Planarian Immobilisering, Delvis bestråling og vævstransplantation
Summary
En effektiv fremgangsmåde til podning væv veldefineret og ensartet størrelse mellem planaria er beskrevet. Også indbefattet er en beskrivelse af, hvordan immobilisering anvendte teknik til transplantation kan tilpasses, sammen med bly skjolde, til delvis bestråling af levende dyr.
Abstract
Det planarian, en ferskvands fladorm, har vist sig at være et effektivt system til dissekere metazoan regenerering og stamcellebiologi 1,2. Planarian regenerering af eventuelle manglende eller beskadigede væv er gjort mulig ved voksne stamceller kaldes neoblasts 3. Selv om disse stamceller er blevet definitivt vist at være pluripotente og enkeltvis stand til at rekonstituere et helt dyr 4 heterogeniteten i stamcellepopulation og dynamikken i deres cellulære adfærd stort set uløst. Grund af det store antal og udbredelse af stamceller gennem planarian kroppen plan, der avancerede metoder til manipulering subpopulationer af stamceller for molekylær-og funktionelle studier in vivo brug.
Vævstransplantation og delvis bestråling er to metoder, som en subpopulation af planarian stamceller kan isoleres til yderligere undersøgelse. Hver teknik har forskellige fordele. Tproblem transplantation tillader indføring af stamceller, i en naiv vært, der er enten iboende genetisk forskellige, eller tidligere er blevet behandlet farmakologisk. Alternativt delvis bestråling muliggør isolering af stamceller i en vært, anbragt på væv uden stamceller, uden indføring af et sår eller en bundstykket i væv integritet. Ved hjælp af disse to metoder, kan man undersøge celle autonome og ikke-autonome faktorer, der styrer stamceller funktioner, såsom proliferation, differentiering og migration.
Både vævstransplantation 5,6 og partiel bestråling 7 har været anvendt historisk til at definere mange af de spørgsmål om planarian regenerering, der fortsat er under undersøgelse i dag. Imidlertid har disse teknikker forblev underudnyttede grundet arbejdskrævende og usammenhængende art tidligere metoder. De protokoller, der præsenteres her repræsenterer et stort skridt fremad i begrænse den tid, ennd nødvendige indsats for at reproducerbart frembringe store antal podede eller delvist bestrålede dyr med effektiviteter nærmer sig 100 procent. Vi dækker kultur store dyr, immobilisering, forberedelse til delvis bestråling, vævstransplantation, og optimering af animalsk opsving. Endvidere arbejdet beskrevet her, viser den første anvendelse af den delvise bestråling fremgangsmåde til brug med den mest undersøgte planarian, Schmidtea Mediterranea. Derudover effektiv vævstransplantation i planaria åbner døren for den funktionelle test af delpopulationer af naive eller behandlet stamceller i genindsættelse assays, som længe har været guld-standard metode til analyse voksne stamceller potentiale i pattedyr 8. Bred indførelse af disse teknikker vil uden tvivl føre til en bedre forståelse af de cellulære adfærd af voksne stamceller under vævshomeostase og regenerering.
Protocol
Discussion
Vigtigheden af immobilisering
Immobilisering er langt den mest kritiske skridt for en vellykket gennemførelse af nogen af disse processer. Hvis planaria ukorrekt immobiliseres forud for delvis bestråling, kan de bevæge sig under blyafskærmning, der producerer usammenhængende og confounding resultater. Desuden, hvis dyrene utilstrækkeligt immobiliseret efter transplantation, vil værtens ormen sandsynlige bevæge sig bort fra transplantatet væv, hvilket resulterer i en fejl i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Chiyoko Kobayashi og Kiyokazu Agata for gode råd om planarian transplantation samt tidligere og nuværende medlemmer af Sánchez laboratoriet for uvurderlige diskussioner i udviklingen af disse teknikker. Dette arbejde blev støttet af NIH Training Grant (5T32 HD0791) til OCG og NIH R37GM057260 til ASA. ASA er en Howard Hughes Medical Institute Investigators.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 |
| Black filter paper | Schleicher & Schuell | 10310809 |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H. The regeneration of the tail in lumbriculus. J. Morphol. 7, 317-344 .
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F. Studies on transplantation in planaria. Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).
- Morgan, L. Regeneration of grafted pieces of planarians. J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).
- Dubois, F. Contribution á l ‘ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
