Summary
Mikrobiyal ökaryotlarda hem kalıcı buz kaplı Antarktika göllerde fotosentetik kaynaklı karbon ve en yırtıcı türlerinin bir kaynağıdır. Bu rapor, Antarktika gölü Bonney gelen metabolik olarak çok yönlü mikrobiyal ökaryotlar izole etmek için bir zenginleşme kültür yaklaşımı açıklar ve Ribuloz-1 ,5-bisphophate karboksilaz oksijenaz (RUBISCO'nun) faaliyeti için bir radyoizotop testi kullanılarak inorganik karbon fiksasyonu potansiyeli değerlendiriyor.
Abstract
Göl Bonney Antarktika, McMurdo Kuru Vadiler bulunan çok sayıda kalıcı buz kaplı göllerinden biridir. Çok yıllık buz örtüsü bir kimyasal tabakalı su kolonu tutar ve suyun diğer iç organları aksine, büyük ölçüde karbon ve derelerden dış kaynaklı besin girdisini önler. Biota kış döneminde 1 yıl boyunca ciddi besin yetersizliği, düşük sıcaklık, aşırı gölge, aşırı tuzlu ve 24 saat karanlık gibi birçok çevresel streslere, maruz kalmaktadır. Bu zorlu çevre koşullarında mikroorganizmaların 2 neredeyse sadece Gölü Bonney yılında biyotası sınırlar.
Tek hücreli mikrobiyal ökaryotlar ("protistler" olarak adlandırılır) küresel biyojeokimyasal bisiklet 3 önemli oyuncu var ve sucul besin ağı birincil ve üçüncül rollerin hem işgal, kuru vadi göllerde karbon bisiklet önemli ekolojik roller oynamaktadır. I düzeltmek kuru vadi sucul besin ağı, protistler olaraknorganic karbon (autotrophy) organotrofik organizmalar için organik karbon 4, 2 büyük üreticiler. Phagotrophic veya bakteri ve küçük protistler ingesting yeteneğine sahip heterotrofik protistler besin ağı 5 en iyi avcılar olarak hareket ederler. Son, protist nüfusun bilinmeyen bir oranda kombine mixotrophic metabolizması 6, 7 yeteneğine sahiptir. Protistler içinde Mixotrophy av mikroorganizmaların phagotrophic yenmesi ile fotosentez yeteneği birleştirmek yeteneği gerektirir. Mixotrophy bu biçimi genellikle alımı çözünmüş karbon molekülleri içerir bakteri türlerinde mixotrophic metabolizması farklıdır. Orada çok az protist izolatlarının kalıcı buz kaplı kutup göllerden şu anda ve bu aşırı ortamda protist çeşitlilik ve ekoloji çalışmaları da sınırlı 8, 4, 9, 10, 5 olmuştur. Basit bir kuru vadi göl gıda web protist metabolik yönlülük daha iyi anlaşılması r için modellerin geliştirilmesinde yardımcı olacakKüresel karbon döngüsünün protistler arasında ole.
Biz Gölü Bonney potansiyel olarak fototrofik ve mixotrophic protistler izole etmek için bir zenginlik kültürü yöntemi benimsenmiştir. Su sütununda Örnekleme derinliklerinde birincil üretim maksimum ve protist filogenetik çeşitliliği 4, 11 yeri gibi protist trofik modları etkileyen önemli abiyotik faktörler değişkenlik göre seçilmiştir: sığ, örnekleme derinlikleri Majör besinler için sınırlı iken derin örnekleme derinlikleri Işık durumu ile sınırlıdır. Ayrıca, göl su örneklerinin fototrofik organizmaların çeşitli büyümesini teşvik büyüme ortamı çok tip ile takviye edildi.
