Summary
I det post-menneskelige genomikk æra, er tilgjengeligheten av rekombinante proteiner i innfødt konformasjonen avgjørende strukturelle, funksjonelle og terapeutisk forskning og utvikling. Her beskriver vi en test-og storskala protein uttrykk system i humane embryonale nyre 293T celler som kan brukes til å produsere en rekke rekombinante proteiner.
Abstract
Rekombinant protein uttrykk i bakterier, typisk E. coli, har vært den mest vellykkede strategi for milligram mengde uttrykk av proteiner. Men prokaryote vertene er ofte ikke så egnet for uttrykk av menneskelige, virale eller eukaryote proteiner grunn toksisitet av den utenlandske macromolecule, forskjeller i protein folding maskiner, eller på grunn av mangel på spesielle co-eller post-translasjonell modifikasjoner i bakterier. Expression systemer basert på gjær (P. pastoris eller S. cerevisiae) 1,2, Baculovirus-infisert insekt (S. frugiperda eller T. Ni) 3 celler, og celle-free in vitro oversettelse systemer 2,4 har blitt brukt til å produsere pattedyr proteiner. Intuitivt er det beste kamp å bruke en pattedyr vert å sikre produksjon av rekombinante proteiner som inneholder de riktige posttranslasjonelle modifikasjoner. En rekke pattedyr cellelinjer (humane embryonale KidNey (HEK) 293, har C V-1 celler i O rigin bærer S V40 larget T-antigen (COS), kinesisk hamster ovarieceller), og andre) blitt brukt til å overuttrykker milligram mengder av en rekke menneskelige proteiner 5-9. Men fordelene ved å bruke pattedyrceller ofte motvirkes av høyere kostnader, krav til spesialisert laboratorieutstyr, lavere protein avkastningsmål, og lange tider for å utvikle stabile uttrykk cellelinjer. Økende avkastning og produsere proteiner raskere, samtidig som vi holder kostnadene nede, er viktige faktorer for mange akademiske og kommersielle laboratorier.
Her beskriver vi en tid-og kost-effektiv, todelte prosedyre for uttrykket av utskilt menneskelige proteiner fra heftende hek 293T celler. Dette systemet er i stand til å produsere mikrogram til milligram mengder funksjonell protein for strukturelle, biofysiske og biokjemiske studier. Den første delen, flere konstruksjoner av genet av interesse er produsererd parallelt og forbigående tilført inn heftende hek 293T celler i liten skala. Påvisning og analyse av rekombinant protein skilles ut i cellekultur medium er utført ved Western blot analyse ved hjelp av kommersielt tilgjengelige antistoffer rettet mot en vektor-kodet proteinrensing tag. Deretter er egnede konstruksjoner for storskala protein produksjon forbigående tilført hjelp Polyethyleneimine (PEI) i 10-lags cellefabrikker. Proteiner utskilt inn liter volumer med aircondition medium er konsentrert i håndterbare mengder ved hjelp tangential flyt filtrering, etterfulgt av rensing ved anti-HA affinitet kromatografi. Nytten av denne plattformen er bevist av dens evne til å uttrykke milligram mengder av cytokiner, cytokin reseptorer, reseptorer på celleoverflaten, iboende restriksjoner faktorer, og viral glykoproteiner. Denne metoden ble også brukt med hell i det strukturelle fastsettelse av trimeric ebolavirus glykoprotein 5,10.
2 inkubator, som kreves. Denne prosedyren kan raskt utvides til systemer av større kompleksitet, som co-uttrykk for protein komplekser, antigener og antistoffer, produksjon av viruslignende partikler for vaksiner, eller produksjon av adenoviruses eller lentiviruses for transduksjon av vanskelige cellelinjer.
