En Semi-kvantitativ metod för att bedöma biofilmbildning Använda Skrynkliga Colony utveckling

Summary

Vi tillhandahåller en enkel, semi-kvantitativ metod för att undersöka biofilmbildning

Abstract

Biofilmer eller yt-anslutna gemenskaper av celler inkapslade i en extracellulär matris, utgöra en gemensam livsstil för många bakterier. Inom en biofilm, ofta bakterieceller uppvisar förändrats fysiologi, inklusive förbättrad motståndskraft mot antibiotika och andra miljöpåfrestningar ^1. Dessutom kan biofilmer spelar viktiga roller i värd-mikrob interaktioner. Biofilmer utvecklas när bakterier övergången från individ till planktonceller bilda komplexa, multi-cellulära samhällen ^2. I laboratoriet är biofilmer studeras genom att bedöma utvecklingen av specifika biofilm fenotyper. Ett vanligt biofilmen fenotyp innefattar bildningen av rynkiga eller rynkig bakteriella kolonier på fast agar medium ^3. Skrynkliga kolonibildning ger en synnerligen enkel och användbart sätt att identifiera och karaktärisera bakteriestammar uppvisar förändrade biofilm fenotyper, samt att undersöka miljömässiga förhållanden som påverkar biofilm formation. Wrinkled kolonibildning tjänar som en indikator av biofilmbildning i en mängd olika bakterier, inklusive både Gram-positiva bakterier, såsom Bacillus subtilis ⁴ och Gram-negativa bakterier, såsom Vibrio cholerae ^5, Vibrio parahaemolyticus ^6, Pseudomonas aeruginosa ^7, och Vibrio fischeri ^8.

Den marina bakterien V. fischeri har blivit en modell för biofilm formation på grund av den kritiska roll biofilmer under host kolonisering: biofilmer produceras av V. fischeri främja dess kolonisering av Hawaiian Bobtail bläckfisk Euprymna scolopes ^8-10. Viktigt är att biofilmen fenotyper observerades in vitro korrelerar med förmågan hos V. fischeri celler för att effektivt kolonisera värddjur: stammar kränkas i biofilm formation in vitro har en kolonisering defekt ^9,11, medan stammar uppvisar en ökadbiofilm fenotyper förbättras för kolonisation ^8,12. V. fischeri ger därför en enkel modell för att bedöma de mekanismer genom vilka bakterier reglerar biofilm formation och hur biofilmer påverkan värd kolonisering.

I denna rapport beskriver vi en semi-kvantitativ metod för att bedöma biofilm bildning med V. fischeri som modellsystem. Denna metod involverar noggrann observation av bakteriella kulturer vid definierade koncentrationer och volymer på fasta agarmedia; en fläckig kultur är synonymt med en enskild bakteriekoloni. Denna "spotted kultur" teknik kan användas för att jämföra brutto biofilm fenotyper vid enstaka, specifika tidpunkter (end-point analyser), eller för att identifiera och karaktärisera subtila biofilm fenotyper genom tiden-rätters analyser av biofilm utveckling och mätningar av kolonin diametern , vilken är påverkad av biofilmbildning. Således tillhandahåller denna teknik en semikvantitativ analys av biofilmbildning permitting utvärdering av timing och mönstring av rynkig koloni utveckling och den relativa storleken i utvecklingsländerna struktur, egenskaper som sträcker sig utanför den enkla totala morfologi.

