,7 benzammidina mM, pH 7.8) 13 e distruggere le cellule utilizzando un battitore Minibead tre volte per 30 secondi su regolazione della velocità 48. Per evitare il riscaldamento del campione, beadbeating alternano con 1 min di incubazione su ghiaccio.
- Centrifugare slurry filtro per 2 min a 3000 xga 4 ° C per formare un pellet sciolto di GF / F fibre del filtro e della parete detriti cellulari.
- Rimuovere a 200 microlitri un'aliquota e immergerli in 800 microlitri di ghiacciata acetone 90%. Misurare clorofilla estraibile (CHL) in uno spettrofotometro a valori di lunghezza d'onda di 664 nm e 647 nm 14. Trasferire il supernatante in una provetta 1,5 ml.
- Centrifugare remaining surnatante a 4 ° C per 2 min a 15.000 xg e trasferire il supernatante (evitare il pellet insolubili di membrane cellulari e rimanenti GF / F fibre del filtro) ad una provetta pulita 1,5 mL microcentrifuga. Questo lisato cellulare solubile può ora essere usato nel saggio di attività carbossilasi Rubisco.
- Lisato può essere conservato a -80 ° C dopo l'aggiunta di 12,5% glicerolo e congelamento flash in azoto liquido. Una perdita di attività può verificarsi dopo diversi cicli gelo / disgelo a seconda della sensibilità degli enzimi del lisato. Pertanto, l'attività di lisato fresco rispetto congelato dovrebbe essere testato prima su larga scala delle cellule estrazioni lisato.
4. RuBisCo carbossilasi Activity Assay Filter
- Trasferire 125 pl di lisato solubile in una provetta da microcentrifuga tappo a vite 15 mL (tappo non necessario) che è stata raffreddata su ghiaccio. Per i campioni di controllo negativi, aggiungere 125 microlitri lisato solubile a 15 provetta da microcentrifuga tappo a vite mL, ma non aggiungere substrato (nel passo 4.7). Correreduplicato reazioni per tutti i campioni ei controlli negativi.
- Preparare 10 mL di tampone fresco (50 mM bicina-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO 3, 25 mM MgCl 2) e congelati su ghiaccio. Aliquotare abbastanza del tampone di saggio per tutti i campioni e dei controlli negativi (100 pl per campione / controllo supplementare più 100 mL) a un tubo 5 ml. Eseguire tutti i passaggi successivi sotto una cappa aspirante.
- Aggiungere 40 microlitri NaH 14 CO 3 (500 uCi / mL) per mL di tampone al buffer aliquotate e mantenere il buffer su ghiaccio.
- Rimuovere 10 L del tampone di saggio contenente 14 C e diluirlo in 1 ml di tampone. Dopo l'inversione di mescolare, aggiungere 100 microlitri della miscela diluita 1:100 a 3 ml di Bio-Safe scintillazione II conteggio cocktail in una fiala di scintillazione. Capovolgere. Conta scintillazione (Beckman LS6500) dovrebbero essere oltre 18.000 cpm prima di continuare con il dosaggio.
- Quando abbastanza NaH 14 CO 3 è stato aggiunto al tampone di saggio,spostare le provette di reazione ad un bagno di preset secco a 25 ° C e incubare per 3-5 minuti.
- Aggiungere 100 pl tampone di saggio per i lisati e incubare per 5 minuti a 25 ° C.
- Aggiungere 20 pl di 15 mM ribulosio difosfato, per campioni e permettere la reazione per 5-10 minuti a 25 ° C.
- Aggiungere 100 pl di acido propionico (100%) (Fisher) per arrestare la reazione. Centrifugare per 1 ora a 2000 xg per esaurire unincorporated 14 C.
- Trasferire il volume totale dei campioni di flaconi di scintillazione contenente 3 ml Bio-sicura di cocktail di scintillazione II conteggio. Determinare il cpm di prodotti finali acidi stabili mediante conteggio a scintillazione (B. Witte, R. Tabita comunicazione personale).
- Calcolare i tassi di attività RuBisCo su Chl a base 14.
5. Risultati rappresentativi
Abbiamo utilizzato coltura di arricchimento per isolare fototrofi freddo adattato e protisti mixotrophic residenti nella L AntartideAke Bonney. Per acquisire una maggiore diversità di organismi, abbiamo provato tre tipi di terreni di coltura: Medio basale Bold (BBM) 15, F/2-Si Marine Media 16, 17 e BG11 Media 18. L'ispezione visiva delle colture di arricchimento al microscopio ottico ha rivelato che le colture sono state dominate dal protisti fototrofi (indicata dalla presenza del pigmento clorofilla nella maggior parte delle cellule) e alloggiata una varietà di morfologie cellule a seconda della profondità di campionamento dal quale è stata presa l'inoculo e la tipo di supporto utilizzato nella coltura (Fig. 1).
