Planarian Immobilisering, Delvis Bestråling, og Tissue Transplantation

Summary

En effektiv metode for pode vev av definerte og konsistente størrelse mellom planaria er beskrevet. Inkludert er også en beskrivelse av hvordan immobilisering teknikken brukt for transplantasjon kan tilpasses, i forbindelse med bly skjold, for delvis bestråling av levende dyr.

Abstract

Den planarian, en ferskvann flatworm, har vist seg å være et kraftig system for dissekere metazoan regenerasjon og stilk cellebiologi ^1,2. Planarian regenerering av eventuelle mangler eller er skadet vev er gjort mulig ved adulte stamceller kalles neoblasts ^3. Selv om disse stamcellene har definitivt vist seg å være pluripotent og bemerkelsesverdig i stand til rekonstituering en hel dyr ^4, heterogenitet innen stamcelleforskningen befolkningen og dynamikken i deres cellulære atferd fortsatt i stor grad uløst. På grunn av det store antallet og bred distribusjon av stamceller i hele planarian kroppen planen, blir avanserte metoder for å manipulere subpopulasjoner av stamceller for molekylær og funksjonelle studier in vivo nødvendig.

Tissue transplantasjon og delvis bestråling er to metoder som en undergruppe planarian stamceller kan isoleres for videre studier. Hver teknikk har klare fordeler. Tproblemet transplantasjon gjør for innføring av stamceller, i et naivt vert, som er enten iboende genetisk distinkt eller har vært tidligere behandlet farmakologisk. Alternativt kan delvis bestråling for isolering av stamceller i en vert, sammenstilt til vev blottet for stamceller, uten innføring av et sår eller seteleie i vev integritet. Ved hjelp av disse to metodene, kan man undersøke cellen autonome og ikke-autonome faktorer som styrer stamceller funksjoner, for eksempel spredning, differensiering, og migrasjon.

Både vev transplantasjon ^5,6 og delvis bestråling ⁷ har blitt brukt historisk i å definere mange av spørsmålene om planarian regenerering som gjenstår under studien i dag. Imidlertid har disse teknikkene forble underused grunn av arbeidskrevende og inkonsekvent natur av tidligere metoder. Protokollene som presenteres her representerer et stort skritt fremover i å redusere den tiden ennd innsats som er nødvendig for å reproduserbart generere store mengder podet eller delvis bestrålt dyr med effektivitet nærmer 100 prosent. Vi dekker kultur av store dyr, immobilisering, forberedelse for delvis bestråling, vev transplantasjon, og optimalisering av dyr utvinning. Videre viser arbeidet som er beskrevet her den første søknaden av den delvise bestråling metode for bruk med den mest studerte planarian, Schmidtea Mediterranea. I tillegg åpner effektiv vev pode i planaria døren for funksjonstesting av subpopulasjoner av naive eller behandlet stamceller i repopulation analyser, som lenge har vært gull-standard metode for å analysere voksen stamcelle potensial i pattedyr ^8. Bred bruk av disse teknikkene vil uten tvil føre til en bedre forståelse av de cellulære atferd av adulte stamceller under vev homeostase og regenerering.

Protocol

Merk: denne protokollen tilsier bruk av potensielt farlige stoffer (bly og chloretone). Anskaffe, lese, og følge HMS-datablad for alle potensielt farlige materialer.

1. Animal Kultur, merking og klargjøring

1. For dyr kultur og manøvreringer planarian vann (1x Montjuic salter ⁹⁾ og plast overføre pipetter.
2. Seksuell biotype Schmidtea Mediterranea kan brukes når opp i laboratoriet under normale kultur forhold ^10. Å produsere aseksuelle eksemplarer av nødvendig størrelse, S. Mediterranea hevet ved romtemperatur under normale forhold ⁹ bør fôres med dobbel til trippel normal frekvens (2-3 ganger per uke) for en til to måneder før bruk. Alternativt kan aseksuelle dyr fôret ved normal frekvens holdes på 10 grader Celsius på ubestemt tid for å øke sin gjennomsnittlige størrelse.
3. Velg dyr som er mellom 1 til 2 cm ilengde og bredere enn 2 mm så sulte dyrene 3-7 dager før bruk.
4. Hvis du utfører noen farmakologisk eller radiologiske behandlinger ment verter, givere, eller delvis bestrålte dyr, utføre behandling (er) på dette punktet.
5. Hvis medikamentell behandling ble utført som kreves mate dyrene, sulte dyrene ytterligere 3 til 7 dager før bruk.