Protocol

1. Första karakterisering och överväganden

1. Biofilm formation i allmänhet påverkas av celltäthet och tillväxt. Därför är det nödvändigt att bestämma tillväxthastighet (ökning i optisk densitet (OD) över tid) och utbytet (slutlig cellantal) av stammen (er) av intresse genom att utföra enkel tillväxtkurvan och cellanalyser plätering. Fel i tillväxt, eller brist på samband mellan OD och mobilnummer, måste beaktas när man tolkar resultaten från spotting experiment.
2. Inkludera lämpliga positiva och negativa kontroller på samma platta vid bedömningen skrynkliga kolonibildning, som mindre plåt-till-plåt variation kan påverka biofilm utveckling.
3. Identifiera de bästa förutsättningarna för spotting, dvs de som visar de tydligaste skillnaderna mellan kontroll-och mutant (er) av intresse. Odla stammar i flytande kultur under olika förhållanden, såsom olika medier eller temperaturer och till olika stegs tillväxt (exponentiell eller stationär fas) före spotting. Fläck 10 pl kultur vid olika celltätheter på lämpliga media, och inkubera vid den önskade temperaturen tills kolonimorfologier bli uppenbara.
4. Slutpunkten analys involverar bedömning av skrynkliga kolonibildning vid en förutbestämd tidpunkt efter spotting (dvs 48 timmar). Denna bedömning är användbart för stammar som uppvisar (eller föreslagits uppvisa) allvarliga defekter i biofilm formation.
5. Tidsförloppet Analysen bedömer skrynkliga kolonibildning under en tidsperiod (dvs varje timme) efter spotting. Denna analys medger en semikvantitativ bedömning av biofilmbildning genom att tillåta bestämning av starten av rynkiga kolonibildning och mönstret utveckling över en tidsperiod. Varaktigheten av experimentet och antal insamlingsställen för en given tidsförloppet bör fastställas i preliminära experiment.
6. För att enkelt hålla reda på tiden efter spotting, inställd påImer att räkna upp.