Abbiamo misurato i tassi massimi di attività carbossilasi catalizzate dalla RuBisCo enzima come proxy per il potenziale fissazione del carbonio. Chl a abbondanza è stato anche monitorato come una stima della biomassa fototrofi protista (Fig. 2). Nonostante la coltivazione di tutte le culture sotto la stessa temperatura / luce regime (es. 4 ° C/20 mmol m -2 s -1), fissazione del carbonio potenzialee biomasse fototrofi varia drasticamente tra le culture di arricchimento. Massima attività Rubisco è stata osservata in colture di arricchimento in crescita o BBM (arricchimenti 4 e 6) o BG11 (arricchimenti 13 e 14) mezzi di crescita, mentre le colture arricchito in F / 2 mezzo di crescita (arricchimenti 19, 21, 23) esposto a 4 - alle attività minori di 34 volte carbossilasi massimi. Queste differenze non erano dovuti a bassi livelli di biomassa nelle F / 2 culture, come l'attività carbossilasi è stata espressa su una base Chl. Inoltre, l'attività RuBisCo non correlavano con CHL una concentrazione (r = -0,023, p> 0.1;. Fig. 2, inserto). Le culture BBM inoculate con l'acqua del lago da 6 e 15 m (arricchimenti 4 e 5) aveva la più alta Chl a livelli, mentre tutte le altre culture esposti CHL relativamente bassa a, indipendentemente dall'attività enzimatica RuBisCo (Fig. 2).
Figura 1.Rappresentativi microbiche eucarioti colture di arricchimento che sono selezionati per la crescita di organismi diversi. Identità della cultura è data in basso a sinistra dei pannelli. Tutte le immagini rappresentano micrografie luminosi generati utilizzando olio da immersione ingrandimento 1000X.
Figura 2. Potenziale capacità di fissazione del carbonio e la clorofilla estraibile alcuni livelli in colture microbiche eucarioti arricchimento antartici isolati dal lago di Bonney e coltivati in vari terreni di coltura. Vedi Tabella 1 per i dettagli cultura Inset:. Correlazione di Pearson tra clorofilla un potenziale di fissazione di carbonio in abbondanza e colture microbiche eucarioti arricchimento antartiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Recenti studi molecolari hanno riportato alta diversità di eucarioti unicellulari in una serie di ambienti 3, 19, 20, tuttavia, a causa della mancanza di isolati tutta la gamma di habitat protisti i ruoli funzionali di queste singole specie in reti alimentari sono largamente sconosciuto. In questo studio, abbiamo descritto le metodologie di arricchire di specie microbiche eucarioti espositrici versatilità metabolica da un ambiente relativamente sottocampionato, uno permanentemente coperta di ghiaccio antartico lago. Culture arricchite da una profondità di campionamento diverse Bonney Lake esposto differenziali tassi di fissazione del carbonio che sono stati la crescita a medio-dipendente. Ad esempio, un basso potenziale di fissazione del carbonio nelle culture arricchiti in F / 2 rispetto a BBM o BG 11 mezzi di crescita probabilmente riflette le differenze nella diversità protista e capacità metabolica. Terreno di crescita BBM seleziona per le specie di alghe verdi (o chlorophytes) e le nostre culture sembrano essere una monocultura di una specie di alghe verdi (Fig.1A, B). Questi organismi sono noti a dipendere in gran parte photoautotrophy. Un isolato dal metabolismo Bonney Lake photoautotrophic mostre pura, con il vincolo della luce come la sua unica fonte di energia 1. Al contrario, F / 2 crescita media è progettato per arricchire per una vasta gamma di protisti marini, compresi gli organismi potenzialmente mixotrophic 12. Anche se non ha pienamente esplorare la diversità delle F / 2 culture, viste microscopici di questi arricchimenti mostrano chiaramente un consorzio di protisti di morfologie cellulari diversi (Fig. 1 C, D). Così, una ridotta attività RuBisCo nelle F / 2 culture potrebbe essere dovuto all'utilizzo di sistemi alternativi di carbonio / energia modalità di acquisizione. A sostegno di questa previsione, le colture pure di ceppi antartici photoautotrophic presentano significativamente più alti tassi massimi carbossilasi RuBisCo rispetto Antarctic isola che mixotrophy mostra (Dolhi & Morgan-Kiss, risultati non pubblicati). Ulteriori studi di eterotrofi Enzattività YME in questi campioni contribuirebbe a caratterizzare completamente la versatilità metabolica delle colture di arricchimento protisti e sono attualmente in corso nel nostro laboratorio. Inoltre, i dati fisiologici descritti nel presente documento sarà integrato da filogenetica e metagenomica informazioni sequenza come parte di un grande sforzo di sequenziamento per la caratterizzazione delle comunità microbiche in tutto il mondo chiamato Progetto Terra microbioma ( http://www.earthmicrobiome.org/~~V ) .
