Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

Summary

Suivi des changements subtils dans la progression et la cinétique des étapes du cycle cellulaire peut être accompli par l'utilisation d'une combinaison de marquage métabolique des acides nucléiques avec BrdU et totale coloration de l'ADN génomique par l'iodure de propidium. Cette méthode évite la nécessité de la synchronisation chimique des cellules de cyclisme, empêchant ainsi l'introduction de dommages à l'ADN non-spécifique, ce qui affecte à son tour la progression du cycle cellulaire.

Abstract

Un contrôle précis de l'initiation et la progression ultérieure à travers les différentes phases du cycle cellulaire sont d'une importance capitale dans des cellules proliférantes. Cycle de division cellulaire est une partie intégrante de la croissance et la reproduction et la déréglementation des principaux composants du cycle cellulaire ont été impliqués dans les événements ayant mené à de ^1,2 cancérogenèse. Agents moléculaires dans les traitements anticancéreux fréquemment cibler les voies biologiques responsables de la réglementation et la coordination de la division du cycle cellulaire ^3. Bien que la cinétique du cycle cellulaire ont tendance à varier selon le type de cellule, la distribution des cellules parmi les quatre étapes du cycle cellulaire est plutôt cohérente au sein d'une lignée cellulaire particulière en raison de la tendance constante des mitogènes et d'expression du facteur de croissance. Événements génotoxiques et autres facteurs de stress cellulaire peut entraîner dans un bloc temporaire de la progression du cycle cellulaire, résultant en l'arrestation ou d'une pause temporaire dans une phase du cycle cellulaire en particulier pour permettre institutionstion du mécanisme de réponse appropriée.

La capacité à observer le comportement expérimentalement d'une population de cellules en fonction de leur stade de progression du cycle cellulaire est un progrès important dans la biologie cellulaire. Des procédures communes telles que mitotique secouer, centrifugation différentielle ou la cytométrie de flux à base de tri sont utilisées pour isoler des cellules à des stades spécifiques du cycle cellulaire ^4-6. Ces fractionnés, du cycle cellulaire en phase enrichis populations sont alors soumis à des traitements expérimentaux. Rendement, la pureté et la viabilité des fractions séparées peuvent souvent être compromise en utilisant ces méthodes de séparation physique. De plus, le laps de temps entre la séparation des populations de cellules et le début du traitement expérimental, dans lequel les cellules fractionnées peut progresser à partir du stade du cycle cellulaire sélectionnée, qui peuvent poser des défis importants dans la mise en œuvre réussie et l'interprétation de ces expériences.

D'autres approches de study stades du cycle cellulaire incluent l'utilisation de produits chimiques pour synchroniser les cellules. Le traitement des cellules avec des inhibiteurs chimiques des principaux processus métaboliques pour chaque stade du cycle cellulaire sont utiles dans le blocage de la progression du cycle cellulaire à l'étape suivante. Par exemple, les inhibiteurs de la ribonucléotide réductase hydroxyurée cellules s'arrête à la jonction G1 / S en limitant l'offre de désoxynucléotides, les blocs constitutifs de l'ADN. D'autres produits chimiques notables comprennent le traitement avec l'aphidicoline, un inhibiteur de l'alpha-polymérase d'arrêt G1, le traitement par la colchicine et le nocodazole, qui tous deux interférer avec la formation du fuseau mitotique à arrêter les cellules en phase M et enfin, le traitement avec la chaîne d'ADN de terminaison 5-fluorodeoxyridine pour initier arrestation de la phase S ^7-9. Le traitement avec ces produits chimiques est un moyen efficace de synchroniser toute une population de cellules à une phase particulière. Avec le retrait de la substance chimique, les cellules rejoindre le cycle cellulaire à l'unisson. Traitement de la libération test suivant l'agentde la composition chimique du cycle cellulaire de blocage assure que la réponse aux médicaments a suscité provient d'un uniforme, cycle cellulaire spécifique au stade de la population. Cependant, puisque la plupart des synchroniseurs chimiques génotoxiques sont des composés connus, à démêler la participation de diverses voies de réponse (aux synchroniseurs vs les agents de test) est un défi.

Nous décrivons ici une méthode de marquage métabolique pour la suite d'une sous-population de cellules activement à vélo à travers leur progression de la phase de réplication de l'ADN, par l'intermédiaire de la division et la séparation de leurs cellules filles. Couplé avec la quantification par cytométrie en flux, ce protocole permet à la mesure de la progression de cinétique du cycle cellulaire en l'absence de l'une des mécaniquement ou chimiquement induite par cellulaire souligne souvent associée à des méthodes autres cellules de synchronisation du cycle ^10. Dans les sections suivantes, nous allons discuter de la méthodologie, ainsi que certaines de ses applications dans la recherche biomédicale.

