Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos
Summary
Um método eficaz para enxerto de tecido de tamanho definido e consistente entre planaria é descrito. Também incluído é uma descrição de como a técnica de imobilização utilizado para transplante pode ser adaptado, em conjugação com escudos de chumbo, para a irradiação parcial de animais vivos.
Abstract
A planária, um verme de água doce, tem provado ser um poderoso sistema para dissecar regeneração metazoários e haste 1,2 biologia celular. Regeneração planária de quaisquer tecidos danificados ou ausentes é tornada possível pelas células estaminais adultas denominado neoblasts 3. Embora essas células-tronco foram definitivamente demonstrou ser pluripotentes e singularmente capaz de reconstituição de um animal inteiro 4, a heterogeneidade dentro da população de células-tronco ea dinâmica de seus comportamentos celulares permanecem sem solução. Devido ao grande número e distribuição ampla de células-tronco ao longo do plano do corpo planária, métodos avançados para a manipulação de subpopulações de células estaminais para o estudo molecular e funcional in vivo são necessários.
Transplante de tecidos e irradiação parcial são dois métodos pelos quais uma subpopulação de células-tronco planária podem ser isoladas para estudo posterior. Cada técnica tem vantagens distintas. Ttransplante questão permite a introdução das células estaminais, num hospedeiro ingénuos, que são inerentemente qualquer geneticamente distintas ou que tenham sido previamente tratados farmacologicamente. Alternativamente, a irradiação parcial permite o isolamento de células-tronco dentro de um hospedeiro, justaposta ao tecido desprovido de células estaminais, sem a introdução de uma ferida ou qualquer culatra em integridade do tecido. Usando estes dois métodos, pode-se investigar os fatores celulares autónomos e não autónomos que controlam funções de células-tronco, tais como a proliferação, diferenciação e migração.
Tanto o tecido transplante 5,6 e irradiação parcial 7 têm sido usado historicamente na definição de muitas das questões sobre regeneração planária que permanecem em estudo hoje. No entanto, estas técnicas têm permanecido subutilizada devido à natureza trabalhoso e inconsistente de métodos anteriores. Os protocolos apresentados aqui representam um grande passo na diminuição do tempond esforço necessário para gerar reproduzível um grande número de animais enxertados ou parcialmente irradiada com eficácias que se aproximam de 100 por cento. Nós cobrimos a cultura de animais de grande porte, imobilização, a preparação para irradiação parcial, o transplante de tecidos, ea otimização da recuperação de animais. Além disso, o trabalho aqui descrito demonstra a primeira aplicação do método de irradiação parcial para uso com o planária mais amplamente estudados, Schmidtea mediterranea. Além disso, o tecido eficiente enxertia em planaria abre a porta para o teste funcional de subpopulações de células-tronco ingênuos ou tratados nos ensaios de repovoamento, que tem sido o método padrão-ouro de se avaliar o potencial das células-tronco adultas em mamíferos 8. A ampla adoção destas técnicas irá sem dúvida levar a uma melhor compreensão dos comportamentos celulares de células-tronco adultas durante a homeostase e regeneração tecidual.
Protocol
Discussion
Importância da imobilização
A imobilização é, de longe, o passo mais crítico para a conclusão com êxito de qualquer destes processos. Se planaria são indevidamente imobilizado antes da irradiação parcial, podem mover-se sob o escudo de chumbo, produzindo resultados inconsistentes e de confusão. Além disso, se os animais são insuficientemente imobilizada após o transplante, o verme hospedeiro provavelmente afastar-se do tecido do enxerto, o que resulta numa falha do enxerto para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Chiyoko Kobayashi e Kiyokazu Agata para conselhos úteis sobre transplante planária, bem como membros do passado e do presente do laboratório Sánchez para discussões valiosas durante o desenvolvimento dessas técnicas. Este trabalho foi financiado pelo NIH Training Grant (5T32 HD0791) para OCG e R37GM057260 NIH para ASA. ASA é um Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| General Purpose Transfer Pipette | Samco | 691 |
| Capillary tubes (ID 0.75 mm) | FHC | 30-30-0 |
| Capillary tubes (OD 0.7 mm) | FHC | 30-50-08 |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 |
| Kimwipes 34155 | VWR | 500029-891 |
| Black filter paper | Schleicher & Schuell | 10310809 |
| Whatman #2 filter paper 1002-055 | Fisher Scientific | 09-810B |
| Whatman #3 filter paper 1003-185 | Fisher Scientific | 09-820E |
| Cigarette rolling paper | Zig-Zag, original | NA |
| Petri dishes | VWR | 82050-544 |
| Forceps DUMONT, INOX #5 | FST | 11251-20 |
| Chloretone | Sigma Aldrich | 112054 |
| Casein | Sigma Aldrich | C3400 |
| Lead Shields | Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT | Custom design |
| XRAD-320 Biological Irradiator | Precision X-Ray, North Branford, CT | NA |
References
- Morgan, T. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .
- Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Randolph, H. The regeneration of the tail in lumbriculus. J. Morphol. 7, 317-344 .
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Santos, F. Studies on transplantation in planaria. Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).
- Morgan, L. Regeneration of grafted pieces of planarians. J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).
- Dubois, F. Contribution á l ‘ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles. Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).
- Cebria, F., Newmark, P. A. Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development. , 132-3691 (2005).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).
- Miller, W., Kennedy, R. J. X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts. Radiology. 65, 920-925 (1955).
- Pearson, B. J. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).
- Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science. 310, 1327-1330 (2005).
- Stéphan-Dubois, F. Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum. Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).
- Gurley, K. A. Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response. Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).
- Salvetti, A. Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians. Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).