RUBISCO'nun Calvin Benson Bassham (CBB) döngüsü, ototroflarda inorganik karbon düzeltmek ve sucul ve karasal besin ağları 12 trofik seviyeleri için organik karbon sağlayacak hangi ana yolda hız sınırlama basamağı katalizler. Bu çalışmada, we Gölü Bonney zenginleştirme kültürlerde karbon fiksasyonu potansiyeli ve metabolik çok yönlülük için bir vekil olarak maksimum karboksilaz aktivitesini izlemek için filtrelenmiş örnekleri 13 için modifiye bir radyoizotop testi uygulanır.
Protocol
1. Numune Alma
- Seçin ve su kolonu örnekleme önce bir gün örnekleme sitesini hazırlamak. Bu su kolonunun tabakalı katmanları sondaj ve buz delik erime nedeniyle rahatsızlıklardan sonra reform sağlayacaktır. GPS ile matkap sitenin konumunu tanımlayın.
- Su sütunu erişmek için, bir 4-inç Jiffy uçuş uzatma ve kesme bit bağlı bir Jiffy buz burgusu ile buz bir delik delerek başlar. Delik delme donmasını önlemek için, su kolonunun üst seviyesinde sondaj yaklaşık 4-6 santim durdurarak sıvı suya sondaj kaçınıyorum.
- Delik önce örnekleme için 15 ile 60 cm çapı genişlemiş gerekecektir. Bu, bir bakır boru yoluyla ısıtılmış polietilen glikol sirküle bir delik eritici (Hotsy Model) kullanılması ile gerçekleştirilir. Delik erime genellikle 18 saat kadar sürer.
- Önce su kolonu örnekleme, emin olun gerekli tüm ekipman ve örnek stOraj damarları örnekleme yerinde monte edilir. Örnekleme malzemeleri: Niskin şişe (5-10 lt kapasiteli), derinlik-kalibre kablo ile Vinç, Messenger, her örnekleme derinlik için yeterli numune şişeleri ve numune taşıma için soğutucular.
- Gölün su filtreleme örnekleme gününde tamamlanması gerektiği gibi, günün erken saatlerinde (~ 5 am) örnekleme başlayın. Kalibre edilmiş bir bağlanmış bir Niskin örnekleyici kullanılarak: (6-m, 15 m-ve buz deliğe piyezometrik su seviyesi ile ölçülen 18-m örnekleme derinlikleri, bu çalışma için) istenen derinlikleri su numuneleri (1-5 L) toplamak el vinci. Su sütunu olumsuz yönde etkilenmemesi için daha derin olanlar önce sığ derinliklerde toplamak.
- Mağaza göl örnekleri soğutucular ve örnek sitesinden bir ATV (tüm arazi aracı) bağlı bir kızak kullanılarak alanına laboratuara taşımacılığında. Alan laboratuar hemen aşağıdaki Örnekleme: Numuneler işlenmiş veya (sıvı azot flaş dondurma örn) stabilize edilmelidir.
2. DevelopmeZenginleştirme Kültürlerin nt
- Zenginleştirme kültürlerin ekimi için, nazik filtrasyon (<0.3 atm) kullanılarak 47 mm 0.45 mikron gözenek büyüklüğüne polyethersulfone filtreleri üzerine göl suyunun 0.5-1 L Konsantre. Doğal toplumun çeşitliliğinin istenirse, 47 mm 0.45 mikron gözenek büyüklüğüne polyethersulfone filtreler üzerine ikinci bir numune filtre ve. 4 ökaryot filogenetik çeşitliliği Bielewicz ark göre protokolleri uygulayın.
- Filtre olarak aynı örnekleme derinlik toplanan filtre göl suyunun ~ 20 mL içeren 50 ml steril falcon tüp filtre aktarın. Yavaşça steril bir pipet kullanarak filtre hücreleri yıkayın.
- 25 cm 2 steril hücre kültürü şişesi için hücre süspansiyonu aktarın. 45 mL kültür hacmini artırmak için her bir örnek derinliği toplanan filtre göl suyu ekleyin. Farklı kültür ortamı üzerinde zenginleşme istendiğinde birden her örnekleme derinlik çoğaltır ayarlayın.