2. Mikroskopisk Bedömning av Skrynkliga kolonimorfologi i V. fischeri

1. Ympa V. fischeri celler till 5 ml LB-salt (LBS)-medium ¹³ (1% [vikt / volym] trypton, 0,5% [vikt / volym] jästextrakt, 2% [vikt / volym] natriumklorid, 50 mM Tris-HCl [ pH 7,5]), innehållande alla nödvändiga antibiotika och Inkubera under skakning, över natten vid 28 ° C. På morgonen subkultur cellerna med en 1:100 utspädning i 5 ml färskt LBS medium och inkubera under samma betingelser tills cellerna har nått önskad OD ₆₀₀ (t.ex. OD ₆₀₀ = 0,2 eller 0,5).
2. Pipettera 1 ml av kulturen i ett mikrofugrör och centrifugera i en mikrofug inställd på maximal hastighet under en minut. Avlägsna supernatanten genom aspiration. Tvätta cellerna för att avlägsna kvarvarande medium och extracellulära komponenter genom att återsuspendera pelleten i 1 ml steril 70 procent artificiellt havsvatten (ASW) (35 mM MgSO _4-7 H2O, 7 mM CaCls_{2-2 H2O,} 210 mM NaCl, 7 mM KCl) och upprepning av centrifugering. Återsuspendera den tvättade pelleten i 1 ml 70% ASW.
3. Att säkerställa att varje prov innehåller samma antal celler, såsom bestämdes genom OD vid 600 nm. Gör alla nödvändiga justeringar genom att späda mer koncentrerade prover med ytterligare 70% ASW. I preliminära experiment, för att på plats kulturer vid olika initiala OD-värden bestämma en optimal start OD för en given uppsättning av stammar eller villkor. De bästa resultaten erhölls för V. fischeri då fläckar genereras från kulturer med en OD på cirka 0,2.
4. Upptäcka 10 pl av de tvättade cellerna på LBS-plattor innehållande alla nödvändiga antibiotika. När spotting en kultur på en tallrik, se till att stadigt pipetten (med fingret) strax ovanför agarytan. Syn vertikalt, inte i en vinkel, och mata ut vätskan långsamt för jämn fördelning av fläcken. Vanligtvis varje stam är fläckig gång per platta (upp till 6 punkter per platta), with flera plattor (2-3) per försök.
5. För att säkerställa att den prickiga kulturen är jämnt fördelade, låt fläcken torka innan du flyttar plattan i inkubatorn. Invertera plattorna och inkubera dem vid 28 ° C.
6. Övervaka morfologin hos den växande fläck timme med början vid 12-15 timmar efter ympning. Vi använder en dissektionsmikroskop (Zeiss STEMI 2000-C) med en kamera fäste (Progres C10 ^PLUS) och Progres CapturePro och ImageJ programvaror för att följa och dokumentera kolonimorfologi och bedöma starten och utvecklingen av rynkig kolonibildning.
7. För de specifika inställningar som anges i steg 2,5 är fläckarna belyses underifrån genom en transparent glas scen med en CL 1500 EG kallt ljuskälla, medan bilderna är tagna från ovan. Denna setup är optimal för avbildning skrynkliga kolonin utveckling, eftersom V. fischeri kolonier (spots) är genomskinliga.
8. I avsaknad av den särskilda utrustning som anges i step 2,5, övervaka rynkig kolonimorfologi med någon dissekeringsmikroskop som tillåter full kolonin visning och har en justerbar ljuskälla och helst en bifogad kamera. Om nödvändigt kan en digitalkamera också användas i frånvaro av en bifogad kamera, men detta är inte optimal.
9. För att på bästa visualisera skrynkliga kolonin utveckling är det nödvändigt att justera både ljusstyrkan och vinkel för eftertanke under de bakteriella kolonierna så att den tredimensionella morfologi u biofilmer kan urskiljas. Bestäm de optimala ljusförhållanden som ger den starkaste kontrasten mellan såg kolonin och det omgivande agar bakgrunden, så att arkitektur (rynkor) i kolonin är klart urskiljbara.
10. I vissa fall måste färgen hos fläckig koloni också beaktas, såsom förändringar i kolonins färg kan uppträda under bildning av biofilm. Justera intensiteten och vinkel ljuskälla för att avslöjadessa subtila förändringar i färg. När väl lämpliga inställningar uppnås bibehålla dem under varaktigheten av försöket.
11. Lägg märke till hur mycket tid förflyter från det att ympning till den tid då skrynkliga kolonibildningen inleder för varje stam eller tillstånd. Definierar starten av veckad kolonibildning som den tidpunkt vid vilken bildningen av mönstring och 3D-strukturer (dvs., strimmor bildar vid den yttre kanten eller "krusningar 'som uppträder i mitten) är först uppenbar. Mutanta celler kan uppvisa minskad eller ökad tid till starten av veckad kolonibildning (t.ex. fig. 2).
12. Dokumentera start och utveckling av skrynkliga kolonibildning genom att fånga lämpliga digitala bilder. Det är viktigt att använda samma förstoringsgrad vid insamling bilder under hela experimentet. Växla utsikten från okularet av mikroskopet till datorn skärmen med spaken på baksidan av kameran. När du växlar mellan okularoch datorskärmen visning justera vyn och fokusera därefter.
13. Före avbildning fläckiga kulturer är locket till Petri-platta typiskt avlägsnas för att tillhandahålla den klaraste bilden. Detta är dock ett valfritt steg, som fläckiga kulturer kan avbildas genom locket med installationen som beskrivs i steg 2.5 och 2.6.
14. Vid varje tidpunkt efter start av skrynkliga kolonibildning Notera mönstret av skrynkliga koloni utveckling. Arkitekturen kan utveckla inifrån och ut, eller utifrån och in Denna bedömning ger en mekanism för att skilja de biofilmer som bildas av olika stammar eller under olika förhållanden.
15. Mäta diametern av att utveckla kolonier vid varje tidpunkt. Detta kan göras manuellt eller digitalt med en tillhörande programvara. Om det görs digitalt, använd Progres CapturePro programmet och först kalibrera skalan bar till den specifika förstoringen som används i försöket. Inkludera skalan baren i varje bild.
16. För att beräkna kolonin diameter med ImageJ programmet öppnar du varje bildfil. Standardisera Skalningsfält så här: Välj "Straight line option" i verktygsfältet. Överlagra den inbäddade Skalstrecket med en rak linje med samma längd och bredd. Välj "Set Skala" från fliken som heter "Analyze". I "kända avståndet" låda, in motsvarande längd (som bestäms av den ursprungliga skalan bar, dvs 2 mm) och välj "OK".
17. Använd "Rak linje" för att infoga en horisontell linje tvärs över platsen. Under Analysera, välj "åtgärd". I det nya Resultat fönster, kommer den beräknade längden tillhandahållas. Erhålla en andra mätning genom att infoga en vinkelrät linje tvärs över fläcken. Ny beräkning diametern. Registrera medelvärdet av de två mätningarna. Diagram den genomsnittliga diametern för varje plats vid varje tidpunkt med ett program som Excel.
18. I slutet av experimentet inträffar antingen vid en specificerad tidpunkt eller när det inte finns någon ytterligareUtvecklingen av biofilmen. När slutet är nådd, konsolidera bilderna till en siffra (or) för att visualisera mönstret utvecklingen över tiden med ett program som Powerpoint.