Protocol

1. Préparation des cellules

1. Cellules de la plaque pour atteindre une densité d'environ 60% de confluence. Les cellules doivent être en phase journal au moment de la collecte. Pour les cellules MCF7, ceci est accompli par l'ensemencement de 5 x 10 ⁵ cellules / 10 cm de la plaque dans les médias appropriés. HT29 et LS180 cellules sont ensemencées à 6 x 10 ⁵ cellules / 6 cm de la plaque. Nous avons utilisé du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1x pénicilline / streptomycine. Assurez-vous de plaques de semences pour les contrôles adéquats positives et négatives dansOutre vos échantillons. Ils comprennent ce qui suit:

Je	contrôle positif	BrdU seulement
ii	contrôle positif	PI ne
iii	contrôle négatif	BrdU négative, PI négative

(Il convient de noter que d'une expérience préliminaire avec dosages répétés tels que celui décrit dans le présent protocole peut être utilisé pour affiner la période durant laquelle pour mener à bien les futures collections.)

2. Les cellules étalées sont incubées à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 24-48 h, ce qui permet aux cellules de récupérer et fixer.
3. Pour marquer les cellules avec des impulsions bromodésoxyuridine (BrdU), DMEM est remplacé wie milieu frais contenant 10 uM de BrdU. Les cellules sont incubées pendant 1 h à 37 ° C, 5% de CO ₂ pour permettre l'incorporation de BrdU pour dans l'ADN. N'oubliez pas de laisser une plaque non traitée d'agir comme contrôle négatif.
4. Les médias d'impulsion en matière d'étiquetage est enlevé et les cellules sont rincées brièvement avec du PBS 1X.
5. Des milieux de croissance frais est ajouté (moins la BrdU) et les cellules sont autorisés à continuer à incuber à 37 ° C, 5% de CO ₂ jusqu'à ce que le point de temps appropriée pour la récolte est atteint.

2. La récolte et la fixation des

1. Cellules non traitées provenant de l'étape 1.3 sont considérés comme la date jalon zéro. Cet échantillon peut être récoltée avec le point de temps 1 h qui est prélevé immédiatement après le traitement BrdU.
2. Pour récolter les cellules, les médias est enlevé et les plaques sont rincées une fois avec du PBS 1X.
3. Les cellules sont traitées à la trypsine, recueillies dans les médias la culture et par la suite par centrifugation à 1500 rpm pendant 5 min Supernatant est éliminé.
4. Rincer 1-10 x 10 ⁶ cellules dans 5 ml de glace froide PBS 1X. Centrifuger à 1500 rpm pendant 5 min surnageant est éliminé.
5. Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans 100 ul de PBS glacé / 1% de FBS. Ajout de FBS 1% dans du PBS aides en empêchant l'agglomération des cellules.
6. Ajouter ces cellules goutte à goutte à 5 ml de -20 ° C, l'éthanol à 70% pour fixer les cellules.
7. Incuber sur de la glace pendant 30 min ou conserver à 4 ° C pendant la nuit. C'est une étape idéale au cours de laquelle d'arrêter la collecte des échantillons des divers moments. Les échantillons peuvent être laissés dans l'éthanol pendant plusieurs jours, leur permettant d'être traitées simultanément par le reste du protocole.

3. La coloration BrdU et PI

1. Cellules par centrifugation pendant 5 min à 1500 rpm.
2. Retirer le fixateur, mais laisser ~ 50 ul dans lequel pour desserrer le culot au vortex.
3. Pour dénaturer l'ADN, ajouter lentement 1 ml de HCl 2N / Triton X-100goutte à goutte tout en vortex. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 min.
4. Sédimenter les cellules par centrifugation des échantillons pendant 5 min à 1500 rpm. Aspirer et jeter le surnageant.
5. Remettre en suspension le culot de cellules dans 1 ml de tétraborate de sodium 0,1 M, pH 8,5, pour neutraliser l'étape de dénaturation.
6. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 1500 rpm. Aspirer et jeter le surnageant.
7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 75 pl de mélange de coloration BrdU (50 pi 0,5% entre 20/1% de BSA / PBS + 20 pl conjugué FITC anti-BrdU + 5 pi 10 mg / ml de RNase).
8. Incuber à température ambiante pendant 45 min abri de la lumière.
9. Pour un culot de cellules, centrifuger les échantillons pendant 5 min à 1500 rpm. Aspirer et jeter le surnageant.
10. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS contenant 5 ug / ml d'iodure de propidium.