2. Utarbeidelse av Solutions og Materials

1. Forbered chloretone løsning, en mild lokalbedøvelse, ved å løse opp 0,1-0,2% w / v chloretone i planarian vann og kjøling løsningen på is.
2. Hvis du utfører delvis bestråling bare, fortsett til trinn 2.7. For vev transplantasjon fortsetter videre til trinn 2.3.
3. Ved hjelp av en gassbrenner, bøy 0,75 mm innvendig diameter, beregnet for å klippe den pode vev, og 0,7 mm utvendig diameter, brukt for å skape et hull i verten som vil motta transplantatet, kapillarrør til en 90 ° vinkel på 1-2 cm fra slutten av each tube. For å lagre materialer, bøy begge ender av hver kapillarrør og bryte dem i halvparten å produsere to verktøy. Pass på ikke å flamme selve endene av rørene.
4. Skjær følgende papirene til de angitte størrelser:
   • Svart filter papir (kuttes i rektangel på ca. 2,5 cm x 1,5 cm)
   • Whatman # 3 filter papir (kuttes i rektangel ca 2 cm x 0,5 cm)
   • Kimwipe (foldet og kuttet i seddelbunker ca. 3 cm x 0.5 cm x 4 lag)
   • Sigarettpapir rulle papir (fjerne tyggegummi stripen og kutt i rektangler omtrent 3 cm x 2 cm)
5. Forbered endret Holtfreter løsning (3,5 g / L NaCl, 0,2 g / L NaHCO _3, 0,05 g / L KCl, 0.2 g / L MgSO _4, 0,1 g / L CaCl _2, 7,0 til 7,5 pH) og kasein mettet Holtfreter løsning og chill både til 4 ° C.
6. Fest en foldet Kimwipe til et kvadrat av Parafilm og plass på Peltier kjøler plate eller annen kjøling enhet som ligger under et dissekere mikroskop. Mett Kimwipe med kjølt Holtfreter løsning og sted to svarte filter papir rektangler på Kimwipe.
7. Linje petriskåler med Whatman # 2 filter papir. Fukt filteret papiret med Holtfreter løsning og chill retter på isen. For delvis bestråling en større parabol og filter papir liner kan brukes.

3. Anesthetization og Immobilisering

1. Fyll en petriskål med kjølt chloretone løsning og pipette ormer inn i fatet. For transplantasjon bare anesthetize en vert og en donor gangen. For delvis bestråling mange (n> 10) dyr kan være bedøvet samtidig.
2. Tillat ormer å suge i chloretone løsning inntil de blir ubevegelig (5-10 min).
3. Skyll ormer ved å pipettere dem inn i et fat fylt med kjølt Holtfreter løsning.
4. Immobilize dyrene ved å pipettere dem på svart filter papir mettet med kjølt Holtfreter løsning og orientere dem ventral side ned med tang. Hvis dyr er i stand til locomote, suge opp overflødig Holtfreter løsning, litt senke temperaturen i Peltier eller kald plate, eller øke lengden på chloretone behandling.

4. Delvis Bestråling

Merk: Følg disse trinnene for å forberede dyr for delvis bestråling. Hvis du utfører transplantasjon stedet, fortsett til punkt 5.

1. Plasser en kjølt petriskål fra trinn 2,7 på is i en isbøtte som vil passe inn i en topp kilde X-ray irradiator.
2. Ordne anesteserte dyr i en petriskål ved å flytte den svarte filter papiret som de er immobilisert. Bruk pinsett til å flytte anesteserte ormer direkte kan skade dem.
3. Transport arrangert dyrene til en topp-kilde X-ray irradiator og situate isen bøtte slik at avstanden fra katoden røret til dyrene er minimert, og dermed maksimere effektiv doserate.
4. Posisjon bly skjold (s) (figur 1) mellom dyr og katoden tUbe som ønsket. Shields skal være 4,5 til 6 mm tykk for å tillate for 97 til 99% demping av en 325kV X-ray stråle ^11.
5. Lever X-ray dose. Hvis komplett stamcelleforskningen ablasjon fra ikke-skjermede områder er ønskelig, levere 30 Gy eller mer med en X-ray irradiator. For referanse, er 30 Gy tilsvarer 3,6 minutter ved 320 kilovolt og 10 milliampere i en Precision X-Ray Inc. XRAD320 med et felt-til-source avstand på 30 centimeter.
6. Umiddelbart etter dosering er fullført, håndtering ormer ved det svarte filteret papir, overføre dyr i en nedkjølt planarian vann. La planarian vannet varmes opp til romtemperatur og dyra å løsne seg fra svart filter papir. Den delvis bestråling Prosedyren er nå fullført.

