Summary
Den intraluminala mellersta cerebral ocklusion modell i möss häri presenteras. Omfattningen av cerebral infarkt utvärderas genom en neurologisk poäng och kresylviolett färgning, ett alternativ till färgning TTC, erbjuder den stora fördelen att testa parallellt många intresse markörer.
Abstract
Stroke är den tredje orsaken till dödlighet och den ledande orsaken till handikapp i världen. Ischemisk stroke står för ungefär 80% av alla slag. Emellertid är den trombolytiska vävnadsplasminogenaktivator (tPA) den enda behandlingen av akut ischemisk stroke som existerar. Detta ledde forskarna att utveckla flera ischemisk stroke modeller i olika arter. Två huvudtyper av gnagarmodeller har utvecklats: modeller av global cerebral ischemi eller fokal cerebral ischemi. För att efterlikna ischemisk stroke hos patienter, hos vilka cirka 80% trombotiska eller emboliska slag förekommer inom den mellersta cerebral artär (MCA), den intraluminala mellersta cerebral artärocklusion (MCAO) modell är ganska relevant för stroke studier. Denna modell utvecklades först hos råttor med Koizumi et al. Under 1986 1. På grund av hur lätt genmanipulation i möss, har dessa modeller också utvecklats i denna art 2-3.
innehåll "> Häri presenterar vi den övergående MCA ocklusion förfarande C57/BL6 möss. Tidigare studier har rapporterat att fysiska egenskaper tillslutningen som spets diameter, längd, form och flexibilitet är avgörande för reproducerbarhet infarktvolymen 4. Häri har en kommersiell Silikonbehandlad monofilament (Doccol Corporation) har använts. annan stor fördel är att detta monofilament minskar risken för att inducera subaraknoidal blödningar. Med Zeiss stereomikroskop Stemi 2000 var Silikonbehandlad monofilamentgarn införs i den inre halspulsådern (ICA) via ett snitt i den externa halsartären (ECA) tills monofilamentet täpper till botten av MCA. Blodflödet återställdes 1 timme senare genom avlägsnande av monofilamentet att efterlikna återställandet av blodflödet efter lys av en tromboembolisk koagel i människor. Omfattningen av cerebral infarkt kan utvärderas först av en neurologisk poäng och genom mätning av infarktvolymen.Ischemisk möss därmed analyserades för deras neurologiska score vid olika post-reperfusion gånger. För att utvärdera infarktvolymen, färgning med 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) var oftast utförs. Häri använde vi kresylviolett färgning eftersom det ger möjlighet att testa många kritiska markörer genom immunohistokemi. I den här videon, rapporterar vi det MCAO förfarandet, neurologiska poäng och utvärdering av infarktvolymen genom kresylviolett färgning.Protocol
Övergående mellersta cerebral artärocklusion (MCAO)
1. Kirurgi förfarande (figur 1)
Övergående arteria cerebri media ocklusion (tMCAO) utförs på 2 - till 3-månader gamla C57BL / 6 möss (22-28g). Detta protokoll godkändes av IRCM bioetiska kommittén djurvård. Kirurgiska verktyg steriliserades genom autoklavering (121 ° C vid 15 psi under 60 minuter). Mellan varje djur, de steriliseras med användning av heta vulsten autoklaven (15 sek). Kirurgi bord och annan utrustning saneras med 70% etanol.
Två timmar före kirurgi, möss analgesized med buprenorfin (0,03 mg / kg bwip).
Figur 1A.
- Djupt bedöva möss med isofluran 5% och sedan hålla anestesi vid 2,5% isofluran. Kroppstemperaturen hos mössen hålles konstant under operation med en värmedyna.
- Desinficera päls och skin med 70% etanol eller Betadine. Eftersom rakning ger utsläpp hår fragment, microabrasions och inflammation som kan påverka stroke patofysiologi, rakar vi inte mus päls.
- Gör en mittlinje hals snitt och dra försiktigt isär de mjuka vävnaderna.
- Enligt ett stereomikroskop (Stemi 2000, Zeiss), är en trubbig dissektion utfördes för att exponera luftstrupen och dra musklerna att lokalisera halspulsådern.