4. Cytométrie en flux

1. D'analyser les cellules, un cytomètre à écoulement équipée d'un laser de 488 nm et lafiltres appropriés est nécessaire. Logiciel d'analyse tels que CellQuest est nécessaire de créer des parcelles décrites ci-dessous.
2. Lors de l'exécution de l'échantillon dans le cytomètre en flux, créer une diffusion vers l'avant (SSC-H) vs côté de dispersion (FSC-H) complot visant à assurer la distribution de la taille adéquate des cellules (figure 1A). Ces deux paramètres sont tracées sur une échelle linéaire.
3. Visualiser simultanément une parcelle de FL3-H (PI tache) vs FL2-W (figure 1B). Cette trame est utilisée pour créer une grille (R3) pour isoler la fraction de cellules qui sont dans la configuration de distribution normale du cycle cellulaire. En général, ce schéma de répartition est caractérisée par deux groupes de cellules de la teneur en ADN 2N et 4N de marquage par le PI représentant le G1 et G2 phases du cycle cellulaire, respectivement. Une chaîne de cellules situées entre ces 2 groupes est représentatif de la réplication d'ADN continu qui se produit dans la phase S du cycle cellulaire.
4. Créer un complot displaying des cellules clos (R3) à partir de l'étape 4.3, à FL1-H (FITC, l'intrigue journal) sur l'axe des y et PI (tracé linéaire) sur l'axe des x (figure 1C). Cette parcelle sera utilisée pour définir les autres paramètres en utilisant les différentes commandes décrites au paragraphe 1.1, ainsi que pour recueillir des données pour l'analyse.
5. Placez le seul IP échantillon coloré sur le cytomètre. Réglez le gain de placer G1 à ~ 200 sur l'axe des x. Ce sera plus facile de visualiser dans un histogramme de la tache PI.
6. Un deuxième contrôle consiste à exécuter un échantillon BrdU-seulement sur le cytomètre en flux. Réglez le gain de sorte que les 2 populations de cellules BrdU (positif vs négatif BrdU) apparaissent sur la parcelle. Idéalement, les cellules BrdU négatives sont positionnés à apparaître juste en dessous de 10 ^-1.
7. Le contrôle final est l'échantillon BrdU / PI négative. Exécuter ce témoin négatif pour s'assurer que les cellules n'apparaissent pas dans l'un des quadrants supérieurs à main ou à droite.
8. Une fois les paramètres des différentes parcelles ont été fixés, lecytomètre en flux est étalonné et prêt pour le traitement de cellules BrdU et PI colorées. Un minimum de 10.000 cellules qui sont gated dans la fraction correcte PI (voir l'étape 4.3) doit être lu par collection.
9. Pour analyser les données recueillies, des logiciels tels que FlowJo ou FACSDiva sont utilisés. Chacune des parcelles mentionnées ci-dessus peuvent être recréées dans ces programmes et l'analyse quantitative et statistique réalisée.
10. Le critère d'évaluation de l'analyse comporte plusieurs étapes successives. Création d'une parcelle de FITC vs PI avec des cellules bloquées de façon positive dans la parcelle PI vs FL2-W PI permet de distinguer la population du vélo. Une seconde grille est créée à partir de ce complot, en isolant le BrdU positive de la population. Exprimant cette population particulière sur un histogramme avec PI sur l'axe des x permet de suivre l'évolution dans le temps de progression du cycle cellulaire. Cela peut être visualisée en outre en traçant le nombre de cellules positives BrdU avec G1 ou G2 contenu en tant que fonction du temps.

5. Les résultats représentatifs

Normalement, les cellules de cyclisme colorées avec de l'iodure de propidium ont pics distincts à G1 et G2, correspondant à des cellules contenant l'ADN contenu 2N et 4N, respectivement (figure 2). Pulse étiquetage avec BrdU permet de marquage sélectif d'une sous-population de cellules qui sont activement synthétiser de l'ADN (phase S ie). Peu de temps après l'enlèvement du réactif BrdU, toutes les cellules marquées sont en phase S (figure 3). En limitant l'étiquetage pour une courte impulsion on est capable de suivre ce chemin s'est distingué sous-population de cellules à travers de nombreux points dans le temps comme ils passent à travers les phases ultérieures du cycle cellulaire. Ceci peut être visualisé au point 1 h de temps de la figure 3 comme un manque flagrant de G1 et G2 pics.