Protocol
1. Forberedelse Arbeid - konstruksjoner og cellekulturer
Før du starter protokollen, bør genet av interesse være kodon-optimalisert for uttrykk i pattedyrceller, og klonet inn i en passende uttrykk vektor ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker. For å sikre høyest mulig sjanse for vellykket uttrykk, bør flere varianter av genet av interesse bli generert. Mange pattedyr uttrykk vektorer er tilgjengelig kommersielt og har ulike rensing tags (polyhistidine, hemagglutinin, streptavidin, Halo-Tag, glutathione S-transferase, blant annet). Vi foretrekker å bruke pDISPLAY vektor, som koder for en sterk menneskelig cytomegalovirus arrangøren, en Ig κ sekresjon signal, hemagglutinin rensing tag, og har en C-terminal transmembrane anker for å målrette protein gjennom sekretoriske vei for visning på plasmamembranen. Vi pleier å sette en stopper kodon foran vektor-kodede transmembrane anchor å tillate at proteinet skal skilles ut i den betingede medium.
Humane embryonale nyre (HEK) 293T celler er allment tilgjengelig, og lett kultiveres og tilført. HEK 293T blir rutinemessig brukt til uttrykk av pattedyr proteiner, men anses biologisk og bør håndteres på biosikkerhetsnivå 2. Vennligst bruk riktig personlig verneutstyr, arbeidet skal utføres i et godkjent biosikkerhet skapet ved hjelp av aseptisk teknikk. Alt avfall og overflater skal desinfiseres i henhold til institusjonelle og statlige retningslinjer. Det anbefales at cellene skal testes for mycoplasma forurensning før bruk. Celler kan behandles med ciprofloxacin (10 mikrogram / ml) i ti dager for å utrydde enhver kilde til mycoplasma SPP. forurensning. Generelle protokoller til forplantar hek 293T celler presenteres separat (ramme 1).
Ytterligere hensyn for test-og storskala protein uttrykk er reviewed. i 11-15.
2. Småskala Test Expression
Når konstruksjoner har blitt designet og generert, småskala test transfections kan utføres ved hjelp av HEK 293T celler, en skjematisk oppsummere prosessen presenteres nedenfor (Fig. 1).
- Bruk T75 cm 2 eller T225 cm 2 cellekultur flakonger (avhengig av antall test uttrykk som skal utføres) til å vokse de hek 293T celler og dele cellene hver 2-3 dager når cellene er 100% konfluent (ramme 1).
- Seed 2.5 x 10 5 hek 293T celler per brønn i en 6-brønns plate og tilsett 2 ml DMEM med 1X penn / strep og 10% (v / v) FBS, swirl platen forsiktig for å sikre enda celle spredning i hver brønn, og inkuberes over natten ved 37 ° C i 5% CO 2 fuktet kammer.
- Når hek 293T celler nå 40% confluency, forkaste media og tilsett frisk 2 ml DMEM med 1X penn / strep og 10% (v / v) FBS til brønnene. Utførtransfeksjon analyser.
- Delmengde 90 mL serum-free DMEM i en steril 1,5 ml mikrosentrifuge tube. Pipetter 3 mL GeneJuice i serum-fri DMEM og forsiktig bland røret (finger vortex). Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 1 mikrogram MiniPrep renset plasmid DNA (DNA lager = 100 ng / mL) i DMEM-GeneJuice blanding, finger vortex, og inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur.
- Pipettering den transfeksjon blandingen dropwise på hek 293T celler, og virvel den seks-brønns plate forsiktig for å tillate jevn fordeling av transfeksjon blandingen. Inkuber 6-brønnen plate ved 37 ° C i 5% CO 2 fuktet kammer.
- Tilsett 1 ml frisk DMEM med 1X penn / strep og 10% (v / v) FBS til hver brønn 24 timer etter transfeksjon og inkuber i ytterligere 48 timer (totalt 72 timer).
- Høst 1 ml av supernatanten fra hver brønn ved tre dager etter transfeksjon og mikrosentrifuge prøvene ved 16 000 gi 10 minutter i romtemperatur. Gjennomfør WesTern blot analyse som beskrevet i boks to. Prøver kan oppbevares ved 4 ° C. Lengden av lagring ved 4 ° C er protein avhengig.
3. Storskala Test Expression og rensing
Når en konstruksjon har blitt identifisert milligram mengde uttrykk for rekombinant protein oppnås ved PEI transfeksjon av heftende hek 293T celler ved hjelp av 10-lags cellefabrikker (Fig. 2, 6360 cm 2 overflateareal). For mer utforskende undersøkelser kan mindre cellefabrikker eller T-flakonger (tabell 1) brukes.
