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Biology

고양이와 쥐의 Ovariectomy 및 17β-estradiol 대체 : 비주얼 데모

doi: 10.3791/4013 Published: June 7, 2012

Summary

silastic 캡슐과 peroral Nutella 의한 Ovariectomy 및 17β-estradiol의 후속 교체는 쥐 및 생쥐에서 증명하고 있습니다.

Abstract

Estrogens는 효과의 매우 넓은 스펙트럼과 여성의 성 호르몬의 가족입니다. 쥐 및 생쥐는 에스 트로겐 연구에 사용하는 경우 이들은 일반적으로 17β-estradiol exogenously을 교체, 빠르게 사이클링 호르몬 생산을 ablate하기 위해 ovariectomized됩니다. 호르몬은 생리 혈청 농도를 얻기 위해 관리되는 방식에 관한 합의 부족 그러나,있다. 17β-estradiol 수준 / 관리 방법 뿌리깊은 실험 결과는 1-3 미치는 영향 때문에 이것은 중요합니다. 우리는 피하 silastic 캡슐과 당 구두 너트 - 크림 Nutella는 상용 느리게 출시 알약 (미국의 기업 혁신 연구에서 생산)로 우수하다고 찾는 17β-estradiol 행정의 다양한 모드를 특징 연구 시리즈가 있고 17β-estradiol 4-6의 생리 혈청 농도를 생산의 관점에서 매일 주사. 교수실 사이이전 buprenorphine 행정 7 사용되었습니다 너트 - 크림 방법의 antages은 에스 ​​트로겐 관리에 사용하면 그것이 peroral 호르몬 대체 요법과 유사하고 비침습가된다. 피하 silastic 캡슐이 편리하며 가장 안정적인 혈청 농도를 생산하고 있습니다. 이 비디오 문서 ovariectomy의 단계별 데모 및 silastic 캡슐 및 행정 절차의 중요한 측면에 대한 논의 뒤에 쥐 및 생쥐에서 peroral Nutella 의한 17β-estradiol 호르몬 대체가 포함되어 있습니다.

Protocol

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1. 지느러미 루트를 통해 Ovariectomy

  1. 산소 / 질소 산화물 30% / 70 %의 혼합에서 isoflurane 1.5 %를 (유도 4 %)를 사용하여 예를 들어, 동물을 마취. 직장 온도계에 연결된 열판에서 발생하기 쉬운 위치에있는 동물을 놓습니다. 그것은 동물과 플레이트 사이에 고립의 얇은 레이어를 가지고하는 것이 중요하다, 그래서 온도계 피드백 시스템은 37 이내에 체온을 유지 ± 0.5 ° C. 눈 보호를위한 젤을 적용하고 수술 후 통증 완화를위한 동물의 목 측면에는 subcutaneously 식염수에 희석 5 MG의 Rimadyl / kg bodyweight를 관리합니다.
  2. 장골의의 문장에서 cephally 4 * 4cm (3 생쥐에 대한 * 3 ㎝) 영역을 면도. 철저하게 4 * 4cm의 조리개 수술 시트와 동물을 취재하기 전에 예제 Jodopax 위해 함께 음모 지역을 씻는다.
  3. 2~3센티미터 중간선 절개를 만들어 퉁명스럽게 기본 근막으로부터 피부를 해부. 중간선의 측면 하나 CM은, 다른 절개를 죽하다근막 윽. 퉁명스럽게 복강에 도달하기 전까지 같은 피상적 가능한이 근막 아래 laterally 해부.
  4. 족집게 사용하여 복강에 난소를 둘러싸는 지방 조직을 잡고 부드럽게 빼낸다. 난소를 확인하고 자궁 뿔을하고이 구조의 proximally 혈관 0.5-1 센티미터 ligate. 난소와 출혈도 잡았 지방 조직을 잘라 복강에 남아있는 조직 입어요. contralateral 근막에 다른 절개를 확인하고 절차를 반복합니다.
  5. 선호 monofilament의 봉합사를 이용하여 상처를 닫고 마취에서 깨어 동물 봅시다. 수술 후 최소 2 시간 동안 열띤 케이지 (25-27 ℃)에서 동물을 놓습니다. 동물은 처음 며칠 postoperatively 별도로 지내게됩니다. 그것은 새장가 자주 복구 단계에서 청소 / 교체되는 중추이다. 스물 네 시간 수술 후에 희석 앞으로 5 MG의 Rimadyl / kg bodyweight으로 subcutaneously 동물을 주입염분.

