Summary
बाद मानव जीनोमिक्स युग में, देशी रचना में पुनः संयोजक प्रोटीन की उपलब्धता संरचनात्मक, कार्यात्मक और चिकित्सकीय अनुसंधान और विकास के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम एक परीक्षण और बड़े पैमाने पर मानव भ्रूण गुर्दे 293T कोशिकाओं है कि पुनः संयोजक प्रोटीन की एक किस्म का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली का वर्णन.
Protocol
1. तैयार करने का काम - constructs और सेल संस्कृति
प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, ब्याज की जीन codon स्तनधारी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया है, और एक उचित अभिव्यक्ति मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग वेक्टर में क्लोन होना चाहिए. आदेश में सफल अभिव्यक्ति के लिए उच्चतम मौका सुनिश्चित करने के लिए, ब्याज की जीन के कई वेरिएंट उत्पन्न किया जाना चाहिए. कई स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और विभिन्न शुद्धि टैग है (polyhistidine, hemagglutinin, streptavidin, हेलो - टैग, glutathione एस transferase, दूसरों के बीच) है. हम करने के लिए pDISPLAY वेक्टर, जो एक मजबूत मानव cytomegalovirus प्रमोटर, एक पुलिस महानिरीक्षक स्राव κ संकेत, hemagglutinin शुद्धि टैग के लिए encodes के उपयोग करना पसंद करते हैं, और एक transmembrane सी के टर्मिनल के स्रावी मार्ग के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली पर प्रदर्शन के लिए प्रोटीन लक्षित लंगर है. हम आम तौर पर वेक्टर इनकोडिंग transmembrane ancho के सामने एक बंद codon सम्मिलितआर प्रोटीन वातानुकूलित माध्यम में स्रावित करने के लिए अनुमति देते हैं.
मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं को व्यापक रूप से उपलब्ध हैं, और आसानी से सभ्य और ट्रांसफ़ेक्ट. HEK 293T नियमित रूप से स्तनधारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन biohazardous माना जाता है और जैव सुरक्षा 2 स्तर पर नियंत्रित किया जाना चाहिए. कृपया उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक कपड़े पहनते हैं, एक अनुमोदित जैव सुरक्षा सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करते हुए कैबिनेट में काम किया जाना चाहिए. सब बेकार और सतहों संस्थागत और सरकारी दिशा निर्देशों के अनुसार कीटाणुरहित किया जाना चाहिए. यह अनुशंसा की जाती है कि कोशिकाओं mycoplasma उपयोग करने के लिए पूर्व संदूषण के लिए परीक्षण किया जाना है. कोशिकाओं mycoplasma एसपीपी के किसी भी स्रोत उन्मूलन के लिए दस दिनों के लिए ciprofloxacin (10 μg / एमएल) के साथ इलाज किया जा सकता है. संदूषण. जनरल HEK 293T कोशिकाओं का प्रचार प्रोटोकॉल अलग से प्रस्तुत कर रहे हैं (1 बॉक्स).
परीक्षण और बड़े पैमाने पर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अतिरिक्त विचार reviewe के हैं11-15 में घ.
2. छोटे पैमाने पर टेस्ट अभिव्यक्ति
एक बार constructs के लिए डिजाइन किया गया है और जनित, लघु परीक्षण transfections के HEK 293T कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है, एक प्रक्रिया सारांश योजनाबद्ध नीचे प्रस्तुत है (1 छवि).
- T75 2 सेमी या T225 सेमी 2 सेल संस्कृति बोतल (परीक्षण अभिव्यक्ति के लिए किया जाएगा की संख्या पर निर्भर करता है) का प्रयोग करें HEK 293T कोशिकाओं के विकास और कोशिकाओं को विभाजित हर 2-3 दिन जब कोशिकाओं को 100% मिला हुआ (1 बॉक्स).
- बीज 2.5 x 10 5 6 अच्छी तरह से थाली में HEK 293T अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं और - 1X कलम / strep और 10% (वी /) के साथ 2 मिलीलीटर DMEM जोड़ने FBS, ज़ुल्फ़ थाली धीरे से भी एक अच्छी तरह से सेल प्रसार को सुनिश्चित करने के लिए, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 humidified कक्ष में रात भर सेते हैं.
- जब HEK 293T कोशिकाओं को 40% confluency तक पहुँचने, मीडिया त्यागें और 1X कलम / strep और 10% (v / v) के साथ ताजा 2 मिलीलीटर DMEM है FBS कुओं को जोड़ने. प्रदर्शन करनाअभिकर्मक assays के.