- 50X s ile kültür şişeleri SupplementKalın en Bazal Orta, BG11 ve F / 2: şu kültür ortamının 1X bir son konsantrasyon elde etmek terile çözümler. Mixotrophic organizmaların ekimi, set-up iki F/2-supplemented gemi gereklidir ve matara birine steril pirinç 2-3 tane eklemek durumunda.
- Lütfen ABD laboratuvara Sevkiyat öncesi Antarktika'daki en az 4 hafta boyunca sıcaklık kontrollü bir büyüme inkübatör düşük sıcaklıkta (4 ° C) ve düşük ışınım (20 ľmol fotonlar m -2 s -1) de kültür şişeleri inkübe edin. 2 hafta inkübasyondan sonra uygun büyüme ortamı içeren agar üzerinde zenginleştirme kültür izolatları arzu ediyorsanız, plaka 250 uL.
- ABD, steril 50 ml falcon tüpleri transfer zenginleştirme kültürleri gönderilecek. Talebi sevk gereksinimi "dondurmak değil" ve istek nakliye üzerine "soğuk tutmak". Antarktika'dan nakliye işlemi nispeten hızlı (2 hafta ticari hava) ve oldukça güvenilir olmasına rağmen, titiz organ kaybı olasılığı vardırtaşıma işlemi sırasında izm. Böylece, araştırmacılar nakliye işlemi sırasında bazı türlerin kaybının değerlendirilmesi, böylece nakliye öncesinde bir alt örnek korumak isteyebilirsiniz.
- ABD'de geldikten sonra, bir 125 ml steril Erlenmeyer şişesinde uygun büyüme ortamı 45 mL içine zenginleştirme kültür transferi 5 mL steril bir sünger ile kaplandı. Zenginleştirme kültürleri 4 de kontrollü çevre büyüme odası (sadece gündüz Büyüme Odası, VWR) ° C/20 ľmol fotonlar m -2 s -1 bir sıcaklık kültürler ayakta olarak muhafaza edilmelidir. Kültürler taze medya her 30 günde bir transfer edilmelidir.
3. Filtreli zenginleşme gelen Hücre Lysate Ekstraksiyon
- Hafif vakumlu (<10 psi) ile bir 25 mm Whatman GF / F filtresi üzerine zenginleştirme kültür filtrenin 5 mL. Filtre -80 birkaç hafta saklanabilir ° C önceden RUBISCO'nun aktivite içlin için.
- Steril çelik makas ile 4-5 bölüme filtre kesin veaktarmak 2 ml vidalı kapaklı tüpe steril forseps adet 0.1 mm çapında zirkonyum / silika boncuklar ile tam yolu beşte birini doldurdu.
- 10 mM NaHCO 3, 10 mM DTT, 3.3 mM aminokaproik: taze eklemek; filtre ekstraksiyon tamponu 1.25 ml (50 mM bicine, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA,% 0.1 Triton X-100 ekleme asit, 0.7 mM benzamidin, pH 7.8) 13 ve hız ayarı 48. 30'lu için Minibead çırpıcı üç kez kullanarak hücrelerin bozabilir. 1 dakika buz inkübasyon ile örnek ısıtma, alternatif beadbeating önlemek için.
- GF / F filtresi elyaflar ve hücre duvarı kalıntı gevşek bir pelet oluşturmak için 4 ° C'de 3.000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüje bulamaç filtre.
- Buz% 90 aseton 800 uL bir 200 ul tablet ve suya batırın çıkarın. Ekstrakte klorofil ölçün (chl) 664 nm ve 647 nm dalga boyunda 14 değerlerinde bir spektrofotometre bir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın.