2. Silastic 캡슐을 통해 17β-estradiol의 피하 관리

  1. 완전히 깨 기름에 17β-estradiol의 원하는 금액을 섞는다. 쥐 및 생쥐의 생리적 농도의 경우, 우리는 각각 180 μg / ML 및 μg / ML 18-36을 추천합니다. 위약 캡슐은 순수 참기름으로 채워진다.
  2. 3cm (생쥐 2 ㎝) silastic 튜브의 길이와 5mm (쥐 3 ㎜) 도전을위한 작은 주걱 나무 스틱의 길이를 잘라. 포셉 사용하여 전체 길이를 채울 17β-estradiol/sesame 오일 솔루션을 주입하기 전에 silastic 캡슐로 한 목조 플러그를 조인다. 부드럽게 다른 나무 플러그 (플러그는 캡슐에 영구적으로 유지하기로하고)으로 열린 끝에 silastic 캡슐를 쏠. 이식하기 전에 하룻밤 나머지 17β-estradiol 솔루션 캡슐을 품어.
  3. 캡슐의 주입은 쥐의 ovariectomy에서 사용 마취 중에 수행할 수 있습니다. 마일을 위해CE 그러나, ovariectomy 후 14 일간의 복구 기간이 강력하게 연약한 피부를 통해 튀어나와 캡슐의 위험을 최소화하는 것이 좋습니다.
  4. 1.1에서와 같이, 또는 ovariectomy의 절개를 닫은 후 수술 준비 후, 면도하고 동물의 목 지느러미 부분에 2 * 2cm 영역을 씻는다. 1cm의 절개를 만들어 퉁명스럽게 캡슐을위한 충분한 공간과 함께 caudolaterally 피하 주머니 해부. silastic 캡슐 (이 시간 시점까지 17β-estradiol 용액에 incubated되었는지) 닦아 부드럽게 이후 봉합사에 의해 닫혀 절개를 통해 그것을 설치합니다. 그것은 확실히 중추입니다 특히 상처 가까운 지역에서 가능한 거의 같은 캡슐 변종은 피부. 이식에 대한 캡슐의 생산에서 그것은 오염은 피할 수있다는 것이 중요합니다.

3. 너트 - 크림 Nutella 통해 17β-estradiol의 Peroral 관리

  1. 완전히 용해 17β-그리고 참깨 기름 estradiol,하고 Nutella와 참깨 오일을 섞는다. 우리는 각각의 매일 부분은 17β-estradiol 28 μg, 5 μL 참기름과 kg 바디 쥐에 대한 무게와 17β-estradiol 1.12 μg, 0.312 μL 참기름과 각 30 g 마우스 60 MG의 Nutella 당 1g의 Nutella를 포함하는 것이 좋습니다. 위약 너트 - 크림은 17β-estradiol이없는 경우를 제외하고 동일하게 준비가되어 있습니다.
  2. 실험 전에 5 일 동안 호르몬없는 너트 - 크림을 먹는 동물을 훈련. 연수의 첫 번째 3 일, 쥐가 최적의 자택 연습장에서 (약 0.5 g에 Nutella 2-5 동물) 그룹에서 훈련을해야합니다. 훈련의 네번째와 다섯째 날에는 동물 실험 상황을 닮은 매일 부분을 수신하기 전에 별도의 케이지에 부착 할 것입니다.
  3. 실험을 진행하는 동안 동물 Nutella 부분은 작은 세라믹 타일에 제공되는 이후, 모든 먹이 때를 위해 별도의 케이지에 부착 할 것입니다. 교육은 위에서, O로 수행되었을 경우UR 경험 쥐 및 생쥐 이상의 95 % 너트-크림을 수락하고, 한번에 완전히 길들여지지, 동물의 대부분은 초 내에 그것을 소비한다는 것입니다.

4. 대표 결과

현재의 방법을 재현하는 것을 목표로 생리 혈청 17β-estradiol 농도가 있으며, 약 5-140 PG / 쥐 및 생쥐 4,6를위한 5-35 PG / ML위한 ML. 피하 silastic 캡슐은 위의 지시에 따라, 300g 암컷 Sprague-Dawley의 쥐에 투여했을 때, 천천히 PG / ML 일 40 2-10 PG / ML 일 35에서 17β-estradiol 혈청 농도를 감소 생산하고 있습니다. 다만, 즉시 행정 후에, 1000 PG / ML 주변의 혈청 농도 피크는 4,5 (그림 1A) 8 시간 이내에 생리적 범위로 떨어지는, 기대할 수 있습니다. 25g 암컷 C57BL / 6 마​​우스에 투여 36 μg의 17β-estradiol/mL로 위에서 설명한 생쥐에 대한 silastic 캡슐은 혈청 conc을 세우다천천히 약 90 PG / ML 하루 2-25 PG / ML 일 35 감소한 entrations. 이것은 (그림 1B) 6을 조사하는 것은 아니지만, 쥐에서 발견되었다대로 이것은 아마도 유사한 피크 앞에있다.