- एक बाँझ 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ट्यूब में 90 μl सीरम - मुक्त DMEM के अशेष भाजक. विंदुक सीरम मुक्त DMEM में 3 μl GeneJuice और धीरे ट्यूब (उंगली भंवर) के मिश्रण. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
- 1 MiniPrep की μg शुद्ध प्लास्मिड डीएनए (डीएनए स्टॉक = 100 एनजी / μl) DMEM - GeneJuice का मिश्रण, उंगली भंवर, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं में जोड़ें.
- अभिकर्मक मिश्रण dropwise HEK 293T कोशिकाओं पर, और 6 अच्छी तरह से थाली ज़ुल्फ़ विंदुक धीरे अभिकर्मक मिश्रण का भी वितरण की अनुमति देने के लिए. 37 ° C पर एक 5% सीओ 2 humidified कक्ष में 6 अच्छी तरह से थाली सेते हैं.
- एक अच्छी तरह से 24 घंटे के लिए 1 मिलीग्राम 1X कलम / strep साथ ताजा DMEM और 10% (v / v) FBS बाद अभिकर्मक और एक और 48 घंटे के लिए सेते हैं (कुल 72 घंटे).
- फसल के तीन दिन बाद अभिकर्मक और microcentrifuge के कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 16,000 जी नमूने में प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीग्राम. बाहर वेस कैर्रीटर्न बॉक्स 2 में विस्तृत रूप धब्बा विश्लेषण. नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है 4 में भंडारण की लंबाई डिग्री सेल्सियस प्रोटीन पर निर्भर है.
3. बड़े पैमाने पर टेस्ट अभिव्यक्ति और शोधन
एक बार एक निर्माण पहचान की गई है पुनः संयोजक प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा अभिव्यक्ति पक्षपाती HEK 293T 10 परत सेल कारखानों (6360 सेमी 2 सतह क्षेत्र छवि 2) का उपयोग कोशिकाओं की पी अभिकर्मक द्वारा हासिल की है. अधिक खोजपूर्ण पढ़ाई के लिए, छोटे सेल कारखानों या टी बोतल (तालिका 1) का इस्तेमाल किया जा सकता है.
- अभिकर्मक एक MaxiPrep प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग करने के लिए डीएनए के 1 मिलीग्राम शुद्ध. एक 500 मिलीलीटर XL-1 ब्लू कोशिकाओं की रात संस्कृति शुद्ध डीएनए के कम से कम 1 मिलीग्राम का उत्पादन करना चाहिए. 260 ए / 280 एक अनुपात को मापने के द्वारा डीएनए की शुद्धता की जाँच करें, 1.8 से ऊपर होना चाहिए.
- 2.0 x 10 8 कोशिकाओं HEK 293T कोशिकाओं को मापें. प्रत्येक T225 सेमी दो कुप्पी 100% confluency सह हो गईntains और ~ 2.25 x 10 7 कोशिकाओं का औसत.
- 5% (v / v) FBS के साथ 1.2 एल DMEM 10 परत एक सेल कारखाने में जोड़ें. सेल कारखाने के लिए 2.0 x 10 8 HEK 293T कोशिकाओं जोड़ें और कोशिकाओं को पोत के सभी परतों के लिए समान रूप से वितरित. सेल कारखाने में कोशिकाओं के confluency कल्पना यह बहुत मुश्किल है. एक विकल्प के रूप में कोशिकाओं का एक उचित संख्या के साथ एक T75 सेमी दो कुप्पी निर्धारित, सतह क्षेत्र का अनुपात एक ही सेल नंबर का उपयोग कर के रूप में 10 - परत पोत के साथ प्रदर्शन. विकास दर के लिए इस फ्लास्क मॉनिटर. सेल कारखाने से निपटने पर शिक्षा के लिए संबंधित वीडियो देखें. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए सेल लगाव और विकास के लिए अनुमति देने के लिए सेते हैं.
- बड़े पैमाने पर अभिकर्मक प्रदर्शन करना जब पक्षपाती HEK 293T कोशिकाओं 70% सहधारा हैं. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक बाँझ T75 सेमी 2 कुप्पी का उपयोग अभिकर्मक पी डीएनए मिश्रण (03:01 w / w डीएनए अनुपात पी) तैयार करें. मिश्रण के बाँझ 1X पीबीएस के 84 मिलीग्राम के साथ डीएनए की 0.84 मिलीग्राम, तो पी (2 2.5 मिलीलीटर जोड़ें.5 मिलीग्राम कुल) पी. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. समाधान बादल बन जाना चाहिए.