3. Representativa resultat

I dessa experiment använde vi V. fischeri som modell organism för att studera biofilmbildning genom att utvärdera utvecklingen av rynkiga kolonier på en fast agarytan. Biofilmen-producerande stammar av V. fischeri bildar kolonier med omfattande 3D-arkitektur inom 40 h (Fig. 1) ^8,9,14. Vid undersökning under ett tidsförlopp, blir det uppenbart att skrynkliga kolonibildning av kontrollen stammen initierar så tidigt som ca 12 timmar efter ympning (beroende på de specifika villkor) (Fig. 2) ^9. I motsats härtill är biofilmbildning genom en representativ mutant fördröjd med cirka 4 timmar, inte initiera tills ca 16 timmar efter inokulering ^9. Repeats av dessa experiment tyder på att tidpunkten var relativt konsekvent, vilket gör denna bedömning semikvantitativ ^9. En andra halv-kvantitativ mätning av biofilmbildning utnyttjar den förändring i diameter utveckla koloni över tiden. Såsom visas i fig.. 3A, bildar en representativ biofilm-kompetent stam kolonier som ökar i komplexitet och diameter i förhållande till en representativ stam som inte utgör biofilmer. Noggranna mätningar över tiden för diametrarna för de kolonier som bildats genom dessa två stammar visade att storleken på biofilmen-kompetenta kolonier ökade vid en högre hastighet än de biofilmen-negativa kolonier, och vid slutet tidpunkt de två varierade från nästan 2 - faldigt (Fig. 3B). Även om bilder av en representativ sent tid eller "end-point" kolonimorfologi ofta visas i litteraturen, kan ytterligare, semi-kvantitativa data samlas in som kommer att tillåta en bättre förståelse av biofilmen felet.

Figur 1. Slutpunktsanalys. Denna siffra är ett exempel på en slutpunkt analys med användning av representativa icke-biofilm-bildande (vänster) och biofilm-bildande (till höger) stammar av V. fischeri. Dessa bilder togs vid 40 timmar efter spotting. Dessa bilder erhölls med vildtyp V. fischeri innehåller en vektor kontroll (icke-biofilm-bildande) eller en RSKer överuttryckande plasmid (biofilm-forming) och var en del av de data som samlats in för Morris et al., 2011.

Figur 2. Time-rätters analys. Den övre panelen innehåller representativa bilder av biofilm bildning genom en biofilm-behöriga kontrollorganet stam av V. fischeri över en vald tidsförlopp. Inledande av biofilm formation är tydligt på 12 timmar. Den nedre panelen innehåller representativa iMages av en mutant stam av V. fischeri som uppvisar en fördröjning (4 h) i början av rynkiga kolonibildning över tiden, med biofilm formation initiera vid 16 timmar efter ympning. Notera att vid 40 timmar stammarna likna i intensiteten och mönstring av biofilmbildning, medan små skillnader mellan dessa stammar är endast observeras vid de tidigare tidpunkterna. Dessa bilder erhölls med RSKer överuttrycker vildtyp och mutant sypE V. fischeri celler och var en del av de uppgifter som set in för Morris et al., 2011.