- Remaini Santrifüj4 at ng süpernatant ° 2 15.000 xg'de dk ve temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe (çözünmez hücre zarının pelet ve kalan GF / F filtre lifleri kaçının) Süpernatant aktarmak için C. Bu çözünür hücre lizatı artık RUBISCO'nun karboksilaz aktivite tayini için kullanılabilir.
- Lizat -80 ° C'de sıvı azot içinde% 12.5 gliserol ve flaş donma eklenmesinden sonra saklanabilir. Aktivite kaybı lizatı enzimlerin hassasiyetine bağlı olarak birden fazla donma / çözülme döngüsünden sonra oluşabilir. Bu nedenle, taze donmuş lizatı karşı aktivitesi büyük ölçekli hücre lizatı çekimlerinden önce test edilmelidir.
4. RUBISCO'nun karboksilaz Aktivitesi Filtre Testi
- Buz üzerinde soğutulmuş olan bir 15 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpü (gerekli değildir kap) çözünür lizat 125 uL aktarın. Negatif kontrol örnekleri için, 15 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpüne 125 uL çözünür lizat ekleyebilirsiniz, ancak (Adım 4.7) substrat ilave etmeyiniz. Çalıştırmaktüm örnekler ve negatif kontroller için reaksiyonlar çoğaltın.
- 10 taze tahlil tamponu mL (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO 3, 25 mM MgCl2) ve buz üzerinde soğutucu hazırlayın. Yeterli bir 5 ml tüp örnekleri ve negatif kontroller (örnek / kontrol artı 100 uL ekstra başına 100 uL) tümü için tahlil tampon kısım. Bir çeker ocak altında sonraki tüm adımları uygulayın.
- 14 CO 3 (500 μCi / ml) mL başına bölünüp tampon tahlil tamponu NaH 40 uL ekleyin ve buz üzerinde tampon tutun.
- 14 C içeren tahlil tampon 10 uL kaldırmak ve deney tamponu 1 mL içinde tamamlanır. Karıştırmak için ters sonra, bir sintilasyon flakonda kokteyl sayma Bio-Safe II sintilasyon 3 mL 1:100 sulandırılmış karışımı 100 mcL ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin. Sintilasyon sayımı (Beckman LS6500) yöntemi ile devam etmeden önce 18.000 kopya üzerinde olmalıdır.
- Yeterince NaH 14 CO 3 deney tamponu ilave edildiğinde,3-5 dakika için 25 ° C ile inkübe için önceden belirlenmiş bir kuru banyosuna reaksiyon tüpleri hareket eder.
- Lizatları ila 100 uL deney tamponu ekleyin ve 25 de 5 dakika inkübe ° C.
- Numuneler için, 15 mM Ribuloz bisfosfatın 20 uL ekleyin ve reaksiyon 25 dakika için 5-10 ilerlemesine izin ° C.
- Reaksiyonu durdurmak için 100 uL propionik asit (100%) (Fischer) eklenir. Tüzel kişiliği olmayan 14 C tüketmeye 2.000 xg az 1 saat santrifüjleyin
- 3 ml Bio-Safe II sintilasyon sayma kokteyl içeren sintilasyon şişelerine, numunelerin toplam hacmi aktarın. Kıvılcım sayımı (B. Witte, R. Tabita kişisel iletişim) tarafından asit stabil son ürünleri kopya belirleyin.
- Bir chl temeli 14 RUBISCO'nun etkinlik oranları hesaplayın.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Biz soğuk adapte fototrofik ve Antarktika L ikamet eden mixotrophic protistler yalıtmak için zenginleştirme kültürü kullanılmıştırAKE Bonney. Kalın Kullanıcı Bazal Orta (BBM) 15, F/2-Si Deniz Orta 16, 17 ve BG11 Orta 18: organizmaların büyük bir çeşitlilik yakalamak için, biz üç büyüme medya türleri test. Işık mikroskobu ile zenginleştirme kültürlerin görsel denetim kültürleri fototrofik protistler (en hücrelerinde klorofil pigmentinin varlığı ile gösterilir) hâkim olduğunu göstermiştir ve bir inokulum alındığı örnekleme derinliğine bağlı olarak hücre morfolojileri çeşitliliği ve barındırmaktaydı kültürü kullanılan ortam tipi (Şekil 1).