- अभिकर्मक पी डीएनए मिश्रण डालो धीरे सेल कारखाने में अच्छी तरह से खत्म हो पोत के सभी परतों को वितरित. वैकल्पिक: अभिव्यक्ति की पैदावार में वृद्धि के लिए, valproic एसिड (4 मिमी अंतिम एकाग्रता) जोड़ें. 37 ° सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ चार दिनों के लिए सेते हैं.
- फसल सतह पर तैरनेवाला चार के बाद अभिकर्मक दिन. 6000 एक्स जी पर वातानुकूलित मीडिया 4 बजे 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस इसके अलावा एक 0.22 माइक्रोन Stericup, वैक्यूम फिल्टर उपकरण का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला फिल्टर. 10 सेल परत कारखाने reused किया जा सकता है, निर्देशों की सफाई के लिए बॉक्स 3 देखें. यह महत्वपूर्ण है कि सफाई सतह पर तैरनेवाला फसल के बाद तुरंत शुरू की है, कोशिकाओं को पोत सतह पर शुष्क नहीं.
- 75 मिलीलीटर Centramate स्पज्या का प्रवाह निस्पंदन प्रणाली का उपयोग करने के लिए सतह पर तैरनेवाला ध्यान लगाओ.
- पीबीएस की 500 मिलीलीटर जोड़ें और 75 मिलीग्राम के लिए फिर से ध्यान केंद्रित. दोहराएँ तीन additional बार पूरी तरह से बफर नमूना आदान प्रदान.
- 1 मिलीग्राम विरोधी हा 1X पीबीएस के साथ संबंध स्तंभ संतुलित करना और केंद्रित नमूना दर पर गुरुत्वाकर्षण प्रवाह <1 मिलीग्राम / मिनट से लागू होते हैं.
- पीबीएस Tween20 1X 30 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें.
- 1X पीबीएस (1.0 मिलीग्राम / एमएल) में हा पेप्टाइड भंग करने और 37 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस
- स्तंभ विरोधी - हा हा पेप्टाइड 1 मिलीलीटर लागू और पेप्टाइड राल में प्रवाह करने की अनुमति है. के माध्यम से प्रवाह लीजिए. प्रवाह बंद करो जब पेप्टाइड समाधान बिस्तर ऊंचाई तक पहुँच है.
- 37 ° सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पूरे विरोधी हा स्तंभ सेते हैं.
- 12 दो अतिरिक्त समय के चरण दोहराएँ.
- विरोधी हा स्तंभ और राल में प्रवाह 1X पीबीएस के 1 मिलीग्राम लागू तक बिस्तर ऊंचाई तक पहुँच. के माध्यम से प्रवाह लीजिए.
- 10 मिलीलीटर 0.1 एम ग्लाइसिन 2.2 पीएच के साथ हा स्तंभ विरोधी पुनर्जन्म. 4 में 3 ° 0.02% (w / वी) के साथ पीबीएस में सी NaN 10 मिलीलीटर पीबीएस और दुकान संबंध स्तंभ के साथ धो लें.
- एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण और च पूल प्रदर्शनतदनुसार ractions. नोट: हा पेप्टाइड प्रोटीन एकाग्रता माप के साथ एक 280 या ब्रैडफोर्ड द्वारा हस्तक्षेप करेगा. एसडीएस पृष्ठ जेल पर एक मानक के रूप में उपस्थित प्रोटीन की राशि, लोड 5, 10, 15, BSA के 25 μg का अनुमान बैंड तीव्रता की तुलना करें.