- Rense 1 mg av DNA for transfeksjon med en MaxiPrep plasmid rensing kit. En 500 ml natten kultur av XL-1 Blå celler skal produsere minst 1 mg av rent DNA. Sjekk renhet av DNA ved å måle A 260 / A 280 ratio; bør være over 1,8.
- Skalere opp hek 293T celler til 2,0 x 10 8 celler. Hver T225 cm 2 kolbe vokst til 100% confluency contains og gjennomsnittlig på ~ 2,25 x 10 7 celler.
- Legg 1,2 L DMEM med 5% (v / v) FBS til en 10-lags celle fabrikken. Legg 2,0 x 10 8 hek 293T celler til cellen fabrikken og fordele celler jevnt til alle lag av fartøyet. Det er veldig vanskelig å visualisere confluency av celler i celle fabrikken. Som et alternativ, sette opp en T75 cm 2 kolbe med et passende antall celler, med samme celle nummer til areal forholdet som utføres med 10-laget fartøy. Overvåk dette Kolben for vekstrater. Se den tilknyttede videoen for instruksjon om håndtering av cellen fabrikken. Inkuber over natten ved 37 ° C med 5% CO 2 for å tillate celle vedlegg og vekst.
- Utfør storstilt transfeksjon når heftende hek 293T celler er 70% konfluent. Klargjør PEI-DNA transfeksjon blanding (3:1 w / w PEI til DNA ratio) i en biosikkerhet skapet ved hjelp av en steril T75 cm 2 kolbe. Bland 0,84 mg DNA med 84 ml sterilt 1X PBS, deretter legge 2,5 ml PEI (2.5 mg total PEI). Inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. Løsningen bør bli grumsete.
- Hell PEI-DNA transfeksjon blandingen langsomt inn i cellen fabrikken og grundig fordele over alle lag av fartøyet. Valgfritt: for økt uttrykk avlinger, legg valproinsyre (4 mM endelig konsentrasjon). Inkuber ved 37 ° C med 5% CO 2 i fire dager.
- Harvests supernatanten fire dager etter transfeksjon. Sentrifuger betingede media på 6000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Videre filtrere supernatanten ved hjelp av en 0,22 mikrometer Stericup vakuum filter apparat. Den 10-lag celle fabrikken kan gjenbrukes, se boks 3 for rengjøring instruksjoner. Det er viktig at rengjøringen er igangsatt umiddelbart etter supernatanten innhøstning, ikke la cellene tørke på båten overflaten.
- Konsentrer supernatanten til 75 ml med Centramate tangentiell flyten filtreringssystem.
- Legg til 500 ml PBS og re-konsentrat til 75 ml. Gjenta tre additional ganger helt buffer utveksle prøven.
- Stabilisere en 1 ml anti-HA affinitet kolonne med 1X PBS og gjelder konsentrert utvalg av tyngdekraften flyt med en hastighet <1 ml / min.
- Vask kolonnen med 30 ml 1X PBS-Tween20.
- Løs HA peptid i 1X PBS (1,0 mg / ml) og inkuber ved 37 ° C.
- Påfør 1 ml av HA peptid til anti-HA kolonne og la peptid å strømme inn i harpiks. Samle flyten gjennom. Stopp flyt når peptid løsningen når sengen høyde.
- Inkuber hele anti-HA kolonne ved 37 ° C i 15 minutter.
- Gjenta trinn 12 ytterligere to ganger.
- Påfør 1 ml 1X PBS til anti-HA kolonne og strømme inn harpiksen til den når sengen høyde. Samle flyten gjennom.
- Regenerere anti-HA kolonne med 10 ml 0,1 M glysin pH 2,2. Vask med 10 ml PBS og butikk affinitet kolonne ved 4 ° C i PBS med 0,02% (w / v) NaN 3.
- Utfør SDS-PAGE analyse og bassenget på fractions tilsvarende. Merk: HA peptid vil forstyrre Proteinkonsentrasjon målinger av A 280 eller Bradford. For å estimere mengden av protein som finnes, last 5, 10, 15, 25 mikrogram av BSA på SDS-PAGE gel som en standard og sammenligne bandet intensiteter.