Biz karbon fiksasyonu potansiyeli için bir vekil olarak RUBISCO'nun enzim tarafından katalize karboksilaz aktivitesi maksimum hızları ölçüldü. Chl bir bolluk da fototrofik protist biyokütle tahmini (Şekil 2) olarak izlendi. Aynı sıcaklık / ışık rejimi (yani 4 ° C/20 mol m -2 s -1), karbon fiksasyonu potansiyeli altındaki tüm kültürlerin ekimi rağmenve fototrofik biyokütle zenginleştirme kültürleri farklı biçimde hissedildi. Kültürler, bir 4 sergilenen F / 2 büyüme medyumu (zenginleşmesi 19, 21, 23) üzerindeki zenginleştirilmiş iken maksimum RUBISCO'nun aktivitesi, BBM (zenginleşmesi 4 ve 6) ya da BG11 (zenginleşmesi 13 ve 14) büyüme ortamında ya da büyüyen bir zenginleşmesi kültürler gözlendi - 34 kat daha düşük maksimum karboksilaz faaliyetleri. Karboksilaz aktivitesi Chl bir bazında olduğu gibi bu farklılıklar, F / 2 kültürde düşük biyokütle düzeyleri nedeniyle değildi. Ayrıca, RUBISCO'nun aktivite chl bir konsantrasyon (.; Şekil 2, inset r = -0,023, p> 0.1) ile ilişkili değildir. Diğer tüm kültürler, bir, bağımsız olarak RUBISCO'nun enzim aktivitesinin (Şekil 2) nispeten düşük Chl teşhir ederken 6 m ve m 15 (zenginleşmesi 4 ve 5) den göl suyu ile inoküle BBM kültürler, yüksek Chl, bir seviyesine sahipti.
Şekil 1..Temsilcisi mikrobiyal ökaryot zenginleştirme farklı organizmaların büyümesi için seçtik kültürler. Kültür Kimlik panelleri sol alt verilmiştir. Tüm görüntüler 1000X büyütmede immersiyon yağı kullanılarak oluşturulan ışık mikrografikleri temsil eder.
Şekil 2. Potansiyel karbon fiksasyon kapasitesi ve ekstrakte klorofil Gölü Bonney izole ve çeşitli kültür ortamında yetişen Antarktika mikrobiyal ökaryot zenginleştirme kültürleri bir düzeyde. Kültürü için Tablo 1'e bakınız Ankastre:. Klorofil arasındaki Pearson korelasyon Antarktika mikrobiyal ökaryot zenginleştirme kültürleri bir bolluk ve karbon fiksasyonu potansiyeli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda yapılan moleküler çalışmalar ortamlarda 3, 19, 20 bir dizi genelinde tek hücreli ökaryotlarda yüksek çeşitlilik bildirdin, ancak protist habitatların tam aralığında izolatların eksikliği nedeniyle bu türlerin tek tek fonksiyonel rolleri besin ağları büyük ölçüde uyumludur bilinmiyor. Bu çalışmada, nispeten undersampled ortamında, kalıcı buz kaplı Antarktika gölden metabolik yönlülük sergileyen mikrobiyal ökaryot türler için zenginleştirmek için yöntemler tanımlamışlardır. Göl Bonney farklı örnekleme derinliklerinden zenginleştirilmiş Kültürler büyüme orta bağımlı diferansiyel karbon fiksasyonu oranları sergiledi. Örneğin, BBM veya BG 11 büyüme ortamı karşı F / 2 zenginleştirilmiş kültürlerde düşük karbon fiksasyonu potansiyel