5. Tissue Transplantation

1. Ved hjelp av en overføringspipetten og tang, arrangere bedøves vert og donor ormer på separate biter av svart filter papir på Kimwipe som er kjølt ned på PeltiER eller kaldere plate under dissekere mikroskop.
2. Ved hjelp av en 0,75 mm indre diameter kapillærrør kutte ut transplantatet pluggen fra donor, og ved hjelp tang, legg det på en ut av veien delen av verten. Hvis pode materiale setter seg fast i kapillarrør, løsne med tang.
3. Ved hjelp av en 0,7 mm ytre diameter kapillærrør fjerne en plugg fra verten og bruke tang posisjon transplantatet inn i hullet som er igjen.
4. Overfør transplanterte vert på sin sorte filter papir rektangel i petriskål utarbeidet i trinn 2.7.
5. Fukt et stykke rullende papir med kasein mettet Holtfreter løsning og plassere den på toppen av det transplanterte vert som diagramed i figur 2A.
6. Sug fire stykker av filter papir i kasein mettet Holtfreter løsning og omrammer den transplanterte vert som diagramed i figur 2B.
7. Sug fire forladninger av cut Kimwipe i kasein mettet Holtfreter løsning og legge dem overfilteret papir fra trinn 5,6 (figur 2B). Sett på lokket og satte petriskål på is.
8. Overfør donor ormen inn planarian vann for å gjenopprette, helbrede, og regenerere.
9. Når alle transplantasjoner er ferdig, legg de transplanterte ormer inn i en 10 ° C inkubator natten.
10. Neste morgen, tar seg ikke å forstyrre pode, avdekke ormen og overføre den (på den svarte filter papir) til en petriskål fylt med planaria vann.
11. Enten la ormen å løsne seg fra filteret papir eller forsiktig fjerne den med pinsett.
12. Endre planarian vannet en gang hver 2-3 dager.

6. Representative Resultater

Umiddelbart etter delvis bestråling planaria vises normal og upåvirket. Avhengig av avgitt dose og geometrien av skjoldet som brukes, kan bestrålt vev regress og selv gå i oppløsning ^7. Skjermet vev skal være intakt. Føllgrunn vev regresjon og tap av vev integritet, vil en blastema danne og manglende strukturer vil bli regenereres (figur 3A). Dersom en amputasjon er gjort i den delvis bestrålt regionen, vil det bestrålte vevet bli reddet (dvs. forhindret fra regressing eller oppløsning) (Figur 3B). I både friske og den amputerte saken gjenfødelse vil bli forsinket i forhold til en amputert ikke-bestrålt planaria (Figur 3C). Hvis en X-ray dose på 30 Gy ble levert og delvis bestrålte dyret var friske, vellykket stamcelleforskningen ablasjon i et mønster tilsvarende med ledelsen skjoldet brukt kan bekreftes 2 til 3 dager etter delvis stråling ved in situ hybridisering for stamcelleforskningen markør Smed-piwi-1 ¹² (aka smedwi-1) (figur 4).

Morgenen etter en transplantasjon, en vellykket pode av det transplanterte vevet bør være åpenbare within verten vev, etter å ha levd opp til både rygg-og ventral flater av verten (Figur 5A). Noen ganger vil pode overholde bare på baksiden eller på framsiden. Dersom transplantasjon var helt mislykket, vil ingen tegn av graftet være synlig fra enten dorsal eller baksiden av verten (Figur 5B). Kort tid etter en vellykket graft av ikke-bestrålt vev til en vert som hadde blitt ablated av stamceller ved dødelig stråling ^13,14, in situ hybridisering for Smed-piwi-1 vil avdekke at stamceller er tilstede primært innen implantat (Figur 5C ). I tillegg vil vellykkede grafts av ikke-bestrålt vev i livsfarlige bestrålte vertene resultere i redning av verten vev og langsiktig overlevelse av verten ^15.