- Den vänstra gemensamma halsartären (CCA) är noggrant dissekeras från omgivande vävnad och CCA temporärt tilltäppt av en temporär sutur (1) med 5-0 skuren silkesutur i 20 mm segment. Stor försiktighet bör iakttas att inte skada vagusnerven.
- Separera bifurkationen av den vänstra inre gemensamma halsartären (ICA) och yttre gemensamma halsartären (ECA). En permanent sutur (2) placeras runt revisionsrätten, så distalt som möjligt, och en annan tillfällig sutur något snäva (3) placeras på ECA distalt tillbifurkation.
- Fäst vänster ICA (4) med hjälp av en omvänd-action pincett för att undvika blödning. Stor försiktighet bör iakttas att inte skada vagusnerven.
- Skär ett litet hål i ECA (5) mellan permanenta (2) och tillfälliga (3) suturer.
Figur 1B.
- Inför en 12 mm lång 6-0 kisel-belagd (ca 9-10mm är belagd kisel) monofilamentsutur (Doccol Corporation) i ECA (6), helt skära ECA distalt till det fasta suturen och invertera tillslutning i ICA . Suturen är tätt knuten runt monofilamentet att förhindra blödning och omvänd åtgärder pincett tas bort.
- Tillslutningsanordningen införs för att täppa ursprung MCA i kretsen av Willis. Sluta dess införande omkring 9-10 mm utanför bifurkationen i ECA och CCA. Tillslutningsanordningen är blockerad och kan inte röra sig längre. Försiktighet måste iakttas inte penetrera pterygopalatine artären. Suturen (3) på ECA är tightly knuten till fixera monofilamentet i läge.
- Stäng huden med en autoclip sår stängning systemet.
- Injicera 1 ml saltlösning subkutant och placera möss under en infraröd värmelampa under hela efter-ocklusion under (60 minuter).
2. Restaurering av arteria cerebri media Blodflöde
Innan reanesthesia kan neuroscore kontrolleras för att utvärdera framgången med operationen.
- Bedöva mössen som tidigare beskrivits och ta bort autoclips.
- Något öppna suturen (3) på revisionsrätten att tillåta monofilament tillbakadragande och blod reperfusion.
- Permanent fästa den tillfälliga suturen på revisionsrätten att förhindra blodförlust. Den monofilament hålls för återanvändning.
- Avlägsna den temporära suturen (1) på CCA att tillåta blod recirkulation.
- Tillsluta såret. Mössen bör få ytterligare 1 ml saltlösning subkutant.
- Placera möss under den infraröda värmelampa under 1 timme. Efter kontroll av att djuret återfår rörligheten är musen tillbaka till sin bur och vänster under värmedynan och handdukar för 72 timmar. Observera att endast hälften av buren är placerad på värmedynan så att möss att välja sin miljö. Eftersom postoperativ viktminskning observeras i allmänhet, är mosad mat placeras i en petriskål för att uppmuntra att äta.
Tolv timmar efter operationen fick mössen en annan dos av buprenorfin (0,03 mg / kg bwip).
3. Skenoperation
För simulerade operationer, alla förfaranden är identiska förutom att tillslutningen inte är insatt.
4. Neuroscore
Neurologiska bortfall möjliggöra bedömning av framgången för tMCAO strax efter reperfusion och senare bedömning av svårighetsgrad av skadan. Neurologiska bortfall poängsätts som tidigare beskrivits 5 </ Sup> och utförs på 1, 24, 48 och 72 timmar efter reperfusion. En utvidgad sexgradig skala används:
- 0: normal.
- 1: mild cirklande beteende med eller utan inkonsekvent rotation när plockas upp av svansen, <50% försöker rotera till den kontralaterala sidan.
- 2: mild konsekvent cirklande,> 50% försöker rotera till den kontralaterala sidan.
- 3: konsekvent stark och omedelbar cirkling, håller musen en rotationsposition för mer än 1-2 sekunder, med nosen nästan når sin svans.
- 4: svår rotation framåt i barreling, förlust av promenader eller rätande reflex.
- 5: koma eller döende.