Figur 3. Colony diameter som en semikvantitativ analys av biofilmbildning. (A) Tidsförlopp av biofilmbildning av representativa biofilmen-bildande (övre panelen) och icke-biofilmen-bildande (undre panelen) stammar av V. fischeri. Observera att biofilmen-bildande stam uppvisar en större ökningi diameter över tid i förhållande till den icke-biofilmen bildar stammen. Dessa bilder erhölls med vildtyp V. fischeri innehåller en RSKer överuttryck plasmid (biofilm-bildande) eller en vektor kontroll (icke-biofilm-bildande) och var en del av de uppgifter som samlas in för Morris et al., 2011. (B) En grafisk representation av ökningen i kolonin diameter över tiden av de två stammarna i panel A. Dessa data genereras med hjälp av ImageJ och Excel mjukvara som beskrivs i protokollet.

Discussion

I detta arbete beskriver vi en semi-kvantitativ metod för att bedöma biofilm bildning med V. fischeri som modell organism. Specifikt använder vi ett dissektionsmikroskop med kamera fäste för att övervaka biofilm bildning och utveckling som rynkig kolonibildningen över tiden på en fast agarytan. I detta protokoll, beskriva vi två specifika typer av metoder vi vanligtvis använder för att bedöma skrynkliga kolonibildning. Den första är slutpunkten analys, som tillåter oss att följa finalen, totalt 3D arkitektur, mönstring och diametern på en fläckig kultur i en utvald "sista" tidpunkt. Detta tillvägagångssätt är mest användbar för att bedöma mutantstammar eller tillstånd som leder till dramatiska defekter i biofilmbildning. Men skiljer detta tillvägagångssätt inte mellan mer subtila skillnader som förekommer vid tidpunkter före den valda slutpunkten. För att mer noggrant övervaka skrynkliga kolonibildning, använder vi en analys tidsförloppet för detta, som tillåter oss att identifiera början av wrinkled kolonibildning och titta dess utveckling över tiden. Som en följd av detta synsätt, kan mer subtila skillnader i tidpunkten för skrynkliga kolonibildning, 3D arkitektur och mönstring identifieras. Vi använde denna analys tidsförloppet för att generera två semi-kvantitativa analyser av biofilm formation. Först kan den tidpunkt vid vilken en stam börjar utvecklas 3D arkitektur skall jämföras med den hos kontroll-stammarna. Vi har funnit att den försenade biofilmbildning av en särskild mutant under samma betingelser är tämligen konsekvent ^9. Till exempel, i de data som visas i fig.. 2 uppvisade mutanten genomgående om en 4 timmars försening i att initiera biofilm formation. En andra halv-kvantitativ mätning av biofilmbildning är förändringen i storlek av diametern hos den skrynklade koloni (fläck). Vi har funnit att diametern hos rynkiga kolonier progressivt skiljer sig från den hos icke-biofilm kolonier och nådde omkring en 2-faldig skillnad i slutet tidpunkt (fig. 3 V. cholerae att vissa skrynkliga kolonier resulterar i en betydande ökning kolonin diameter, medan andra inte gör det ^15. Ändå kan bedöma förändringen i diameter över tiden hjälpa till karakterisering av potentiella biofilm mutanter och / eller tillhandahålla en ytterligare kvantitativ mätning av mutanter med förseningar i utvecklingen. Av de två mått på biofilm bildning (tid och diameter), bestämma i början av skrynkliga kolonibildning är mer känslig, men också mer subjektiva, än att fastställa diameter plats. Ändå båda åtgärderna ger en semi-kvantitativ bedömning av en fenotyp som är extremt användbar för biofilm forskarna, men inte lätt mottaglig för quantification.