Il saggio modificato filtro descritto in questa relazione può essere applicato anche a lisato cellulare estratto da campioni di lago di acqua filtrata. Tuttavia, per le nuove applicazioni di questo saggio, il volume lisato ottimale dovrebbe essere determinata analizzando tre volumi differenti e con quella che produce cpm almeno 3 a 4 volte sopra i controlli negativi. Analisi del potenziale di fissazione del carbonio, in collaborazione con l'analisi di attività enzimatiche eterotrofity nelle comunità naturali protisti fornirebbe una visione più dettagliata del ruolo della capacità trofica protista e ciclo del carbonio in ambienti acquatici. Attualmente stiamo applicando questo approccio per comprendere il ruolo dei fattori ambientali abiotici in protista versatilità metabolica in Bonney Lake e gli altri laghi antartici. Il carbossilasi RuBisCo filtro metodo di analisi sarà uno strumento prezioso per studiare la fissazione potenziale di carbonio e la versatilità metabolica in aree culturali di arricchimento su scala nonché i sistemi di lago.
Prima dello sviluppo di coltivazione strumenti indipendenti molecolari, protisti sono stati tradizionalmente identificato mediante coltivazione e tassonomicamente classificate in base alla loro morfologia cellulare. Quindi, vi è una lunga storia di arricchimento e isolamento dei protisti residenti in una grande varietà di habitat. I primi studi, in particolare, sono storicamente importante per l'identificazione tassonomica dettagliata (recensione in: 21, 22). Mentre isolamento dei protistiutilizzando l'arricchimento approcci basati è relativamente rara in ambienti d'acqua dolce antartiche, diversi isolati protisti marini arricchimento di acqua di mare antartiche sono disponibili 23-26. Inoltre, le collezioni di colture diverse sono dedicate alla protista e isolati microalghe (ad es: il Provasoli-Guillard raccolta delle colture, https://ncma.bigelow.org/~~V ). Tecnologie di sequenziamento affidabili ed economiche hanno prodotto un enorme database genetico di incolti sequenze protistan. Mentre questi database sono stati molto istruttiva per quanto riguarda la diversità e la distribuzione di questo importante gruppo di microrganismi, c'è un divario sempre più ampio nel collegare i dati di sequenza con la nostra comprensione dell'ecologia protista e la fisiologia. Così, tecniche di coltivazione tradizionali, in particolare in ambienti polari sottocampionate come habitat acquatici continuerà a svolgere un ruolo importante per comprendere l'importanza e ruoli ecologicidi protisti a livello mondiale ciclismo geochimica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano J. Priscu, A. Chiuchiolo e il team di McMurdo LTER limnologia per l'assistenza nella raccolta e conservazione dei campioni in Antartide. Ringraziamo Ratheon Servizi polari PHI ed elicotteri per il supporto logistico. Micrografie luce sono stati generati nel Centro di Miami per la microscopia avanzata e Centro Imaging. Questo lavoro è stato supportato dall'Ufficio NSF di Polar Grants Programmi 0631659 e 1056396.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBM | Sigma-Aldrich | B5282 | |
| BG11 | Sigma-Aldrich | C3061 | |
| F/2 | Sigma-Aldrich | G9903 | |
| GF/F filter, 25 mm | Fisher Scientific | 09-874-64 | |
| GF/F filter, 47 mm | Fisher Scientific | 09-874-71 | |
| Polyethersulfone filter, 0.45 μm pore, 47 mm | Pall Corporation | 61854 | |
| Sterile cell culture flask, 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Diurnal growth chamber | VWR international | 35960-076 | |
| Zirconia/silica beads, 0.1 mm diamter | Biospec Products | 11079101z | |
| Mini-Bead beater | Biospec Products | 3110BX | |
| Screw-cap microcentrifuge tube (1.5 μL) | USA Scientific, Inc. | 1415-8700 | |
| NaH14CO3 | ViTrax | VC 194 | Keep in aliquots of 400 μL at -20°C |
| RuBP | Sigma-Aldrich | R0878-100mg | Dissolve in 10 mM Tris-propionic acid (pH 6.5) |
References
- Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. P., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Hüner, N. P. A. Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments. Microbiol Mol. Biol. Rev. 70, 222-252 (2006).
- Priscu, J. C., Wolf, C. F., Takacs, C. D., Fritsen, C. H., Laybourn-Parry, J., Roberts, J. K. M., Berry-Lyons, W. Carbon transformations in the water column of a perennially ice-covered Antarctic Lake. Biosci. 49, 997-1008 (1999).