Des informations complémentaires peuvent être dérivés de l'étape de marquage BrdU. Non seulement la proportion de cellules qui se divisent activement être mesurée, mais une HNEimate étape de distribution du cycle cellulaire entre deux échantillons peut être déterminée ainsi. En recueillant des cellules à des intervalles équidistants qui suivent le retrait du réactif BrdU, les cellules peuvent être tracée comme ils continuent à vélo, les progrès à G2 et, finalement, se déplacer dans la division cellulaire des cellules d'origine, enfin en train de devenir des cellules filles BrdU-positives avec G1 la teneur en ADN (figure 4). Un exemple de quantification de phase du cycle cellulaire et l'analyse cinétique est fournie à la figure 5.

Figure 1. (A) par rapport Forward Scatter Nuage de points de côté d'un représentant de population de cellules MCF7. (B) par rapport PI Largeur (FL-W) Terrain d'un représentant population de cellules MCF7. Gating est montré à exclure doublets de cellules dans l'analyse finale (R3). Doublets de cellules auront une largeur supérieure impulsion que d'une seule cellule, comme ils prennent plus de temps à passer à travers le faisceau laser et therefminerai peut être exclu de l'analyse. (C) par rapport à PI FITC (BrdU) Terrain d'une population de cellules MCF7 représentant. Gating est montré pour inclure uniquement les FITC (BrdU) des cellules positives (R4).

Figure 2. Histogramme représentant une population totale de cellules normalement vélo.

Figure 3. Histogramme des cellules qui ont été recueillies 1h après le retrait de l'impulsion de BrdU, après de déclenchement pour FITC (BrdU) de cellules positives. BrdU-positives cellules à un point de temps au début après le retrait de l'étiquette montrent des profils de PI qui correspondent à des échantillons d'ADN affichant un contenu compatible avec les cellules qui sont dans la phase S du cycle cellulaire, ce qui confirme l'étiquetage réussie de cellules que lors de la synthèse d'ADN.

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Figure 4. Comparaison de la cinétique du cycle cellulaire de progression entre les lignes cellulaires cancéreuses, les cancers colorectaux HT29 (A) et LS180 (B), ainsi que MCF7 cancer du sein (C). Les cellules ont été recueillies toutes les heures pendant 8 heures, après le retrait de l'impulsion de BrdU. Dans cette expérience, nous avons observé un profil clair de la progression du cycle cellulaire accélérée par le biais de la phase G2 du cycle cellulaire dans la lignée cellulaire LS180 colorectal. En comparant la cinétique entre les deux profils de cellules du cancer colorectal, l'émergence d'un pic G1 est évident à T = 4h l'après-BrdU dans les cellules LS180, par rapport au point de temps correspondant à la ligne cellulaire HT-29 qui n'a pas ce pic. Par rapport à une ou l'autre des deux lignées de cellules colorectales, les cellules MCF7 sont le vélo à un taux significativement réduit. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 5. (A) L'analyse quantitative de phase du cycle cellulaire des cellules cancéreuses BrdU-étiquetés. L'algorithme de Dean / Jett / Fox a été appliqué à HT29, LS180 et MCF7 (illustré en vert). Les distributions résultant du cycle cellulaire en phase de chaque échantillon sont exprimés en% Total BrdU-positives cellules pour chaque phase. Seulement sélectionner des points de temps pour chaque lignée cellulaire sont affichés, comme les analyses de quelques-uns des points dans le temps antérieurs ont produit des résultats incorrects. Dans ces points dans le temps plus tôt, toutes les cellules BrdU-positives sont dans la phase S et manquent donc de G1 distincte et les pics de G2, qui sont nécessaires pour l'application algorithme. (B) histogrammes de cellules cancéreuses affichant la cinétique de la progression à travers G2 / M phases du cycle cellulaire. La progression dans G2 / M est le plus rapide pour les phases LS180 cellules, suivie par HT29 et MCF7. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure S1. Contrôles cytométrie en flux. cellules MCF7 sont indiqués par (A) contrôle négatif où les cellules ne sont ni PI ni teinté BrdU. (B) PI ne colorées. (C) BrdU-FITC étiqueté échantillons.