복용량과 peroral Nutella 방식은 300g 암컷 Sprague-Dawley의 쥐에 투여했을 때, 위에 설명된 10-70 PG / ML (그림 2A) 4 사이의 일일 변동과 17β-estradiol의 생리적 수준을 렌더링. 위 복용량을 사용하는 마우스의 경우 일일 수준은 약 20 120 PG / ML (그림 2B) 6 사이의 변동.

그림 1
. 쥐의 17β-estradiol 농도 제시 룽> 그림 1화한 그래프, 4,5와 쥐 (나중 포인트에서 N까지 시간 포인트에서 = 10 최대 24 H, N = 15) (B, N = 10) 캡슐 이식 후 6. silastic 캡슐은 1000 혈청 농도의 짧은 초기 피크를 생산 PG / ML지만, 100 PG / ML 아래 수준까지 시간 이내에 감소. 꾸준히 감소하고 있지만 오는 4~5주 들어, 캡슐은, 혈청 농도를 안정적으로 얻을 수 있습니다. 그늘진 지역은 각각 온전 여성 쥐 및 생쥐의 생리 17β-estradiol 혈청 농도에 해당합니다. 시각적으로 그래프에서 시연되지하더라도, 남북 각각의 변화는 (매우 낮은 평균 27 일부터 쥐의 1백83퍼센트로 28에서 silastic 캡슐 방식으로 마우스의 1백15%에 변이 계수 렌더링, 17β-estradiol 농도에있다 농도는 종종) 유사 높은 계수를 생성합니다.

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그림 2 쥐의 17β-estradiol 농도를 제시화한 그래프 (; N = 15). 4와 생쥐 (B, N = 10) Nutella에서 매일 호르몬 관리의 결과로서 6. peroral Nutella 방법은 피하 또는 정맥 주사 방법으로 생산되는만큼 높은 그러나 안하 시니 지금까지 매일 봉우리 렌더링. 이것은 인간의 호르몬 대체 요법의 pharmacokinetics을 모방한 것이었하고 peroral 치료는 위의 예제는 초기 96시간을 제시하는 경우에도 한 필요를 위해 진행할 수 있습니다. 그늘진 지역은 각각 온전 여성 쥐 및 생쥐의 생리 17β-estradiol 혈청 농도에 해당합니다. 비록 시각적으로 그래프에서 보여준 아니라 남북 각각의 변화는 (매우 낮은 평균 농도 Nutella 방법과 마우스로 쥐의 40~132%에서 그리고 13 일부터 2백19퍼센트로 변이 계수 렌더링, 17β-estradiol 농도에있다 자주 높이를 생성변동 계수).

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Discussion

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이전 연구에서 경험 위에 표시 관리 모드는 17β-estradiol의 생리 혈청 농도를 생산의 관점에서 상업 천천히 릴리스 알약과 주사 우수이었다. 느린 - 릴리스 알약이 매우 높고 장시간 혈청 농도 봉우리를 생산하는 동안 주사는 극단 매일 호르몬 변동의 원인과 동물 4-6의 반복 스트레스 처리를 필요로합니다. 적절한 관리 모드를 선택의 중요성은 낮은 복용량 17β-estradiol 관리 regimens (예 : 현재 문서에서 제공 기법 등) 대뇌 국소 빈혈의 8-10으로부터 보호하면서, 17β-estradiol 농도가 제작한하다는 최근의 연구에 의해 강조된다 상업 느리게 출시 쥐똥 실제로 대뇌 손상 1,2,11-14을 증가시킬 수 있습니다. 식수 관리와 구강 gavage가 테스트한 두 개의 다른, 덜 자주, 방법이 있습니다. 를 관리 식수를 통해 호르몬 모두가 필요에 거의 어떤 동물 처리 이후 극도로 비침습되고의 가장 큰 장점이 있습니다. 그러나, 17β-estradiol은 유화제없이 물에 용해 아니라, 각각의 물 섭취량은 통제하기가 어렵습니다, 그리고 목적은 먹는 피임약의 소비를 반영하는 경우, 또 다른 단점은 쥐가 전체 24시간 중에 물을 마시는 것입니다 . 구강 gavage는 동물에 대한 스트레스와 먹이의 행동에 영향을 미칠 수있는 식도 부상을 일으킬 수있다는 점에서 가장 큰 단점이 있습니다.