Trinn 9-17 kan gjentas til fange ekstra protein fra den betingede medium.
4. Representative Resultater
I denne artikkelen beskriver vi og demonstrere en praktisk uttrykk plattform for milligram-mengde produksjon av humane proteiner som senere kan brukes til strukturelle og funksjonelle studier. Den screening av menneskelig protein konstruerer hjelp hek 293T celler i seks-brønns plater er effektivt i å identifisere konstruerer mottagelig for større skala produksjon. Kommersielle uttrykk vektorer kan tilført effektivt i hek 293T celler ved hjelp av en rekke transfeksjon reagenser, for eksempel GeneJuice, FuGene HD eller PE I. Vi anbefaler bruk av en kommersiell transfeksjon reagens, som GeneJuice eller FuGene HD, for test uttrykk, ettersom disse reagensene er mer effektive for fattigere uttrykker proteiner (Fig. 3). Konstruerer utvalgte for større skala uttrykk bør være preget av en enkelt, sterk intensitet band, svarende til riktig molekylvekt på Western blot (fig 3). Glykoproteiner kan migrere som en bredere bandet på grunn av heterogenitet i glykosylering. Vi har vist at en rekke makromolekyler, alt fra viral glykoproteiner, cytokiner, cytokin reseptorer og andre overflate proteiner, kan uttrykkes og renset for å gi millgram mengder protein ved hjelp av dette generelle uttrykket plattformen (Fig. 4).
Figur 1. Workflow skjematisk av småskala transfections.tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 2. Corning 10-lag CellSTACK for større skala protein uttrykk. Hvert lag inneholder 636 cm 2 overflateareal for celle vedlegg. En standard laboratorium CO 2 inkubator (6.0 cu. Ft) vil komfortabelt hold fire 10-lags cellefabrikker.
.. Figur 3 Småskala uttrykk for ulike utskilt proteiner Vi utførte en rekke småskala test uttrykk ved hjelp av vanlige transfeksjon reagenser:. GeneJuice, FuGene HD og PEI (a) Western blot screening av utvalgte humane cellulære proteiner (tetherin), reseptorer (IL-2R β-subenheten) og cytokiner (IL-2). Tetherin er en menneskelig membran glykoprotein som begrenser utslipp avbegynnende HIV-1 virioner 16. Den ekstracellulære domenet av tetherin eksisterer som en glykosylert, disulfide-linked dimer på ~ 36 kDa. Under reduserende forhold, som vist her, vandrer tetherin som en monomer med en tilsynelatende molekylvekt på ~ 22 kDa. Interleukin-2 (IL-2) er et cytokin (~~~HEAD=NNS 17 kDa) involvert i lymfocytt spredning 17. Det samhandler med IL-2 reseptor komplekset, hvorav IL-2R βsubunit (~~~HEAD=NNS 26 kDa) er en komponent 18. CD21 er en membran protein involvert i aktivering og modning B-celler ved komplementsystemet, og er også en reseptor for Epstein-Barr virus. Den glykosylert ekstracellulære domenet av CD21 vandrer som en monomer med en tilsynelatende molekylvekt ~ 20 kDa. (B) Western blot screening av utvalgte overflaten viral glykoproteiner (XMRV Env og ebolavirus GP). XMRV og ebolavirus glykoproteiner (transmembrane anker slettet) finnes på viral membran som trimeric pigger og er involvert i vertscellen vedleggog fusjon. Den ectodomain av XMRV Env og EBOV GP er tungt dekorert med N-koblede glykaner og migrere ved tilsynelatende molekylvekt på 70 kDa og 75 kDa, henholdsvis.