olasılıkla protist çeşitlilik ve metabolik yeteneği farklılıkları yansıtır. BBM büyüme orta yeşil alg türleri (veya chlorophytes) için seçer ve kültürler (Şekil yeşil alg türlerinin bir monokültür görünmektedir1A, B). Bu organizmalar büyük ölçüde photoautotrophy bağlı olduğu bilinmektedir. Bir tamamen kendi enerji kaynağı 1 olarak ışık için katı bir gereklilik olan, Lake Bonney sergiler saf fotoototrofik metabolizma izole. Bunun aksine, F / 2 büyüme medyumu potansiyel mixotrophic organizmalar dahil olmak üzere 12 deniz protistler, geniş bir aralığı için zenginleştirmek için tasarlanmıştır. Biz tam F / 2 kültür çeşitliliğini keşfetmek etmezken, bu zenginleşme mikroskobik görünümleri açıkça çeşitli hücre morfolojisi protistler bir konsorsiyum (Şekil 1C, D) göstermektedir. Böylece, F / 2 kültürlerde RUBISCO'nun aktivitesi alternatif karbon / enerji kazanım modların kullanımına bağlı olabilir azaltılabilir. Bu öngörü destek olarak, fotoototrofik Antarktika izolatların saf kültürlerin Antarktika sergilediğini mixotrophy (Dolhi & Morgan-Kiss, yayınlanmamış sonuçlar) izole ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek maksimum RUBISCO'nun karboksilaz oranları sergilerler. Heterotrofik enz daha ileri çalışmalaraBu örneklerde Yme faaliyeti tamamen protist zenginleştirme kültürlerin metabolik yönlülük karakterize etmek için yardımcı ve laboratuar halen devam etmektedir olacaktır. Buna ek olarak, bu yazıda bahsedilen fizyolojik verilerin filogenetik ve Dünya mikrobiyomları Projesi olarak adlandırılan dünya genelinde mikrobiyal topluluklar karakterize etmek için büyük bir sıralama çalışmalarının bir parçası olarak metagenomic sıralama bilgileri (tamamlanacak http://www.earthmicrobiome.org/~~V ) .
Bu raporda açıklanan modifiye filtre testi, süzülmüş göl suyu örneklerinin çıkarılan hücre lizatı için uygulanan olabilir. Bununla birlikte, bu tahlilde yeni uygulamaları için optimal lizat hacminin üç farklı hacim test edilmesinden ve en az 3-4 kez negatif kontrol yukarıda cpm getirir ki bu kullanılarak tespit edilir. Heterotrofik aktiviteler enzimatik analizler ile birlikte karbon fiksasyonu potansiyelinin AnalizleriDoğal protist topluluklarda ty protist trofik yetenek ve sucul ortamlarda karbon bisiklet rolünün daha ayrıntılı bir görünüm sağlayacaktır. Şu anda Gölü Bonney ve diğer Antarktika göllerde protist metabolik yönlülük abiyotik çevresel faktörlerin rolünü anlamak için bu yaklaşım uygulamaktayız. RUBISCO'nun karboksilaz filtre metodu küçük ölçekli zenginleştirme kültürlerinin yanı sıra, bütün göl sistemlerin potansiyel karbon fiksasyonu ve metabolik yönlülük incelemek için değerli bir araç olacaktır.
