Summary
卵巢切除术和硅胶胶囊和口服花生酱,随后更换17β-雌二醇表明,在大鼠和小鼠。
Abstract
雌激素是女性性激素的影响格外广泛的家庭。当大鼠和小鼠使用雌激素的研究,它们通常以消融迅速骑车激素生产,更换外源性17β-雌二醇去势。有,然而,缺乏有关激素应如何管理,以获取生理血清浓度的共识。这是至关重要的,因为17β-雌二醇的水平/管理方法深刻地影响实验结果1-3。我们有一系列特点17β-雌二醇管理的不同模式的研究,发现皮下硅胶胶囊和每口螺母,奶油花生酱均优于市售缓释微丸(创新研究由美国公司生产)在生产生理血清浓度的17β-雌二醇4-6每日注射。当中高级坚果冰淇淋的方法,以前一直使用丁丙诺啡管理7,antages是,当雌激素的管理使用,它类似于口服激素替代疗法和非侵入性。皮下硅胶胶囊是方便和生产最稳定的血药浓度。这部影片的文章包含了卵巢切除术的一步一步的示范和17β-雌二醇激素替代硅橡胶胶囊和口服花生酱在大鼠和小鼠,其次是行政程序的重要方面进行讨论。
Protocol
1。去势通过背路线
- 麻醉动物,例如1.5%异氟醚诱导的(4%),氧/氧化亚氮混合30%/ 70%。将动物俯卧在直肠温度计连接到一个加热板。重要的是有一层薄薄的动物和板块之间的隔离,温度计反馈系统的体温保持在37±0.5°C。申请保护眼睛凝胶和管理5毫克Rimadyl的/公斤体重生理盐水稀释皮下注射动物的脖子上缓解术后疼痛的侧面。
- 剃一个4 * 4厘米(3×3厘米)对小鼠面积cephally从髂骨。彻底用例如Jodopax的光头面积覆盖的动物有一个4 * 4厘米孔径手术表之前。
- 正中切口2-3厘米,并直言不讳地剖析了从底层的筋膜皮肤。中线外侧一厘米,再作切口throUGH筋膜。直言不讳地剖析横向表面尽可能根据本筋膜,直至到达腹腔。
- 使用镊子,抢的,在腹腔内的卵巢周围的脂肪组织,并轻轻将其拉出。鉴别卵巢结扎子宫角和船只0.5-1厘米,这种结构近端。切卵巢和结扎脂肪组织,并投入其余组织回腹腔。另一个切口,并在对侧筋膜,重复上述步骤。
- 关闭伤口,最好用单丝缝合,让从麻醉中醒来的动物。在激烈的笼(25-27℃)放置在手术后至少2小时的动物。动物应该分别被安置术后第一天。笼经常清洗/替换在恢复阶段,这是关键。手术后二十四小时内,注入动物皮下,另外5毫克稀释Rimadyl /公斤体重生理盐水。
2。通过硅橡胶胶囊皮下注射17β-雌二醇
- 彻底混合麻油17β-雌二醇所需金额。在大鼠和小鼠的生理浓度,我们建议180μg/ mL和18-36微克/毫升。安慰剂胶囊填充纯香油。
- 切3厘米(2厘米)对小鼠的硅橡胶管的长度和5毫米(3毫米小鼠)木制涂药棒的长度为堵塞。使用镊子,挤入硅橡胶囊前注射的17β-estradiol/sesame的石油解决方案,填补了整个长度一个木塞。轻轻的开口端帽硅橡胶囊与其他木插头(插头是否应该永久地留在胶囊)。在余下的17β-雌二醇的解决方案植入前过夜孵育胶囊。
- 植入胶囊可在大鼠卵巢切除术使用麻醉期间进行。为MICE,然而,卵巢切除后14天的恢复期,强烈建议胶囊通过脆弱的皮肤突起,以尽量减少风险。
- 1.1或关闭后,卵巢切除术切口手术准备后,对动物的脖子,背方面刮胡子,洗一个2 * 2厘米的面积。做一个1厘米的切口,并直言解剖皮下口袋caudolaterally充足的空间胶囊。擦拭硅橡胶囊(直到这个时间点已培养在17β-雌二醇的解决方案),并轻轻地安装它通过小切口,随后缝合封闭。这是关键,以确保胶囊株尽可能少的皮肤,特别是在靠近伤口的面积。从植入胶囊的生产,它是重要的,避免污染。
3。 17β-雌二醇口服政府通过坚果,奶油花生酱
- 彻底解散17β-雌二醇香油,然后与花生酱混合麻油。我们建议每天的部分包含17β-雌二醇28微克,5μL香油1克每公斤老鼠体重1.12微克17β-雌二醇,0.312μL香油和60毫克每30克鼠标花生酱花生酱。 17β-雌二醇只是没有相同的安慰剂坚果,奶油准备。
- 训练动物实验前五天无激素螺母冰淇淋吃。首3天的培训中,大鼠优化应该被训练组(约0.5克的花生酱,以2-5动物),在他们家的笼子里。在第四次和第五次天的培训,动物是在单独的笼子前接受日常生活的一部分,类似的实验情况。
- 在实验过程中,在单独的笼子里的动物,每饲养之际,后担任小瓷砖,其中花生酱的部分。如果训练已执行以上,O你的经验是,超过95%的大鼠和小鼠接受坚果冰淇淋,一旦完全习惯于,大多数动物在几秒钟内消耗。
4。代表结果
生理血清17β-雌二醇的浓度,而目前的方法旨在重现,约5-140皮克/毫升大鼠和小鼠4,6 5-35皮克/毫升。皮下的硅胶胶囊,根据上述指示,当300克只雌性SD大鼠,产生缓慢下降17β-雌二醇的血药浓度约40皮克/毫升一天2至10皮克/毫升35天。然而,立即给药后,约1000皮克/毫升的血药浓度高峰,可以预期,在8小时内下降到生理范围内( 图1A)4,5。 36的微克17β-estradiol/mL,管理时至25克雌性C57BL / 6小鼠以上所述的小鼠,硅橡胶胶囊,呈现血清浓entrations缓慢下降约90皮克/毫升每天2至25皮克/毫升35天。这可能是由一个类似的高峰之前,被发现在大鼠,虽然这并没有被查处( 图1B)6。