9-17 कदम वातानुकूलित माध्यम से अतिरिक्त प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए दोहराया जा सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
इस अनुच्छेद में, हम वर्णन और मिलीग्राम की मात्रा मानव प्रोटीन है कि बाद में संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के उत्पादन के लिए एक सुविधाजनक अभिव्यक्ति मंच का प्रदर्शन. मानव प्रोटीन की स्क्रीनिंग 6 अच्छी तरह से प्लेट में HEK 293T कोशिकाओं का उपयोग का निर्माण बड़े पैमाने पर उत्पादन करने के लिए उत्तरदायी constructs की पहचान करने में कुशल और प्रभावी है. वाणिज्यिक अभिव्यक्ति वैक्टर HEK 293T अभिकर्मक अभिकर्मकों की एक किस्म का उपयोग कर GeneJuice, FuGene एच.डी. या पीई के रूप में कोशिकाओं, में ट्रांसफ़ेक्ट कुशलता से किया जा सकता है मैं हम एक वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग की सलाह देते हैं, GeneJuice या FuGene एच.डी. के रूप में, परीक्षण अभिव्यक्ति के लिए, के रूप में इन अभिकर्मकों गरीब व्यक्त प्रोटीन छवि (3) के लिए अधिक प्रभावी हैं. बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए चयनित constructs एक एकल, मजबूत तीव्रता बैंड द्वारा लक्षण वर्णन किया जाना चाहिए, पश्चिमी धब्बा छवि (3) पर उचित आणविक वजन करने के लिए इसी. Glycoproteins व्यापक विविधता ग्लाइकोसिलेशन में कारण बैंड के रूप में विस्थापित कर सकते हैं. हम पता चला है कि अणुओं की एक किस्म, वायरल glycoproteins, साइटोकिन्स, साइटोकाइन रिसेप्टर्स, और अन्य सतह प्रोटीन से लेकर, और व्यक्त किया जा सकता है प्रोटीन की millgram मात्रा यह सामान्य अभिव्यक्ति मंच का उपयोग कर छवि (4) उपज शुद्ध.
चित्रा 1 लघु transfections के वर्कफ़्लो योजनाबद्ध.tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2. Corning बड़े पैमाने पर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए 10 परत CellSTACK. प्रत्येक परत 636 सेमी 2 सेल लगाव के लिए सतह क्षेत्र शामिल हैं. एक मानक प्रयोगशाला सीओ 2 इनक्यूबेटर (6.0 घन फीट) आराम से चार 10 परत सेल कारखानों का आयोजन करेगा.
. GeneJuice, FuGene HD और पी (क) पश्चिमी धब्बा चयनित मानव सेलुलर प्रोटीन की स्क्रीनिंग (tetherin), रिसेप्टर्स: चित्रा 3 लघु विभिन्न secreted प्रोटीन की अभिव्यक्ति हम छोटे पैमाने पर परीक्षण अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए आम अभिकर्मक अभिकर्मकों की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया. (आईएल 2R β सबयूनिट) और साइटोकिन्स (आईएल -2). Tetherin एक मानव झिल्ली glycoprotein कि की रिहाई को प्रतिबंधित करता हैनवजात एचआईवी 1-16 virions. tetherin की कोशिकी डोमेन ~ 36 केडीए की एक ग्लाइकोसिलेटेड, डाइसल्फ़ाइड से जुड़े डिमर के रूप में मौजूद है. स्थिति को कम करने, जैसा कि यहाँ दिखाया तहत, tetherin ~ 22 केडीए की एक स्पष्ट आणविक भार के साथ एक monomer के रूप में migrates. 2 - इंटरल्युकिन (आईएल -2) (~ 17 केडीए) साइटोकाइन में लिम्फोसाइट 17 प्रसार में शामिल है. यह आईएल -2 रिसेप्टर परिसर के साथ सूचना का आदान प्रदान है, जो आईएल-2R βsubunit की (~ 26 केडीए) एक 18 घटक है. CD21 एक झिल्ली प्रोटीन सक्रियण और पूरक प्रणाली द्वारा बी कोशिकाओं की परिपक्वता में शामिल है, और Epstein-बर्र वायरस के लिए एक रिसेप्टर है. CD21 की ग्लाइकोसिलेटेड कोशिकी डोमेन ~ 20 केडीए की एक स्पष्ट आणविक भार के साथ एक monomer के रूप में चयनित सतह वायरल glycoproteins (XMRV पर्यावरण और ebolavirus जीपी) (ख) पश्चिमी धब्बा स्क्रीनिंग के migrates. XMRV और ebolavirus glycoproteins (transmembrane लंगर नष्ट कर दिया) से trimeric spikes के रूप में वायरल झिल्ली में मौजूद हैं और मेजबान सेल लगाव में शामिलऔर संलयन. XMRV लि और EBOV जीपी ectodomain भारी एन जुड़े glycans के साथ सजाया जाता है और 70 केडीए और 75 केडीए के स्पष्ट आणविक भार पर विस्थापित, क्रमशः.