Figur 1. Generell ordning av basiskomponentens for delvis bestråling. I en X-ray irradiator med en topp plassert X-ray kilde (katoden tube) den bedøvet planarian er plassert rett under X-ray kilde innenfor bestråling feltet. For å maksimere X-ray doserate, bør avstanden mellom planarian og X-ray kilde skal minimeres. Et bly skjold bør plasseres mellom katoden røret og bedøvet ormen, så nær ormen som praktisk mulig. Ledningen skjold skal være konstruert, produsert, og plassert slik at den beskytter ønsket vev, men helt utsetter resten av ormen. Mange kommersielle produserer vil produsere tilpassede bly skjold fra enkel design diagram, vi har med hell brukt Alpha Systems Corp (Bluffdale, UT). Ledningen skal være tilstrekkelig tykk for å tillate den ønskede mengden av skjerming. For eksempel, hvis nær komplett skjerming av en 320 kV X-ray strålen er ønskelig, bør ledelsen Be 4,5 til 6 mm tykk. Den planarian og skjold er plassert påen Holtfreter er gjennomvåt filter papir foret petriskål som hviler i en isbøtte. Gitt et tilstrekkelig stort X-ray bestråling feltet og en rekke identiske bly skjold, kan mange eksemplarer være delvis bestråles på en gang (ikke avbildet).

Figur 2. Bygging av utvinning kammeret. (A) En eksploderte visning av vev transplantasjon utvinning kammer, viser alle komponentene som er lagt oppå hverandre etter å ha blitt dynket i kasein mettet Holtfreter løsning. (B) En nesten ferdig utvinning kammer, illustrerer sikringsanlegget plassering av Whatman # 3 papirfilter rektangler som ligger tett omrammer den bedøvet planarian, hindrer bevegelse under healing. Den forsiktige byggingen av oppgangen kammeret hindrer dyr bevegelse og uttørking, fremme rask helbredelse og større effekt av vev transplantasjon.

Figur 3. Representative utfallet av enkle posterior delvis bestråling. Som Dubois beskrevet ^7, (A) når den bakre halvdelen av planarians ble skjermet med bly og deretter utsatt for x-ray bestråling fremre vev ble observert til regress tilbake til grensen mellom det bestrålte og skjermet vev og da upigmentert blastemas dannet og dyrene begynte å regenerere. (B) På den annen side, når dyrene ble halshugget etter samme delvis bestråling utført i (A), ble vev regresjon ikke observert, og de resterende bestrålte fremre vev ble reddet. Den halshugget delvis bestrålte dyr regenerert hoder (B), ble imidlertid gjenfødelse betydelig forsinket i forhold til unirradiated avskårne kontroller (C).

Figur 4. Representant outcomeg delvis stamcelleforskningen ablasjon følger delvis bestråling. Hel-mount In situ hybridisering (WISH) for stamcelleforskningen markør Smed-piwi-1 viser at villtype planaria har stamceller fordelt over hele kroppen med unntak av vevet anterior til fotoreseptorene (pilspiss) og svelget riktig (stjerne) ^14. (A) ønsker Smed-piwi-1 i bestrålt men fullt skjermet kontroll planaria fikset tre dager etter bestråling viser en stamcelle distribusjon som er umulig å skille fra det av villtype planaria. (B) På den annen side, ønsker Smed-piwi-1 i dyr som bare delvis ble skjermet, forlater fremre og bakre utsatt, men ble også fikset tre dager etter bestråling viser at stamceller er ablated fra de ikke-skjermede regioner . Skala linjene er 500 mikrometer.

Figur 5. EXAmples av vellykkede og mislykkede vev transplantasjon. (A) Live bilder av dorsal og ventral utsikt over en vellykket transplantert planarian tre dager etter transplantasjon. Transplantatet (indikert) er godt synlig på begge dorsal og ventral overflater og er omgitt med karakteristiske upigmentert vev ved graft-vertsgrensesnittet. (B) Tilsvarende mislykkede transplantasjoner vise ingen synlig pode vev ved transplantasjon hotellet (markerte) og i stedet viser en helbredet, upigmentert, lateral såret fra den mislykkede transplantasjon. En pode som følger bare dorsal eller baksiden kan ligne en vellykket transplantasjon (A) når man ser fra den ene siden og en mislykket transplantasjon (B) sett fra den andre. (C) Når villtype (wt) vev er podet inn i en bestrålt vert som har blitt ablated av fastboende stamceller og de ​​transplanterte stamcellene er senere avslørt av ønske om Smed-piwi-1 to dager etter transplantasjon,suksessen til transplantasjon vises tydelig ved den spesifikke tilstedeværelse av stamceller bare i eller rundt graftet sted (pilspisser). Skala linjene er 500 mikrometer.