Figure S2. Illustration schématique montrant la relation entre le spectre d'émission de fluorescence du PI par rapport au FITC (BrdU). Les fenêtres spectrales de collecte pour le canal fluorescent 1 (FL1, pour FITC) et le canal fluorescent 3 (LV3, pour PI) sont présentés dans les cases correspondantes. Il n'y a pas de chevauchement des spectres fluorophores entre FL1 et FL3 de détection. Evidemment, la compensation de fluorescence n'est pas nécessaire lorsque des données expérimentales de PI et FITC-BrdU co-marqués cellules sont collectées dans les canaux FL1/FL3 respectivement. Spectres de fluorescence ont été obtenus de BD Biosciences site:target = "_blank"> http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

En combinant la cytométrie de flux avec l'incorporation de BrdU, nous avons les outils nécessaires pour étudier la cinétique du cycle cellulaire. La propriété distinctive de BrdU à fonctionner comme un analogue de la thymidine est ce qui permet de quantifier la teneur en ADN d'une cellule à vélo. L'incorporation de BrdU dans un brin d'ADN fille croissante au cours de la synthèse en phase du cycle cellulaire est ce qui permet un à suivre une sous-population de cellules à vélo à travers la réplication de l'ADN dans la phase S, à une période de croissance à G2 et finalement à la division cellulaire . Daughter BrdU-positives cellules peuvent être en permanence suivis jusqu'à quel point dans le temps l'étiquette BrdU est dilué par la division cellulaire dans la mesure où le signal est réduit à des niveaux de fond.

En utilisant l'iodure de propidium pour déterminer la teneur en ADN total, nous sommes en mesure de suivre la progression du cycle cellulaire de S → G1, G2 / M →. La capacité de suivre le taux de recyclage des cellules est important et utile dans de nombreuses applications, en particulier for études pré-cliniques impliquant des médicaments spécifiques du cycle cellulaire dommages de l'ADN induisant ou pendant le processus de développement de médicaments afin de déterminer la sensibilité stade du cycle cellulaire de nouveaux composés ^11. L'avantage le plus évident d'utiliser une technique de marquage métabolique est l'élimination de la synchronisation chimique des cellules. Comme la plupart des traitements chimiques qui induisent un arrêt du cycle cellulaire sont eux-mêmes génotoxique, disséquer les effets du cycle cellulaire de sensibilité de nouveaux composés dans la présence de ces produits chimiques peuvent ne pas être réalisable.

Nous avons démontré la polyvalence de cette technique BrdU marquage métabolique avec PI co-marquage. En utilisant ce protocole, nous avons réussi à démontrer que l'augmentation de la progression du cycle cellulaire par le biais de la phase G2 / M du cycle cellulaire peut être observée dans la télomérase-négatives des cellules humaines qui ont été transformées pour avoir forcé expression de l'enzyme ^10. Bien que cette méthode est très puissant dans la mesure de la cinétique de la cellule car il cycles through étages multiples, une limitation est la perte d'informations de synchronisation pendant les transitions, ainsi que dans les phases G2 et M. Comme les cellules passer par G2 à M, nous sommes incapables de distinguer non seulement les deux phases, mais aussi la population sub-G1, basé uniquement sur la teneur en ADN. Dans les applications où cette différenciation est nécessaire, il est potentiellement possible de co-colorer les cellules BrdU marquées avec des anticorps contre les cyclines ou d'autres protéines cellulaires dont les expressions sont spécifiques à la phase désirée du cycle cellulaire ^12,13. L'optimisation supplémentaire sera nécessaire pour s'assurer que les anticorps sont compatibles avec la cycline l'étiquette BrdU et immuno-coloration protocole. Idéalement, pour bien différencier les différentes phases du cycle cellulaire, la cycline anticorps plusieurs peuvent être nécessaires pour co-étiquette d'un seul échantillon simultanément. Notre laboratoire travaille sur la post-marquage de la BrdU-impulsions cellules marquées avec la cycline B et phospho Histone 3 anticorps de distinguer entre les cellulesen phase G2 par rapport M du cycle cellulaire. Co-marquage avec des anticorps cycline, en plus de marquage par le PI et FITC-BrdU augmente sensiblement la complication de la cytométrie en flux à la fois du matériel et l'analyse des données (les questions de rémunération de fluorescence) point de vue. Avec l'avènement de la nouvelle génération de cytomètres en flux, les progrès de leurs capacités et fonctionnalités devraient atténuer ces préoccupations d'ordre technique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bromodeoxyuridine	BD Biosciences	55089
propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	1mg/ml stock
FITC anti-BrdU	BD Biosciences	347583
sodium tetraborate	Fisher Scientific	S80172	0.1M, pH 8.5
FACS Caliber	BD Biosciences