चित्रा 4. बड़े पैमाने पर HEK 293T संस्कृतियों से मानव सेलुलर प्रोटीन शुद्ध. सभी प्रोटीन 10 परत एक सेल कारखाना का उपयोग कर व्यक्त किया गया है, और ध्यान केंद्रित किया है और विरोधी हा क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध. के रूप में Coomassie से सना हुआ एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण से दिखाया गया है, रिसेप्टर interleukin-2 के कोशिकी डोमेन (आईएल 2R) α और γ सब यूनिटों क्रमश: 40 केडीए और 46 केडीए की आणविक भार पर विस्थापित,. tetherin की कोशिकी डोमेन डिमर रूप migrates, गैर को कम करने की शर्तों के तहत, 36 केडीए की एक स्पष्ट आणविक वजन के साथ. ध्यान दें कि वहाँ कुछ बीएसए संदूषण है कि 60 केडीए की एक स्पष्ट आणविक भार पर प्रकट होता है. इसके अलावा, एन - लिंक्ड glycans की विविधता tetherin पर मौजूद है,आईएल 2R α और आईएल 2R γ का कारण बनता है बैंड एसडीएस पृष्ठ पर जेल विस्तार. इन जटिल प्रकार एन जुड़े glycans पेप्टाइड का उपयोग कर हटाया जा सकता है: एन glycosidase एफ
| पोत | सतह क्षेत्र |
| 6 अच्छी तरह से थाली | 9.5 2 सेमी (प्रत्येक अच्छी तरह से) |
| 100 मिमी व्यंजन | 55 2 सेमी |
| 245 मिमी व्यंजन | 500 2 सेमी |
| T75 सेमी दो कुप्पी | 75 2 सेमी |
| T175 सेमी दो कुप्पी | 175 2 सेमी |
| T225 सेमी दो कुप्पी | 225 2 सेमी |
| बोतल नियमित रोलर | 850 2 सेमी |
| रोलर सतह बोतल - विस्तार | 1700 2 सेमी |
| 1 परत CellSTACK के | 636 2 सेमी |
| 2 परत CellSTACK प्रकार | 1272 2 सेमी |
| 5 परत CellSTACK के | 3180 2 सेमी |
| 10 परत CellSTACK के | 6360 2 सेमी |
| 40 परत CellSTACK के | 25,440 2 सेमी |
तालिका 1. सेल संस्कृति प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जहाजों की तुलना.
अभिकर्मक व्यंजनों की सूची
100X Ciprofloxacine 10 मिलीलीटर समाधान के लिए, 10 मिलीग्राम ciprofloxacine के 10 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी जोड़ें. 10 μl 6N एचसीएल जोड़ें ciprofloxacine के लिए पूरी तरह से भंग है.
पी (1 मिलीग्राम / एमएल) एक 100 मिलीलीटर के समाधान के लिए विआयनीकृत पानी और गर्मी में 80 से 25 रैखिक पी केडीए की 100 मिलीग्राम भंग डिग्री सेल्सियस कमरे के तापमान को शांत समाधान, 7.2, 0.22 माइक्रोन फिल्टर बाँझ बनाना, और -20 पर अशेष भाजक फ्रीज पीएच को समायोजित करने के लिए ° सी लंदन के लिएभंडारण जी अवधि.
1X पीबीएस 8.0 छ NaCl, 0.2 ग्राम KCl, 1.4 जी ना 2 4 HPO (निर्जल), 0.24 जी के.एच. 2 4 पीओ: 1 एल जलीय समाधान के लिए. 7.4 समाधान के पीएच को समायोजित करें और 1.0 एल को भरने
8.0 छ NaCl, 0.2 ग्राम KCl, 1.4 जी ना 2 4 HPO (निर्जल), 0.24 जी के.एच. 2 4 पीओ, 1 मिलीग्राम बीच-20: 1X 1 एल जलीय समाधान के लिए पीबीएस बीच-20. 7.4 समाधान के पीएच को समायोजित करें और 1.0 एल को भरने
3.0 छ Tris आधार, 14.4 छ ग्लाइसिन, 150 मिली मेथनॉल: 1X 1 एल जलीय समाधान के लिए स्थानांतरण बफर.
3.0 छ Tris आधार, 14.4 छ ग्लाइसिन, 1.0 ग्राम एसडीएस: 1X एसडीएस - पृष्ठ 1 एल जलीय समाधान के लिए बफर चल रहा है.