Kültürden bağımsız moleküler araçlarının geliştirilmesinden önce, protistler geleneksel kültürü ile belirlendi ve taksonomik ve hücre morfolojileri göre sınıflandırılır. Böylece, zenginleştirme ve habitatların geniş bir yelpazede yaşayan protistler izolasyon uzun bir geçmişi var. Özellikle Erken araştırmalar detaylı taksonomik kimlik (: 21, 22 olarak yorumlanan) için tarihsel değerlidir. Iken protistler izolasyonuzenginleştirme tabanlı yaklaşımlar kullanılarak Antarktika deniz suyunun zenginleşmesine birçok deniz protist izolatları 23-26 mevcuttur, Antarktika tatlı su ortamlarında nadirdir. Ayrıca, çok sayıda kültür koleksiyonları protist ve mikroalg izolat (: Provasoli-Guillard kültürü toplama, örneğin adanmış https://ncma.bigelow.org/~~V ). Güvenilir ve ucuz sıralama teknolojileri ekilmemiş protistan dizilerinin büyük genetik veritabanı üretmişlerdir. Bu veritabanlarının mikroorganizmaların bu önemli grubunun çeşitliliği ve dağılımı ile ilgili çok bilgilendirici olmuş iken, protist ekolojisi ve fizyolojisi anlayışımız ile dizi veri bağlama içinde genişleyen bir uçurum vardır. Böylece, özellikle polar su habitatları olarak undersampled ortamlarda geleneksel yetiştirme teknikleri, önemi ve ekolojik rolleri anlamaya dönük önemli bir rol oynamaya devam edecekKüresel jeokimyasal bisiklet protistler arasında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar J. Priscu, A. Chiuchiolo toplanması ve Antarktika'daki örneklerinin korunması konusunda yardım almak için McMurdo tlar limnoloji ekibinize teşekkür. Biz lojistik destek Ratheon Polar Hizmetler ve PHI helikopterler teşekkür ederiz. Işık mikrograflar Gelişmiş Mikroskopi ve Görüntüleme Merkezi için Miami'nin Merkezi oluşturulmuştur. Bu çalışma Polar Programları Hibe 0631659 ve 1056396 ile NSF Ofisi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBM | Sigma-Aldrich | B5282 | |
| BG11 | Sigma-Aldrich | C3061 | |
| F/2 | Sigma-Aldrich | G9903 | |
| GF/F filter, 25 mm | Fisher Scientific | 09-874-64 | |
| GF/F filter, 47 mm | Fisher Scientific | 09-874-71 | |
| Polyethersulfone filter, 0.45 μm pore, 47 mm | Pall Corporation | 61854 | |
| Sterile cell culture flask, 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Diurnal growth chamber | VWR international | 35960-076 | |
| Zirconia/silica beads, 0.1 mm diamter | Biospec Products | 11079101z | |
| Mini-Bead beater | Biospec Products | 3110BX | |
| Screw-cap microcentrifuge tube (1.5 μL) | USA Scientific, Inc. | 1415-8700 | |
| NaH14CO3 | ViTrax | VC 194 | Keep in aliquots of 400 μL at -20°C |
| RuBP | Sigma-Aldrich | R0878-100mg | Dissolve in 10 mM Tris-propionic acid (pH 6.5) |
References
- Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. P., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Hüner, N. P. A. Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments. Microbiol Mol. Biol. Rev. 70, 222-252 (2006).
- Priscu, J. C., Wolf, C. F., Takacs, C. D., Fritsen, C. H., Laybourn-Parry, J., Roberts, J. K. M., Berry-Lyons, W. Carbon transformations in the water column of a perennially ice-covered Antarctic Lake. Biosci. 49, 997-1008 (1999).
- Caron, D. A., Worden, A. Z., Countway, P. D., Demir, E., Heidelberg, K. B. Protists are microbes too: a perspective. ISME J. 3, 4-12 (2009).
- Bielewicz, S., Bell, E. M., Kong, W., Friedberg, I., Priscu, J. C., Morgan-Kiss, R. M. Protist diversity in a permanently ice-covered Antarctic lake during the polar night transition. ISME J. 5, 1559-1564 (2011).
- Laybourn-Parry, J. No place too cold. Science. 324, 1521-1522 (2009).
- Roberts, E. C., Laybourn-Parry, J. Mixotrophic cryptophytes and their predators in the Dry Valley lakes of Antarctica. Freshwat. Biol. 41, 737-746 (1999).