Figur 4. Renset menneskelige cellulære proteiner fra store hek 293T kulturer. Alle proteiner ble uttrykt ved hjelp av en 10-lags celle fabrikk, og konsentrert og renset av anti-HA kromatografi. Som vist av Coomassie-beiset SDS-PAGE-analyse, de ekstracellulære domener av interleukin-2 reseptor (IL-2R) α og γ subenheter migrere ved molekylvekt på 40 kDa og 46 kDa, henholdsvis. Den ekstracellulære domenet av tetherin vandrer som en dimer, under ikke-reduserende forhold, med en tilsynelatende molekylvekt 36 kDa. Merk at det er noen BSA forurensning som vises på en tilsynelatende molekylvekt på 60 kDa. I tillegg heterogeniteten av N-koblede glykaner presentere på tetherin,IL-2R α og IL-2R γ årsaker bandet utvidelse på SDS-PAGE gel. Disse komplekse-type N-linked glykaner kan fjernes ved hjelp av peptid: N-glycosidase F.
| Fartøy | Overflateareal |
| 6-brønnen plate | 9,5 cm 2 (hver brønn) |
| 100 mm retter | 55 cm 2 |
| 245 mm retter | 500 cm 2 |
| T75 cm 2 kolbe | 75 cm 2 |
| T175 cm 2 kolbe | 175 cm 2 |
| T225 cm 2 kolbe | 225 cm 2 |
| Roller flaske-regelmessig | 850 cm 2 |
| Roller flaske-utvidet overflate | 1700 cm 2 |
| 1-lags CellSTACK | 636 cm 2 |
| 2-lags CellSTACK | 1272 cm 2 |
| 5-lags CellSTACK | 3180 cm 2 |
| 10-lag CellSTACK | 6360 cm 2 |
| 40-lag CellSTACK | 25 440 cm 2 |
Tabell 1. Sammenligning av cellekultur fartøy som brukes til protein uttrykk.
Liste over reagens Oppskrifter
100X Ciprofloxacine For 10 ml løsning, tilsett 10 ml avionisert vann til 10 mg ciprofloxacine. Tilsett 10 mL 6N HCl å fullstendig oppløse ciprofloxacine.
PEI (1 mg / ml) For en 100 ml løsning, oppløses 100 mg av 25 kDa lineær PEI i avionisert vann og varme til 80 ° C. Cool løsning til romtemperatur, justere pH til 7,2, 0,22 mikrometer filter sterilisere, alikvoter og frys ved -20 ° C for long-tids lagring.
1X PBS For en L vandig løsning: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO 4 (vannfri), 0,24 g KH 2 PO 4. Juster pH av løsningen 7,4 og fyll til 1,0 L.
1X PBS-Tween-20 For en L vandig løsning: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO 4 (vannfri), 0,24 g KH 2 4 PO, 1 ml Tween-20. Juster pH av løsningen 7,4 og fyll til 1,0 L.
1X overføring buffer for en L vandig løsning: 3,0 g Tris base, 14,4 g glysin, 150 ml metanol.
1X SDS-PAGE kjører buffer For en L vandig løsning: 3,0 g Tris base, 14,4 g glysin, 1,0 g SDS.
SDS-PAGE redusere sample buffer for 10 ml: 0,6 g SDS, 3 ml glyserol, 1,8 ml 1,0 Tris-HCl 6,8 pH, 1 mg Bromophenol blå, 5% (v / v) 2-mercaptoethanol.
- Grow hek 293T celler i Dulbecco modifiserte Eagle s Medium (DMEM) supplert med 10% (v / v) fosteret storfe serum (FBS), 1x penn / strep ved 37 ° C i 5% CO 2-fuktet atmosfære.
- Observer celler under en invertert mikroskop. Når cellene er på 100% confluency og ta bort kultur medium.
- Skyll celler med 5 ml sterilt 1X PBS for å fjerne spor av serum. Kast PBS vask.
- Tilsett 2 ml 0,05% (w / v) trypsin-EDTA løsning til en T225 cm 2 kolbe (eller 1 ml av 0,05% (w / v) trypsin-EDTA for T75 cm 2 kolbe) og inkuber ved romtemperatur inntil celler løsner fra overflaten. Det er også mulig å bruke steril 1X PBS-EDTA å løsrive hek 293T celler.
- Legg 13 ml DMEM med 10% (v / v) FBS til en T225 cm 2 kolbe (eller 9 ml av DMEM med 10% (v / v) FBS for T75 cm 2 kolbe) til å hemme trypsin reaksjonen.