0.6 छ एसडीएस, 3 मिलीग्राम ग्लिसरॉल, 1.8 मिलीग्राम 1.0 Tris - एचसीएल पीएच 6.8, 1 मिलीग्राम bromophenol नीला, 5% (v / v) 2 - mercaptoethanol: एसडीएस - 10 मिलीलीटर समाधान के लिए नमूना बफर को कम करने.
- Dulbecco संशोधित ईगल (37 ° C पर 10 (v / v)% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1X कलम / strep के साथ एक 5% सीओ 2 - humidified वातावरण में पूरक DMEM) मध्यम में HEK 293T कोशिकाओं को विकसित.
- एक औंधा खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करते हैं. जब कोशिकाओं 100% confluency के हैं, हटाने, और संस्कृति मध्यम त्यागने.
- बाँझ 1X पीबीएस की 5 मिलीग्राम सीरम का निशान हटाने के साथ कोशिकाओं कुल्ला. पीबीएस धो त्यागें.
- 0.05% की 2 मिलीग्राम (w / v) trypsin EDTA T225 सेमी 2 कुप्पी (या 0.05% की 1 मिलीग्राम (w / v) T75 सेमी दो कुप्पी के लिए trypsin EDTA) के लिए समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं को अलग सतह से. यह भी संभव के बाँझ पीबीएस EDTA के 1X का उपयोग HEK 293T कोशिकाओं को अलग.
- 10% (v / v) FBS के साथ T225 सेमी 2 कुप्पी (या 10% के साथ 9 DMEM की मिलीलीटर (वी /) T75 सेमी के लिए FBS दो कुप्पी) DMEM के 13 मिलीलीटर trypsin प्रतिक्रिया को बाधित करने के लिए जोड़ें.
- ग भाजितells 01:05. एक T225 सेमी दो कुप्पी के लिए, ताजा DMEM 27 मिलीलीटर 1X / कलम strep FBS और 10% (v / v) के साथ एक नई संस्कृति पोत में सेल निलंबन के 3 मिलीग्राम जोड़ने. एक T75 सेमी दो कुप्पी के लिए, ताजा वृद्धि मीडिया की 8 मिलीग्राम सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर जोड़ें. 37 ° C पर एक 5% सीओ 2 - humidified वातावरण में संस्कृतियों सेते हैं. कोशिकाओं 100 confluency% करने के लिए दो दिनों के भीतर हो जाना चाहिए.
बॉक्स 2. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण
- 10 μl एसडीएस पृष्ठ को कम करने नमूना बफर 30 μl सेल सतह पर तैरनेवाला संस्कृति जोड़ें. लोड नमूने और prestained polyacrylamide, जैल और electrophorese के 1 घंटे के लिए 175 वी पर या आणविक वजन मार्करों तक एसडीएस पृष्ठ चल रहा है बफर 1X का उपयोग करने पर आणविक वजन मार्कर अच्छी तरह से हल कर रहे हैं.
- 100% मेथनॉल में 1 मिनट के लिए सक्रिय करने के लिए PVDF झिल्ली Immobilon पी लेना.
- पश्चिमी धब्बा उपकरण इकट्ठे. सुनिश्चित करें PVDF झिल्ली सकारात्मक इलेक्ट्रोड चेहरे और सभी घटकों 1X हस्तांतरण बफर के साथ गीला रखना. Avopolyacrylamide जेल और झिल्ली के बीच आईडी बुलबुले.
- पूरी तरह से में 1X हस्तांतरण और 1 घंटे के लिए बफर हस्तांतरण के साथ 100 पर वैद्युतकणसंचलन कक्ष को भरने वी.
- पीबीएस-1X Tween20 में 5% (w / v) मलाई निकाला दूध के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए झिल्ली ब्लॉक करने के लिए, या रात भर के 4 साल में डिग्री सेल्सियस
- मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी 1:1000 कमजोर पड़ने विरोधी हा मैब या अन्य उपयुक्त एंटीबॉडी) 5% (w / वी) में स्किम दूध भंग में पीबीएस-1X Tween20 में 4 बजे कमरे के तापमान में 1 घंटे या रात भर के लिए डिग्री सेल्सियस के साथ सेते हैं
- 10 मिनट के लिए पीबीएस Tween20 1X में झिल्ली धो लें. दो अतिरिक्त बार दोहराएँ.
- एक मोनोक्लोनल माध्यमिक कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए alkaline फॉस्फेट (5% में 1:1000 मन्दन (w / वी) - पीबीएस-1X Tween20 में स्किम दूध) के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ सेते हैं, या रात भर के 4 साल में डिग्री सेल्सियस
- 10 मिनट के लिए पीबीएस Tween20 1X में झिल्ली धो लें. दो अतिरिक्त बार दोहराएँ.
