Planarian Immobilisering, Delvis Bestråling, og Tissue Transplantation
Summary
En effektiv metode for pode vev av definerte og konsistente størrelse mellom planaria er beskrevet. Inkludert er også en beskrivelse av hvordan immobilisering teknikken brukt for transplantasjon kan tilpasses, i forbindelse med bly skjold, for delvis bestråling av levende dyr.
Abstract
Den planarian, en ferskvann flatworm, har vist seg å være et kraftig system for dissekere metazoan regenerasjon og stilk cellebiologi 1,2. Planarian regenerering av eventuelle mangler eller er skadet vev er gjort mulig ved adulte stamceller kalles neoblasts 3. Selv om disse stamcellene har definitivt vist seg å være pluripotent og bemerkelsesverdig i stand til rekonstituering en hel dyr 4, heterogenitet innen stamcelleforskningen befolkningen og dynamikken i deres cellulære atferd fortsatt i stor grad uløst. På grunn av det store antallet og bred distribusjon av stamceller i hele planarian kroppen planen, blir avanserte metoder for å manipulere subpopulasjoner av stamceller for molekylær og funksjonelle studier in vivo nødvendig.
Tissue transplantasjon og delvis bestråling er to metoder som en undergruppe planarian stamceller kan isoleres for videre studier. Hver teknikk har klare fordeler. Tproblemet transplantasjon gjør for innføring av stamceller, i et naivt vert, som er enten iboende genetisk distinkt eller har vært tidligere behandlet farmakologisk. Alternativt kan delvis bestråling for isolering av stamceller i en vert, sammenstilt til vev blottet for stamceller, uten innføring av et sår eller seteleie i vev integritet. Ved hjelp av disse to metodene, kan man undersøke cellen autonome og ikke-autonome faktorer som styrer stamceller funksjoner, for eksempel spredning, differensiering, og migrasjon.
Både vev transplantasjon 5,6 og delvis bestråling 7 har blitt brukt historisk i å definere mange av spørsmålene om planarian regenerering som gjenstår under studien i dag. Imidlertid har disse teknikkene forble underused grunn av arbeidskrevende og inkonsekvent natur av tidligere metoder. Protokollene som presenteres her representerer et stort skritt fremover i å redusere den tiden ennd innsats som er nødvendig for å reproduserbart generere store mengder podet eller delvis bestrålt dyr med effektivitet nærmer 100 prosent. Vi dekker kultur av store dyr, immobilisering, forberedelse for delvis bestråling, vev transplantasjon, og optimalisering av dyr utvinning. Videre viser arbeidet som er beskrevet her den første søknaden av den delvise bestråling metode for bruk med den mest studerte planarian, Schmidtea Mediterranea. I tillegg åpner effektiv vev pode i planaria døren for funksjonstesting av subpopulasjoner av naive eller behandlet stamceller i repopulation analyser, som lenge har vært gull-standard metode for å analysere voksen stamcelle potensial i pattedyr 8. Bred bruk av disse teknikkene vil uten tvil føre til en bedre forståelse av de cellulære atferd av adulte stamceller under vev homeostase og regenerering.
Protocol
Discussion
Viktigheten av immobilisering
Immobilisering er langt den mest kritiske trinnet for en vellykket gjennomføring av noen av disse prosessene. Hvis planaria har feil immobilisert før delvis bestråling, kan de flytte under ledelsen skjold, produsere inkonsistente og confounding resultater. I tillegg, hvis dyrene er utilstrekkelig immobilisert etter en transplantasjon, vil verten ormen trolig bevege seg bort fra transplantatet vev, noe som resulterer i en fiasko av graftet å gro skikkelig til ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Chiyoko Kobayashi og Kiyokazu Agata for nyttige råd om planarian transplantasjon, samt tidligere og nåværende medlemmer av Sánchez lab for uvurderlige diskusjoner under utviklingen av disse teknikkene. Dette arbeidet ble støttet av NIH Training Grant (5T32 HD0791) til OCG og NIH R37GM057260 til ASA. ASA er en Howard Hughes Medical Institute etterforsker.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 |
| Black filter paper | Schleicher & Schuell | 10310809 |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H. The regeneration of the tail in lumbriculus. J. Morphol. 7, 317-344 .
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F. Studies on transplantation in planaria. Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).
- Morgan, L. Regeneration of grafted pieces of planarians. J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).
- Dubois, F. Contribution á l ‘ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