- Split calen 01:05. For en T225 cm 2 kolbe, tilsett 3 ml cellesuspensjon til 27 ml av frisk DMEM med 1X penn / strep og 10% (v / v) FBS i en ny kultur fartøy. For en T75 cm 2 kolbe, tilsett 2 ml cellesuspensjon til 8 ml av friske vekstmedier. Inkuber kulturer ved 37 ° C i 5% CO 2-fuktet atmosfære. Cellene skal vokse til 100% confluency innen to dager.
Boks 2. Western blot analyse
- Tilsett 10 mL SDS-PAGE redusere sample buffer til 30 mL cellekultur supernatanten. Load prøver og prestained molekylvekt markører inn på polyakrylamid geler, og electrophorese med 1X SDS-PAGE kjører buffer ved 175 V i 1 time eller til molekylvekt markører er godt løst.
- Sug den PVDF Immobilon-P membran i 100% metanol i 1 minutt for å aktivere.
- Monter Western blot apparat. Sørg for at PVDF membran vender den positive elektroden og holde alle komponenter våte med 1X overføring buffer. Avoid bobler mellom polyakrylamid gel og membran.
- Fullstendig fylle elektroforese kammeret med 1X overføring buffer og overføring i 1 time ved 100 V.
- Blokker membranen med 5% (w / v) skummet melk i 1X PBS-Tween20 i 1 time ved romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C.
- Inkuber med monoklonalt antistoff primær (dvs. 1:1000 fortynning anti-HA MAB eller annen passende antistoff) oppløst i 5% (w / v) skummet melk i 1X PBS-Tween20 i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- Vask av membranene i 1X PBS-Tween20 i 10 minutter. Gjenta to ekstra ganger.
- Inkuber med et monoklonalt antistoff sekundær konjugert med alkalisk fosfatase (1:1000 fortynning i 5% (w / v) skummet melk i 1X PBS-Tween20) i 1 time i romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C.
- Vask av membranene i 1X PBS-Tween20 i 10 minutter. Gjenta to ekstra ganger.
- Plasser membranen i en liten beholder, tilsett 5 ml alkalisk fosfatase substraTe (BCIP / NBT) løsning. Farge utvikling skal skje innen 1-5 minutter. Når ønsket bandet intensitet er nådd, vask med avionisert vann og la dem lufttørke. Farge kan blekne over tid; elektronisk skanne membraner gang tørre.
Boks 3. Rengjøring og resirkulering av cellekultur skip
Mens cellefabrikker er designet for å være enkel bruk, kan disse fartøyene resirkuleres for flere storskala transfections ved hjelp av følgende rengjøring protokollen:
- Umiddelbart etter dekantering supernatanten fra 10-laget celle fabrikken, legg 20% (v / v) blekemiddel og rist kraftig å løsne cellene. Inkuber ved romtemperatur i tre timer.
- Tøm beholderen og legg fersk 20% (v / v) blekemiddel og Inkuber ved romtemperatur over natten.
- Tøm beholderen og vaske med 1,5 L av avionisert vann. Gjenta tre ganger.