- एक छोटे कंटेनर में झिल्ली प्लेस, 5 मिलीलीटर alkaline फॉस्फेट substra जोड़ने केते समाधान (BCIP / एनबीटी). रंगीन विकास 1-5 मिनट के भीतर हो जाना चाहिए. एक बार वांछित बैंड तीव्रता तक पहुँच जाता है, विआयनीकृत पानी और शुष्क हवा के साथ धो लो. रंगीन समय के साथ फीका हो सकता है, इलेक्ट्रॉनिक एक बार सूखा झिल्ली स्कैन.
3 बॉक्स. सफाई और रीसाइक्लिंग के सेल संस्कृति वाहिकाओं
जबकि सेल कारखानों एकल उपयोग करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, इन जहाजों के अतिरिक्त बड़े पैमाने पर निम्न सफाई प्रोटोकॉल का उपयोग transfections के लिए पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है:
- 10 परत सेल कारखाने से सतह पर तैरनेवाला decanting के तुरंत बाद, 20 (v / v)% ब्लीच जोड़ने और सख्ती से हिला के लिए कोशिकाओं को अलग. तीन घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- पोत खाली और ताजा 20% ब्लीच (v / v) और कमरे में रात के तापमान पर सेते हैं जोड़ने.
- पोत खाली और विआयनीकृत पानी की 1.5 एल के साथ धो. तीन बार दोहराएँ.
- खाली कक्ष 10 परत कारखाने और बाँझ 1X पीबीएस के 0.5 एल जोड़ने के साथ 10 पूरकएक्स एंटीबायोटिक / कवकनाशी समाधान. कमरे के तापमान पर पोत स्टोर और बंदरगाहों (मानक 33 मिमी पिरोया कैप) अगले उपयोग करने के लिए पहले भरने के लिए निकाल टोपी की जगह. नोट: सभी परतों को पूरी तरह से साफ सफाई के बाद होना चाहिए, नहीं तो का उपयोग करने के लिए, और नहीं निपटान के संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार सेल कारखाना.
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Discussion
10 परत सेल कारखानों मिलीग्राम प्रोटीन की मात्रा के उत्पादन के लिए एक प्रभावी पोत हैं. रोलर की बोतलें, हिला बोतल या स्पिनर बोतल के रूप में अन्य परंपरागत वाहिकाओं, पर सेल कारखाने का उपयोग करने का एक बड़ा फायदा है कि वे किसी भी अतिरिक्त प्रयोगशाला उपकरणों की खरीद की आवश्यकता नहीं है. एक मानक सीओ 2 इनक्यूबेटर (~ 6.0 घन फीट) आसानी से चार 10-परत सेल कारखानों (छवि 2) को समायोजित करेगा. इसके अलावा, इन जहाजों और बर्तन, बोतल या रोलर के लिए कोशिकाओं और प्रोटीन का उत्पादन बोतलों से कम श्रम स्थान की आवश्यकता होती है, एक कक्ष 10 परत कारखाने 7.5 नियमित रोलर बोतलों (तालिका 1) का उपयोग करने के लिए बराबर है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, HEK 293T कोशिकाओं वाहिकाओं में अच्छी तरह से अनुकूलित और उच्च पी द्वारा क्षणिक अभिकर्मक के लिए उत्तरदायी हैं, इस प्रकार वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मकों के लिए एक कम लागत और प्रभावी विकल्प प्रदान करते हैं. जबकि सेल कारखानों डिस्पोजेबल सेल संस्कृति plasticware तैयार हो रहे हैं, हम ख हैसाफ करने के लिए कुशलतापूर्वक और फिर से इन जहाजों का उपयोग संदूषण मुद्दों के बिना कई बार, इस प्रकार काफी उपयोग प्रति अपनी लागत को कम करने में सक्षम een. क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति का उपयोग कर 10 - परत एक सेल कारखाना ~ प्रोटीन शुद्ध छवि (4), प्रोटीन और अपने संशोधनों के आधार पर से 1-10 मिलीग्राम उत्पादन करने में सक्षम है. यह क्लोनिंग और छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति से बड़े पैमाने पर और के बारे में 3-4 सप्ताह में अभिव्यक्ति शुद्धि के पूरा करने के लिए जाना संभव है. सारांश में, यह एक तेजी से, सामान्य मंच है कि से स्रावित मानव या वायरल सतह प्रोटीन के उत्पादन में अत्यधिक उपयोगी है. इसके अलावा, इस मंच में भी एंटीबॉडी, वायरस के कणों की तरह, और adenoviruses और जीन स्थानांतरण के लिए lentiviruses को व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम आम समस्याओं और संभावित समाधानों के नीचे सूचीबद्ध किया है. एक अधिक विस्तृत समस्या निवारण मार्गनिर्देशिका के लिए 14, कृपया देखें.