Discussion

Viktigheten av immobilisering

Immobilisering er langt den mest kritiske trinnet for en vellykket gjennomføring av noen av disse prosessene. Hvis planaria har feil immobilisert før delvis bestråling, kan de flytte under ledelsen skjold, produsere inkonsistente og confounding resultater. I tillegg, hvis dyrene er utilstrekkelig immobilisert etter en transplantasjon, vil verten ormen trolig bevege seg bort fra transplantatet vev, noe som resulterer i en fiasko av graftet å gro skikkelig til verten. Riktig immobilisering oppnås ved å justere konsentrasjonen eller lengden på chloretone behandling og temperatur og fuktighet av filteret papir der planaria resten. Chloretone behandlinger på 0,2 prosent av inntil en halv time synes ikke å være giftig, men kan behandlinger av denne lengden indusere utstøting i svelget. Planaria ligge stille og mottakelig for delvis bestråling i løpet av denne tiden. Vår erfaring har vist atfuktighet, snarere enn chloretone behandling, er den mest avgjørende faktoren - for vått og dyrene bevege seg lett, for tørt og dyrene vil desiccate. I alle tilfeller filter papir skal være helt mettet, men ikke til poenget med å lage stående vann i beholderen eller på overflaten. Overflødig væske kan rystes av petriskål. Mengden væske som brukes til å mette filteret papiret vil uten tvil må justeres i henhold til de spesifikke miljømessige fuktighet.

Fart på transplantasjon

Hastighet er viktig å øke effekten av både delvis bestråling og transplantasjon. De lengre delvis bestrålte dyr blir immobilisert jo større er sjansene for en skade eller en seteleie i vev integritet som kan forskyve resultatene av en bestemt analyse. Hastigheten som transplantasjoner er preformed korrelerer grovt med den vellykkede pode rate. Hvis hullet i verten som skal motta transplantatet blir tomtfor lenge, vil de sårede ventrale og dorsale flater begynner å gro til hverandre snarere enn å pode vev, noe som resulterer i en mislykket transplantasjon. I våre hender, transplantatet pluggen bare av og til blir fast i kapillarrør. I de tilfeller, kan pluggen normalt forskyves raskt med fine pinsett eller ved å tvinge luft gjennom kapillærrøret gjennom munnen. Når man blir praktisert med transplantasjon prosedyren, trengte tid til å produsere mange podet dyr kan bli sterkt redusert ved bedøvelse neste donor-vert paret mens pode forrige paret. Ved å utføre anesthetization og transplantasjon samtidig, kan den faktiske tid som er nødvendig for å produsere hver podet dyr slippe til så lite som fem minutter.

Allsidigheten delvis bestråling og transplantasjon

Når vilkårene for anesthetization og delvis bestråling er optimalisert i henhold til de spesifikke eksperimentelle environment og tilgjengelig X-ray irradiator, blir antall forskjellige eksperimenter som kan utføres ved hjelp av delvis bestrålingen teknikken stor. Avanserte bly maskinering teknikker tillate produksjon av ikke bare intrikate bestråling skjold som kan målrette bestemte organer og vev, men også fremstillingen av et stort antall identiske skjold, tillater rask etablering av mange biologiske replikat. Fremtidige undersøkelser vil uten tvil dra nytte av denne metoden for å teste in vivo cellulære responser til lokaliserte stamcelleforskningen ablasjon og funksjonelle forskjeller mellom stamcelleforskningen populasjoner finnes i ulike deler av planarian. Allsidigheten til delvis bestråling, som det gjelder den vitenskapelige spørsmål av interesse, er bare begrenset av dagens bly maskinering teknikker og en fantasi. Derfor kan den sanne kraften av den delvise bestråling teknikken ligge i evnen til nettopp skjerme og ablate nesten enhver annerledes plassertsubpopulasjoner av stamceller.