- Roberts, E. C., Priscu, J. C., Laybourn-Parry, J. Microplankton dynamics in a perennially ice-covered Antarctic lake-Lake Hoare. Freshwat Biol. 27, 238-249 (2004).
- Bell, E. M., Laybourn-Parry, J. Mixotrophy in the Antarctic phytoflagellate Pyramimonas gelidicola. J. Phycol. 39, 644-649 (2003).
- De Wever, A., Leliaert, F., Verleyen, E., Vanormelingen, P., Van der Gucht, K., Hodgson, D. A. Hidden levels of phylodiversity in Antarctic green algae: further evidence for the existence of glacial refugia. Proc. Biol. Sci. , 276-3591 (2009).
- Laybourn-Parry, J. Survival mechanisms in Antarctic lakes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 357, 863-869 (2002).
- Lizotte, M. P., Priscu, J. C. Distribution, succession and fate of phytoplankton in the dry valley lakes of Antarctica, based on pigment analysis. Ecosystem Dynamics in a Polar Desert: The McMurdo Dry Valleys. Priscu, J. C. , 229-240 (1998).
- Ellis, R. J. Most abundance protein in the world. Tren. Biochem. Sci. 4, 241-244 (1979).
- Tortell, P. D., Martin, C. L., Corkum, M. E. Inorganic carbon uptake and intracellular assimilation by subarctic Pacific phytoplankton assemblages. Limnol. Oceanogr. 51, 2102-2110 (2006).
- Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F. New spectrophotometric equations for determining chlorophyll a, b, c1, c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanz. 167, 191-194 (1975).
- Morgan, R. M., Ivanov, A. G., Priscu, J. C., Maxwell, D. P., Hüner, N. P. A. Structure and composition of the photochemical apparatus of the Antarctic green alga, Chlamydomonas subcaudata. Photosyn. Res. 56, 303-314 (1998).
- Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of Marine Invertebrate Animals. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Plenum Publishing. New York. 29-60 (1975).
- Johnson, M. D., Tengs, T., Oldach, D., Stoecker, D. K. Sequestration, performance, and functional control of cryptophyte plastids in the ciliate Myrionecta rubra (Ciliophora. J. Phycol. 42, 1235-1246 (2006).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J., Herdman, M., Stanier, R. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Not, F., del Campo, J., Balague, V., De Vargas, C., Massana, R. New insights into the diversity of marine picoeukaryotes. PLoS ONE. 4, e7143 (2009).
- Sherr, B. F., Sherr, E. B., Caron, D. A., Vaulot, D., Worden, A. Z. Oceanic Protists. Oceanography. 20, 130-135 (2007).
- Finlay, B. J. Protist taxonomy: an ecological perspective. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 359, 599-610 (2004).
- Foissner, W. Protist diversity: estimates of the near-imponderable. Protist. 150, 363-368 (1999).
- Gast, R. J., Moran, D. M., Dennett, M. R., Caron, D. A. Kleptoplasty in an Antarctic dinoflagellate: caught in evolutionary transition. Environmental Microbiology. 9, 39-45 (2007).
- Gast, R. J., Moran, M. A., Beaudoin, D. J., Blythe, J. N., Dennett, M. R., Caron, D. A. High abundance of a novel dinoflagellate phylotype in the Ross Sea. Antarctica. J. Phycol. 42, 233-242 (2006).
- Moran, D. M., Anderson, O. R., Dennett, M. R., Caron, D. A., Gast, R. J. A Description of Seven Antarctic Marine Gymnamoebae Including a New Subspecies, Two New Species and a New Genus: Neoparamoeba aestuarina antarctica n. subsp., Platyamoeba oblongata n. sp., Platyamoeba contorta n. sp. and Vermistella antarctica n. gen. n. sp. Journal of Eukaryotic Microbiology. 54, 169-183 (2007).
- Rose, J. M., Vora, N. M., Countway, P. D., Gast, R. J., Caron, D. A. Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist. The ISME journal. 3, 252-260 (2009).