silastic 캡슐 및 peroral Nutella - - 방법은 여기에서 설명한 단기 에스 트로겐 행정과 5-6주까지 긴 기간에 적합 둘 수 있습니다. 높은 접종가에 관계없이 행정 매체의 유형, 위에서 설명한 것보다 사용하는 경우 장기간 에스 트로겐 행정부는 점막 증식 15에 의한 요도 폐색 등 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다.

"여기 제시된> 방법은 쉽게 예를 들면 다음과 복용량, 캡슐의 길이 등에 관한 수정할 수 있습니다, 그것은 더 꾸준히 생리 혈청 농도 6을 달성하기위한 마우스 regimens에서 모두 캡슐과 Nutella의 17β-estradiol 접종을 모두 낮출 보증 수 있습니다. 수정이 이루어질 또는 기술을 이미 조사보다 동물의 다른 계통에 사용하는 경우는 혈청 시료에서 17β-estradiol 농도를 측정하여 새롭게 방법의 유효성을 검사하는 데 매우 중요합니다.하는 경우 다만, 이러한 혈청 샘플은 여러 번에 받아야합니다 포인트 전체 복용량 - 반응 관계 / 곡선, 그리고 단지 짧은 돌아간 것. 자궁 가중치를 반영하는 대신 17β-estradiol의 생물 학적 효과의 척도로서 혈청 17β-estradiol 농도의 일부 작가에 의해 사용되었습니다.하지만, 분명한 건 자궁 무게는 endometrium의 estrogens의 구체적인 효과를 반영하고 필연적으로 다른 시스템에서 estrogens의 영향을 반영하지 않습니다. Furt가그녀, 자궁 무게는 약하게 혈청 에스 트로겐 수준 4,6으로 서로 관련됩니다.

에너지 풍부한 Nutella 다량의 일일 소비량은 체중 증가를 일으킬 수 있습니다. 그러나 소량만을 Nutella를 사용하여 우리의 연구에서 관찰되지 않은 동물들의 일일 에너지 섭취와 과도한 체중 증가의 5 % 이하에 해당 위에서 설명한.

쥐 및 생쥐의 장점 특별한 강조와 협력의 결정적 차이. 엄격한 위생에 관계없이 동물 종의 중추이지만, 감염에 대한 마우스 감도 쥐가 함께 작업할 때보다 더 높은 수준의 감시를 기울여야합니다. 예를 들어, 이전에 절개, 빈번한 의료 장갑의 변화와 불임 수술 도구의 사용으로 피부의주의 소독이 훼손해서는 안됩니다. 보형물은 항상 감염 hotbeds 있습니다. 동물 따라서 정기적으로 캡슐 이식 후 감염의 흔적을 검사해야합니다. 농양이 주위에 형성되는 경우임플란트, 우리는 동물이 euthanized거나 캡슐을 제거하는, 상처가 꼼꼼하게 청소하고, 다른 캡슐은 새로운 절개를 통해 복직하는 것이 좋습니다. 또한, 마우스의 뒤를의 피부는 캡슐 행정 이전 ovariectomy 후 convalescence 2 주간을 warranting, 쥐보다 훨씬 더 깨지기입니다.

위에 제시된 방법도 17β-estradiol이 아닌 다른 물질을 사용할 수 있습니다. 그러나 pharmacokinetics와 각 정권의 복용량은 신중하게 선호 시행 물질의 연속적인 혈청을 측정하여 특징 것이 중요합니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

연구는 Linköping 대학교 Östergötland의 군 의회에 의해 재정 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy.
Lubrithal eye gel Leo Laboratories Eye protection during surgery.
Jodopax vet Pharmaxim Surgery disinfection.
Vicryl 4-0 suture Johnson & Johnson Wound suture and ovary ligation.
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-1G In sesame oil for silastic capsules and Nutella.
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol.
Silastic tubing, ID/OD: 1.575/3.175 mm Dow Corning 508-008 Production of silastic capsules.
Wooden applicator stick Selefatrade 12-0783 Capping of silastic capsules.
Nutella Ferrero Medium for peroral 17β-estradiol.

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References

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Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013, doi:10.3791/4013 (2012).More

Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013, doi:10.3791/4013 (2012).

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