Mens transplantasjon også gir mulighet for isolering av en undergruppe av stamceller, er det mer betydelig fordel av denne teknikken evnen til å differensielt behandle verten eller donor før transplantasjonen. Behandling av verten eller donor med et medikament eller RNA interferens, vil gi rom for undersøkelse av hvordan ubehandlede transplanterte cellene oppfører seg i en behandlet miljø eller hvordan behandlede cellene oppfører seg i en ubehandlet miljø. Disse typer eksperimenter vil sikkert hjelpe til å skille fra hverandre de autonome og ikke-autonome molekylære bidrag til å demme celle funksjon.

I tillegg, som klassiske pode eksperimenter i planaria har allerede vist ^5,6, er vev transplantasjon en ideell teknikk for å utforske den induktive potensialet til ulike vev under foryngelse. Som planarian forskning entrer molekylær alder, har vi begynt å avdekke svært spesifikk lokalisert uttrykk av important signalmolekyler som direkte styrer regenerering ^16. Transplantere vev som inneholder disse signalmolekyler til ektopiske områder under foryngelse kan hjelpe oss å bedre forstå sin rolle i å styre morphogenesis av regenererende strukturer.

Fordeler med delvis bestråling og vev transplantasjon enn andre teknikker

Foruten de åpenbare spesielle styrker som delvis bestråling og vev transplantasjon har i forhold til hverandre, de gir også spesielle fortrinn framfor andre teknikker som brukes i planarian gjenfødelse feltet. For eksempel har lav dose stråling blitt brukt som en måte å isolere et lite antall stamceller i en ellers stamcelle blottet vert ^4,17, men fordi vi ikke vet hvordan sublethal bestråling påvirker planarian stamceller, kan vi ikke være sikker at de cellulære atferd observert i disse forsøkene er karakteristisk normal.Dette forbeholdet av lavdose bestråling er mindre av en bekymring i delvis bestråling fordi stråling kan være lett dempes mer enn 99 prosent med ledelsen i riktig tykkelse. Dessuten unngår transplantasjon helt dette forbeholdet fordi en liten bestand av stamceller kan isoleres i en stamcelle blottet vert uten noen gang å utsette det transplanterte cellene til stråling. Videre kan den nøyaktige plasseringen av friske stamceller bli kjent og kontrollert både delvis bestråling og transplantasjon, mens cellene overlevende lav dose stråling er plassert tilfeldig i hele dyret. Til slutt, mens én celle transplantasjon har elegant demonstrert den høye potensialet for en enkelt planarian stamcelle ^4, kan vev transplantasjon bevise en like kraftig teknikk fordi det er raskere, mindre kjedelig, og den funksjon og oppførsel av en rekke celler kan observeres samtidig i hver vert. Analysen av en liten bestand av cellerkontra en enkelt celle ikke bare åpner for mer effektiv innsamling av data, men det kan også avsløre celle-celle interaksjoner som ville bli savnet i en enkelt celle transplantasjon analysen.

Konklusjon

Delvis bestråling og vev transplantasjon, selv om gamle teknikker, vil spille en viktig rolle i å dissekere funksjoner planarian stamceller samt de generelle molekylære mekanismene bak gjenfødelse. Modernisering av disse klassiske teknikker har brakt høyere gjennomstrømning og større konsistens, samtidig som for integrering av moderne funksjonelle analyser og molekylære teknikker. Disse klassiske teknikker som en gang ble brukt til å skissere viktige spørsmål av planarian foryngelse kan nå brukes til å finne svarene på disse spørsmålene, og derfor ytterligere vår forståelse av stamcelleforskningen biologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Purpose Transfer Pipette	Samco	691
Capillary tubes (ID 0.75 mm)	FHC	30-30-0
Capillary tubes (OD 0.7 mm)	FHC	30-50-08
Parafilm M	VWR	52858-076
Kimwipes 34155	VWR	500029-891
Black filter paper	Schleicher Schuell	10310809
Whatman #2 filter paper 1002-055	Fisher Scientific	09-810B
Whatman #3 filter paper 1003-185	Fisher Scientific	09-820E
Cigarette rolling paper	Zig-Zag, original	NA
Petri dishes	VWR	82050-544
Forceps DUMONT, INOX #5	FST	11251-20
Chloretone	Sigma Aldrich	112054
Casein	Sigma Aldrich	C3400
Lead Shields	Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT	Custom design
XRAD-320 Biological Irradiator	Precision X-Ray, North Branford, CT	NA