- Tømme 10-lag celle fabrikken og tilsett 0,5 L av steril 1X PBS supplert med 10X antibiotika / antimykotiske løsning. Oppbevar fartøyet ved romtemperatur og erstatte ventilering landskamper for fylling porter (standard 33 mm gjenger caps) før neste bruk. Merk: alle lag bør være helt klart etter rengjøring, hvis ikke, ikke bruk og kast cellen fabrikken i henhold til institusjonelle retningslinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 10-lags cellefabrikker er en effektiv fartøy for produksjon av milligram mengder protein. En stor fordel med å bruke cellen fabrikken over andre tradisjonelle fartøyer, for eksempel roller flasker, rist kolber eller sluk flakonger, er at de ikke krever kjøp av ytterligere laboratorieutstyr. En standard CO 2 inkubator (~~~HEAD=NNS 6.0 cu. Ft) vil lett plass til fire 10-lags cellefabrikker (Fig. 2). I tillegg har disse fartøyene krever mindre arbeid og plass enn retter, flakonger eller rulle flasker for å produsere celler og proteiner, en 10-lag celle fabrikken tilsvarer bruken av 7,5 faste roller flasker (Tabell 1). Enda viktigere, de hek 293T cellene tilpasse seg godt i fartøyene og er svært mottagelig for transient transfeksjon av PEI, og dermed gi en rimelig og effektivt alternativ til kommersielle transfeksjon reagenser. Mens cellefabrikker er designet for å være disponibel cellekultur plasticware, har vi been stand til å effektivt rense og gjenbruke disse fartøyene flere ganger uten forurensning problemer, og dermed betydelig redusere kostnadene per bruk. Forbigående protein uttrykk ved hjelp av en 10-lags celle fabrikken er i stand til å produsere ~ 1-10 mg av renset protein (Fig. 4), avhengig av protein og dets modifikasjoner. Det er mulig å gå fra kloning og småskala uttrykk til ferdigstillelse av storskala uttrykk og rensing i ca 3-4 uker. Oppsummert er dette en rask, generell plattform som er svært nyttig i produksjonen av utskilt menneskelige eller viral overflateproteiner. Dessuten kan denne plattformen også brukes til å uttrykke antistoffer, viruslignende partikler, og adenoviruses og lentiviruses for genoverføring.
Vi har listet opp nedenfor, vanlige problemer og mulige løsninger. For en mer detaljert feilsøkingsveiledning, se 14.
- Ingen eller svært lav protein uttrykk:
- Dårlig health av cellene-flekker på celler ved hjelp trypan blått for levedyktigheten og test for mykoplasma forurensning. Hvis celler har en høy passasje antall (> 25 passasjer) og vokser sakte, starte friskt med nye hek 293T celler. Transfeksjon effektivitet og protein produksjon påvirkes av alder av cellene i kultur.
- Dårlig forbigående transfeksjon-Cells skal tilført på en confluency nivå på 40%. Prosenter av DNA til transfeksjon reagens bør optimaliseres.
- Protein er ustabil eller ikke brettet-Sjekk cellepelleten for uløselig protein. Test uttrykk for andre konstruksjoner eller homologe protein.
- Ingen protein er elueres fra kolonne:
- Protein beholdes på kolonnen-Eluer protein av interesse med 0,1 M glysin pH 2,2 og analysere ved Western blot. Hvis proteinet er beholdt, bruke en høyere konsentrasjon av syntetisk HA peptid for eluering eller inkuber kolonnen ved 37 ° C i lengre perioder.
- anti-HA column er skadet-Mens kolonnen, hvis rengjort og lagret riktig, kan gjenbrukes flere ganger, vil effektiviteten i kolonnen avta over tid. Bruk en ny anti-HA kolonne.
- Protein degradering-Legg proteasehemmere og holde protein på is under hele renseprosessen.
- Protein har fremskyndet eller samlet på kolonne-Hvis proteinet er ustabilt, kan du prøve ulike konstruksjoner eller buffer forhold (dvs. pH, salter, tilsetningsstoffer, etc.) for å forbedre protein stabilitet.
- Protein klarte ikke å binde seg til kolonne-HA-tag kan bli gravlagt eller utilgjengelige. Kontroller at protein er ikke i flyten gjennom eller vaske.
- Serum albumin forurensning:
Bovine serum albumin (BSA) har en tendens til å binde ikke-spesifikt til anti-HA kvae og kan forurense HA peptid elutions. I fig. 4, vandrer BSA som et kompakt band på en tilsynelatende molekylvekt på ~ 60-65 kDa. I dette tilfellet øker Tween-20 konsentrasjonen i 1X PBS-Tween20 vask til 0,2% (v / v) og øke volumet på vask. Alternativt kan BSA forurensning fjernes med størrelse utestenging eller ionebytting kromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Ontario HIV Behandling Network Forskning driftstilskudd (ROG-G645) og Canadian Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) til JEL, og University of Toronto Fellowships til HA, FCA, og JDC. Forfatterne ønsker å takke Marnie Fusco, Dafna Abelson og Dr. Erica Ollmann Saphire ved The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) for å gi celler, ebolavirus GP uttrykk vektor og generelle råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0x10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab')2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