När du utför fläckiga odlade analyser är det viktigt att beakta de miljömässiga förhållanden under vilka fläckiga stammar odlas. Skrynkliga kolonibildning ofta påverkas av olika miljöfaktorer, bland annat tillgången på näringsämnen, temperatur och luftfuktighet. För att minska variabiliteten mellan experiment, är det bra att standardisera dessa villkor så mycket möjligt (dvs. att standardisera agarplattorna till en viss volym och odling av fläckiga stammar vid en kontrollerad temperatur). För att ytterligare kontroll för variation mellan spotting experiment är viktigt att lämpliga kontrollåtgärder stammarna inom varje uppsättning av experiment. Slutligen, när tolkningen av data från dessa analyser, är det nödvändigt att utföra någon experiment flera gånger (3 +), särskilt vid bedömningen subtila skillnader i skrynkliga kolonibildning (t.ex. en försening i biofilm formation eller skillnader mönstring). Vissa begränsningar i detta protokoll är: 1) fastställbaraIng om celler har en defekt i tillväxten kan vara svårt: tillväxt av celler i flytande kultur kan inte exakt avspegla tillväxttakten på fasta medier, och en noggrann bestämning av tillväxt av biofilm-bildande celler, som kan hålla ihop, kanske inte möjligt, 2) stammar med tillväxt defekter kommer att vara problematiskt att analysera, 3) det kanske inte möjligt att skilja diameter skillnader mellan stammar med subtila biofilm fenotyper, 4) för stammar som inte växer i en koncentrisk ring det inte vara möjligt att noggrant mäta förändringar i diameter, 5) medan mönstring kan observeras under bildning av biofilm, finns det inget sätt att kvantifiera den mönstring av den resulterande biofilmen, och 6) finns det inget sätt att mäta den Z-dimensionen av biofilmen med denna experimentella uppställning . Trots dessa begränsningar ger detta protokoll ändå ett sätt att få numeriska data för att underlätta bedömningen av skrynkliga kolonibildning.

I detta protokoll, använder vi en viss avbildningsystem (dvs. en Zeiss dissektionsmikroskop och Progres CapturePro bildbehandlingsprogram) för att observera och utvärdera skrynkliga kolonibildning. Den avbildande system som beskrivs här är kraftfullt: förmågan att upptäcka i början av skrynkliga kolonibildning och därmed bedöma utvecklingen med ett tidsförlopp tillvägagångssätt kraftigt förbättras genom användning av ett dissektionsmikroskop. Men om denna teknik inte är tillgänglig, kan protokollet anpassas för användning med annan utrustning, inklusive en enkel digital kamera med en zoom fokus. Även om detta protokoll fokuserar på bedömning av rynkiga koloni utvecklingen kan det också ändras för att utvärdera hinna bildas, en form av biofilm som utvecklar när celler växer statiskt i flytande kultur. Detta protokoll kan också visa sig användbar vid bedömningen andra indikatorer på biofilm bildning, inklusive införlivandet av specifika färgämnen i fläckiga kolonierna under biofilm utveckling. Dessa innefattar, men är inte begränsade till, färgämnen såsom kongorött och calcoflueller som kan binda till cellulosa, en vanlig komponent i bakteriella biofilmer ^16. Dessutom detta protokoll, även utvecklats för att användas med V. fischeri, är inte begränsad till denna organism, men kan generaliseras till att studera biofilmbildning i många olika organismer, såsom Bacillus subtilis ^4, Vibrio cholerae ^5, Vibrio parahaemolyticus ^6, och Pseudomonas aeruginosa ^7, vilka alla uppvisar rynkig kolonibildning. Slutligen också kan anpassas för att studera andra kolonimorfologier som har en utvecklande mönster, såsom potentiellt, mönstringen som sker under tillväxt Myxococcus Xanthus ¹⁷ och antennen struktur utveckling i Pseudomonas aeruginosa ^18. Detta protokoll är därför av allmänt bruk på mikrobiologi och biofilm forskare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope	Carl Zeiss, Inc.	45505300000000000	(obtained through Lukas Microscope)
ProgRes C10PLUS	JENOPTIK Optical Systems GmbH	017953-602-26	Camera attachment (obtained through Lukas Microscope)
CL 1500 EC Cold Light Source	Carl Zeiss, Inc.	4355400000000000	(obtained through Lukas Microscope)
ProgRes CapturePro	JENOPTIK Optical Systems GmbH	Free software with registered camera	Computer program for image capture
Image J	National Institutes of Health	Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html	Computer program for diameter measurements