- नहीं या बहुत कम प्रोटीन अभिव्यक्ति:
- गरीब घंटेकोशिकाओं दाग और mycoplasma संदूषण के लिए व्यवहार्यता परीक्षण के लिए trypan नीले रंग का उपयोग कर कक्षों की ealth. यदि कोशिकाओं एक उच्च मार्ग संख्या (> 25 अंश) है और कर रहे हैं धीरे धीरे से बढ़ रहा है, नई HEK 293T कोशिकाओं के साथ नए सिरे से शुरू. अभिकर्मक दक्षता और प्रोटीन के उत्पादन संस्कृति में कोशिकाओं की उम्र से प्रभावित कर रहे हैं.
- गरीब क्षणिक अभिकर्मक कक्ष 40% confluency स्तर पर ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना चाहिए. अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए डीएनए के अनुपात अनुकूलित किया जाना चाहिए.
- प्रोटीन अस्थिर या नहीं अघुलनशील प्रोटीन के लिए सेल गोली मुड़ा. है. टेस्ट अन्य constructs या मुताबिक़ प्रोटीन की अभिव्यक्ति.
- कोई प्रोटीन स्तंभ से eluted है:
- प्रोटीन 0.1 एम ग्लाइसिन पीएच 2.2 के साथ स्तंभ Elute पर ब्याज की प्रोटीन को बनाए रखा और पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण. यदि प्रोटीन बनाए रखा है, क्षालन के लिए सिंथेटिक हा पेप्टाइड के एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करें या लंबी अवधि के लिए 37 ° C पर स्तंभ को सेते हैं.
- विरोधी हा गolumn क्षतिग्रस्त जबकि है स्तंभ, अगर साफ और ठीक से संग्रहीत, कई बार reused किया जा सकता है, स्तंभ की क्षमता समय के साथ कम हो जाएगा. विरोधी हा एक नया स्तंभ का उपयोग करें.
- प्रोटीन protease inhibitors गिरावट और बर्फ पर पूरे शोधन प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन रखना.
- प्रोटीन या उपजी पर एकत्रित स्तंभ यदि प्रोटीन अस्थिर है, अलग constructs या बफर स्थितियों (अर्थात् पीएच, लवण, additives, आदि) प्रोटीन स्थिरता में सुधार करने की कोशिश.
- प्रोटीन स्तंभ हा टैग या दफन किया जा सकता है दुर्गम बाध्य करने में विफल रहा है. के माध्यम से देखने के लिए कि प्रोटीन के प्रवाह में नहीं है या धोने की जाँच करें.
- सीरम albumin संदूषण:
सीरम albumin गोजातीय (BSA) विरोधी हा राल के लिए गैर - विशेष रूप से बाँध और हा पेप्टाइड elutions दूषित हो सकता है जाता है. छवि में. 4, BSA ~ 60-65 केडीए की एक स्पष्ट आणविक भार पर एक कॉम्पैक्ट बैंड के रूप में उत्प्रवासित. इस मामले में, 1X पी में 20 एकाग्रता बीच में वृद्धिबी एस Tween20 0.2% (v / v) धोने और धोने की मात्रा में वृद्धि. वैकल्पिक रूप से, बीएसए संदूषण आकार अपवर्जन या आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर हटाया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम हा, FCA, और जे डी सी के लिए एक ओंटारियो एचआईवी उपचार नेटवर्क अनुसंधान ऑपरेटिंग (रोग - G645) अनुदान और स्वास्थ्य अनुसंधान अन्वेषक पुरस्कार (MSH 113,554) की कनाडा के संस्थानों jel करने के लिए, और टोरंटो विश्वविद्यालय की फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों के स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट (ला Jolla, CA) में Marnie Fusco, Dafna Abelson और डॉ. एरिका Ollmann Saphire प्रदान कोशिकाओं, ebolavirus जीपी अभिव्यक्ति वेक्टर और सामान्य सलाह के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0x10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab')2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
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