5. Kresylviolett färgning (figur 2)
Efter PBS-lösning perfusion, är hjärnor snabbt fryses i isopentan och förvarades vid -80 °C. mushjärnor kan också perfusion med 4% paraformaldehyd (PFA) beroende på de planerade immunohistokemi studierna. Kryostat-snitt av koronala sektioner hjärnan (17 | im) utförs. En del av varje 30 samlas på samma bild för att få en representativ cerebral skada. För volym kvantifiering, är 2 objektglas färgades med kresylviolett färgning och ett bildanalyssystem (Scion Corporation, Frederick, MD) användes för att utvärdera skadan. Skadan Volymen beräknades i godtyckliga enheter (pixlar), och uttrycktes som en procent av den kontralaterala icke-skadade område för varje sektion. Andra objektglas hålls vid -80 ° C för immunohistokemi studier. Alternativt kan PFA-fast hjärnan skäras vid 30-50 um med vibratome och infarktvolymen mätt som rekommenderas av Han et al. (2009) 6.
Representative Results
Den neuroscore Utvärderingen bekräftar framgången med tMCAO efter stroke och bestämmer effektiviteten hos tMCAO efter reperfusion. I våra händer, alla möss utsattes för intraluminala förfarande presenteras åtminstone en mild konsekvent curling (neuroscore 2) och neurologiska bortfall är generellt stabila upp till 72 timmar. De flesta möss uppvisar en mild konsekvent curling (neuroscore 2). Möss som visar frånvaro av curling utesluts från studien. Emellertid tillåter neuroscore utvärderingen inte oss att skilja mellan möss med en skadad hippocampus och de med en intakt hippocampus.
Ingen mortalitet observerades under operationen dagen, vilket tyder på att subaraknoidal blödningar inte inträffa. När subarachnoidalblödning identifieras i en mus, är detta ett systematiskt utesluts från analysen. Användningen av kisel-belagd monofilament från Doccol Corporation, som är mjukare än hem-förberedda monofilament, ökar framgångtMCAO och minskar subaraknoidal blödningar. Dödlighet mellan 24 timmar och 72 timmar är 14% i denna modell, som allmänt rapporterats för 60 minuters ocklusion. Dödligheten observerades beror förmodligen på en stor infarktvolymen i denna musstam. En stark lesion reproducerbarhet har också observerats (standardavvikelse är 15%), vilket är mycket intressant att studera neuroprotektion molekyler där deras effekt (er) kunde döljas av variationer i modellen.
För att utvärdera omfattningen av hjärnskada efter tMCAO, valde vi att använda kresylviolett färgning (figur 2) i stället för TTC för att få en hel del material att testa relevanta markörer 6. Omfattningen av skadan är relativt konsekvent. Men märkte vi att i vissa möss, hippocampus skadade (cirka 30% av möss). Det är intressant att notera att kresylviolett färgning kan appliceras upp till 1 vecka senare. I litteraturen, varierar andelen hjärninfarkt från enstudera till den andra. Det beror på valet av musstammen, anestesi, tjocklek hjärnsektioner, monofilamentet används, eller färgningen används 6, 7.
Figur 1. Systematiken i ocklusion av arteria cerebri media med kisel-belagd intraluminal monofilament. En. Förenklat schema av mushjärna och cerebrala artärer som visar successiva suturer och klipp att förbereda införandet av kisel-belagda monofilamentet. B. ställning av monofilament genom kretsen av Willis representeras. Den monofilament införs i ICA via revisionsrätten att täppa basen av MCA ACA, främre cerebral artär,. BA, basilaris artär, CCA, gemensamma halsartären, C. Willis, Circle of Willis, ECA, extern halspulsådern artery, ICA, intern halspulsådern, MCA, mitten cerebral artär, PCA, bakre kommunicerande artären, PPA, pterygopalatine artär.
Figur 2. Representativa koronala delar av mushjärna färgas med kresylviolett efter 72 timmar efter reperfusion. Infarktområdet (främst striatum, cortex och angränsande områden i hjärnan) visas i vitt (ofärgade av kresylviolett). Skadan volym (vit del, höger hemisfär) var avgränsade och uttrycktes som en procent av den kontralaterala icke-skadade området (vänster hemisfär).