- Caron, D. A., Worden, A. Z., Countway, P. D., Demir, E., Heidelberg, K. B. Protists are microbes too: a perspective. ISME J. 3, 4-12 (2009).
- Bielewicz, S., Bell, E. M., Kong, W., Friedberg, I., Priscu, J. C., Morgan-Kiss, R. M. Protist diversity in a permanently ice-covered Antarctic lake during the polar night transition. ISME J. 5, 1559-1564 (2011).
- Laybourn-Parry, J. No place too cold. Science. 324, 1521-1522 (2009).
- Roberts, E. C., Laybourn-Parry, J. Mixotrophic cryptophytes and their predators in the Dry Valley lakes of Antarctica. Freshwat. Biol. 41, 737-746 (1999).
- Roberts, E. C., Priscu, J. C., Laybourn-Parry, J. Microplankton dynamics in a perennially ice-covered Antarctic lake-Lake Hoare. Freshwat Biol. 27, 238-249 (2004).
- Bell, E. M., Laybourn-Parry, J. Mixotrophy in the Antarctic phytoflagellate Pyramimonas gelidicola. J. Phycol. 39, 644-649 (2003).
- De Wever, A., Leliaert, F., Verleyen, E., Vanormelingen, P., Van der Gucht, K., Hodgson, D. A. Hidden levels of phylodiversity in Antarctic green algae: further evidence for the existence of glacial refugia. Proc. Biol. Sci. , 276-3591 (2009).
- Laybourn-Parry, J. Survival mechanisms in Antarctic lakes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 357, 863-869 (2002).
- Lizotte, M. P., Priscu, J. C. Distribution, succession and fate of phytoplankton in the dry valley lakes of Antarctica, based on pigment analysis. Ecosystem Dynamics in a Polar Desert: The McMurdo Dry Valleys. Priscu, J. C. , 229-240 (1998).
- Ellis, R. J. Most abundance protein in the world. Tren. Biochem. Sci. 4, 241-244 (1979).
- Tortell, P. D., Martin, C. L., Corkum, M. E. Inorganic carbon uptake and intracellular assimilation by subarctic Pacific phytoplankton assemblages. Limnol. Oceanogr. 51, 2102-2110 (2006).
- Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F. New spectrophotometric equations for determining chlorophyll a, b, c1, c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanz. 167, 191-194 (1975).
- Morgan, R. M., Ivanov, A. G., Priscu, J. C., Maxwell, D. P., Hüner, N. P. A. Structure and composition of the photochemical apparatus of the Antarctic green alga, Chlamydomonas subcaudata. Photosyn. Res. 56, 303-314 (1998).
- Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of Marine Invertebrate Animals. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Plenum Publishing. New York. 29-60 (1975).
- Johnson, M. D., Tengs, T., Oldach, D., Stoecker, D. K. Sequestration, performance, and functional control of cryptophyte plastids in the ciliate Myrionecta rubra (Ciliophora. J. Phycol. 42, 1235-1246 (2006).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J., Herdman, M., Stanier, R. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Not, F., del Campo, J., Balague, V., De Vargas, C., Massana, R. New insights into the diversity of marine picoeukaryotes. PLoS ONE. 4, e7143 (2009).
- Sherr, B. F., Sherr, E. B., Caron, D. A., Vaulot, D., Worden, A. Z. Oceanic Protists. Oceanography. 20, 130-135 (2007).
- Finlay, B. J. Protist taxonomy: an ecological perspective. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 359, 599-610 (2004).
- Foissner, W. Protist diversity: estimates of the near-imponderable. Protist. 150, 363-368 (1999).
- Gast, R. J., Moran, D. M., Dennett, M. R., Caron, D. A. Kleptoplasty in an Antarctic dinoflagellate: caught in evolutionary transition. Environmental Microbiology. 9, 39-45 (2007).
- Gast, R. J., Moran, M. A., Beaudoin, D. J., Blythe, J. N., Dennett, M. R., Caron, D. A. High abundance of a novel dinoflagellate phylotype in the Ross Sea. Antarctica. J. Phycol. 42, 233-242 (2006).
- Moran, D. M., Anderson, O. R., Dennett, M. R., Caron, D. A., Gast, R. J. A Description of Seven Antarctic Marine Gymnamoebae Including a New Subspecies, Two New Species and a New Genus: Neoparamoeba aestuarina antarctica n. subsp., Platyamoeba oblongata n. sp., Platyamoeba contorta n. sp. and Vermistella antarctica n. gen. n. sp. Journal of Eukaryotic Microbiology. 54, 169-183 (2007).
- Rose, J. M., Vora, N. M., Countway, P. D., Gast, R. J., Caron, D. A. Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist. The ISME journal. 3, 252-260 (2009).