口服剂量的花生酱上面介绍的方法,当300克只雌性SD大鼠,呈现17β-雌二醇10-70皮克/毫升( 图2A)4之间的每日波动的生理水平。对于使用上述剂量的小鼠,每日水平波动之间的约20和120皮克/毫升( 图2B)6。
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图2展示17β-雌二醇浓度在大鼠的程式化的图(A,N = 15)。4和小鼠(B,N = 10)6,花生酱每日激素管理的后果。每天口服花生酱的方法呈现高峰,但不是通过远高皮下或静脉注射的方法制作。这模仿人类的激素替代疗法的药物动力学,口服治疗可以进行,只要需要,即使上面的例子只提出了一个最初的96小时。阴影部分对应的生理17β-雌二醇完整的雌性大鼠和小鼠的血清浓度。即使不直观图表显示,在17β-雌二醇浓度间的个体差异,使在小鼠花生酱的方法从大鼠的40%至132%,从13到219%,变异系数(平均浓度非常低往往产生高变异系数)。
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Discussion
上面介绍的管理模式,在早先的研究证明优于商业缓释微丸生产生理血清浓度17β-雌二醇注射。而缓释微丸生产非常高,长期的血药浓度峰值,注射导致极端情况下,每天的激素的波动,需要反复的动物4-6压力处理。选择适当的管理模式的重要性,强调了最近的研究表明,虽然低剂量的17β-雌二醇的管理方案(如在目前的文章中提出的技术)防止脑缺血8-10,17β-雌二醇浓度由生产商业缓释微丸可能实际上增加了脑损伤1,2,11-14。饮用水管理和灌胃,其他两个,不太频繁,已通过测试的方法。治通过饮用水激素有其极端的非侵入性的最大的好处,因为几乎没有要求所有的动物处理。然而,17β-雌二醇也不是没有乳化剂易溶于水,个别水的摄入量是难以控制的,如果其目的是反映消费的药丸,还有一个缺点是,老鼠喝的水,在整个24小时。灌胃,其最大的缺点,因为它是动物的压力,并可能引起食管损伤,这可能会影响摄食行为。
这里介绍的方法 - 硅橡胶胶囊和口服花生酱 - 既适合短期雌激素管理和较长高达5-6周。除上文所述,不论管理介质类型如果使用高剂量,长期雌激素管理可以导致严重的副作用,如尿道闭塞,由于粘膜增殖15。
“关于用量,胶囊剂,例如长度等>在这里介绍的方法可以很容易地进行修改,可保证降低胶囊和花生酱中的鼠标方案17β-雌二醇的剂量,以更稳妥地实现生理血清浓度6。但是,如果任何修改,或者如果该技术在其他菌株比已经研究的动物,它是至关重要的重新验证通过测量血清中17β-雌二醇浓度的方法。这些血清样品必须在几个时间获得点,以反映整个子宫重量剂量反应关系/曲线,而不是只是一个短暂的一瞥。已被用于血清17β-雌二醇浓度17β-雌二醇的生物效应的措施,而不是一些学者,但明显子宫重量反映了雌激素对子宫内膜的具体影响,不一定反映在其他系统上的雌激素的影响。Furt她的子宫重量只有弱相关,血清雌激素水平4,6。每天消耗大量能源丰富的花生酱可能会导致体重增加。然而,少量以上所述只能对应使用花生酱在我们的研究并未观察不到5%的动物的每日能量摄入和体重增加过快。
在大鼠和小鼠值得特别强调的工作关键的区别。即使严格的卫生是关键,无论动物物种,小鼠感染的敏感性,呼吁在老鼠时的水平,甚至高于审议。例如,前仔细消毒皮肤切口,频繁更换医用手套和无菌手术工具的使用必须不会受到影响。植入感染的温床。动物,因此必须定期检查的胶囊植入后感染的迹象。如果周围形成脓肿植入,我们建议该动物是安乐死或胶囊被删除,认真清洗伤口,另一胶囊通过一个新的切口恢复。此外,比对大鼠,小鼠背上的皮肤更脆弱,值得胶囊给药前卵巢切除后的两个星期的恢复期。
上面介绍的方法也可以用于其他物质比17β-雌二醇。然而,重要的是,每个政权的药代动力学和剂量是经过精心的特点,最好由管理物质的血清连续测量,。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
资助这项研究是由林雪平大学和东约特兰省县议会。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Rimadyl, 50 mg/mL | Pfizer Pharma GmbH | 462986 | Postoperative analgesia after ovariectomy. |
Lubrithal eye gel | Leo Laboratories | Eye protection during surgery. | |
Jodopax vet | Pharmaxim | Surgery disinfection. | |
Vicryl 4-0 suture | Johnson & Johnson | Wound suture and ovary ligation. | |
17β-estradiol, >98% | Sigma-Aldrich | E8875-1G | In sesame oil for silastic capsules and Nutella. |
Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-1L | Dissolving the 17β-estradiol. |
Silastic tubing, ID/OD: 1.575/3.175 mm | Dow Corning | 508-008 | Production of silastic capsules. |
Wooden applicator stick | Selefatrade | 12-0783 | Capping of silastic capsules. |
Nutella | Ferrero | Medium for peroral 17β-estradiol. |
References
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Holm, L., Theodorsson, A. Different methods for administering 17beta-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Hormesis and Female Sex Hormones. Pharmaceuticals. 4, 15 (2011).
- Isaksson, I. M., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for 17beta-estradiol administration to rats. Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. , (2011).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Theodorsson, A. Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17beta-oestradiol concentrations in ovariectomized rats. Scand. J. Clin. Lab Invest. 68, 814-822 (2008).
- Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17beta-estradiol administration to mice. General and comparative endocrinology. , (2011).
- Kalliokoski, O., Jacobsen, K. R., Hau, J., Abelson, K. S. Serum concentrations of buprenorphine after oral and parenteral administration in male mice. Vet. J. 187, 251-254 (2011).
- Simpkins, J. W. Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat. J. Neurosurg. 87, 724-730 (1997).
- Wise, P. M., Dubal, D. B. Estradiol protects against ischemic brain injury in middle-aged rats. Biol. Reprod. 63, 982-985 (2000).
- Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, 1531-1539 (2001).
- Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 414-420 (2005).
- Carswell, H. V. Differential effects of 17beta-estradiol upon stroke damage in stroke prone and normotensive rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 298-304 (2004).
- Yong, Y. 17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats. Brain Res. 1054, 192-199 (2005).
- Theodorsson, A., Theodorsson, E. Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus. Peptides. 26, 2257-2264 (2005).
- Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice. Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).