Discussion
Olika stroke modeller har utvecklats för att efterlikna stroke konsekvenser hos patienter. Valet av stroke modell beror på den biologiska frågan. Den intraluminala MCAO-modellen härmar en av de vanligaste typerna av ischemisk stroke hos patienter och är mindre invasiv och mer konsekvent än Tamura modell 4,7. Det är en riktigt intressant modell för neuroprotektion, neurorepair och celldöd analyser. Framgången för den intraluminala modellen beror på många faktorer såsom djur kön, ålder och vikt, temperatur, anestesi och tiden för operationen, som måste kontrolleras. De fysiska proprieties av tillslutningen (tips diameter, längd, form och fexibilitet) är avgörande för samstämmigheten i MCAO 4. Häri använder vi 12 mm långa 6-0 monofilament belagd med silikon på 9-10 mm från Doccol Corporation. Den stora fördelen med denna monofilament är att minska subaraknoidal blödningar och eftersom dess längd omfattade alla ICAlängd, kvarvarande blodflöde, som kommer från de främre och bakre kommunicerande artärerna i Circle of Willis och PPA, förhindras och variationen i de infarktvolym minskar (15% av variationen i våra händer) 8. Suturen CCA minskar även variationen av infarktvolymen 9.
Omfattningen av hjärnskada efter tMCAO kan bedömas genom olika sätt. Neurologiska brister kan mätas såsom tidigare nämnts. Det är emellertid svårt att få en effektiv åtgärd av detta sätt. Omfattningen av infarkt vanligen utförs av TTC färgning. På senare tid har magnetisk resonans tekniker också användas, en särskilt intressant teknik för neuroskyddande behandlingar. För att förstå de underliggande cellulära mekanismer som är involverade vid stroke som neurorepair, celldöd eller cellproliferation, är studiet av olika markörer genom immunhistokemi kritisk och mycket informativt. Sålunda, vår protokollol preparat hjärnan avsnitt har den stora fördelen att dessa analyser och minimerar antalet använda möss. Dessutom Tureyen et al. 10 har rapporterat att det finns god korrelation mellan kresylviolett färgning och TTC.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att lämna ut.
Produktion och fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Zeiss, Inc.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av en CIHR TEAM bidrag # CTP 82.946, en CIHR bidrag # MOP 102.741, samt en Canada stol # 216684 och en Strauss Foundation. ER stöddes av ett stipendium från den kanadensiska Heart & Stroke Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope |  Zeiss |
Stemi 2000 | |
| Fiber-Light High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | ||
| Anesthesia system for isoflurane | |||
| Isoflurane | CDMV | 108737 | |
| Heating blanket | Gaymar Medsearch | TP22G | |
| Infrared heating lamp | |||
| Ultra fine tweezers, style 5 | Electron Microscopy Sciences | 78320-5TI | |
| Vannas Scissors 3 mm Cutting Edge, Straight | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | |
| Style LA-1 and MPF-1 All smooth blades | Electron Microscopy Sciences | 77926-5S | |
| Negative action tweezers, style KOPINC 5 | Electron Microscopy Sciences | 72850-F | |
| Dissecting scissors 5 1/2" Straight | Cedarlane | 72960 | |
| Autoclip starter set | Harvard apparatus | 34-0557 | |
| BD Autoclip Wound Closing Syst., 9mm long,100/pk | Fisher | 01-804-5 | |
| 5-0 suture | Harvard apparatus | 517763 | |
| Suture material PDS II monofilament violet, 5-0, RB-1; Z303H | CDMV | 6167 | |
| 12 mm-long 6-0 silicon-coated monofilament suture | Doccol Corporation | 60SPRePK5 | |
| Seringes 1ml | Fisher | 14-823-2F | |
| Needles 26G1/2 | Fisher | BD-305111 | |
| C57BL/6 mice | IRCM |
References
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. rain infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia. Neuroreport. 5, 293-296 (1993).
- Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia. Stroke. 25, 165-170 (1994).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition. J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia. J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).
- Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor. Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).
- Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke. J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).
- Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).
- Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970, 131-192 (2003).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).
