Bisulfito de mutagénesis es el estándar de oro para el análisis de la metilación del ADN. Nuestro protocolo modificado permite el análisis de metilación del ADN en el ámbito de una sola célula y fue diseñado específicamente para los ovocitos individuales. También se puede utilizar para los embriones etapa de escisión.
La epigenética abarca todos hereditarias y las modificaciones reversibles a la cromatina que la accesibilidad alter gen, y por lo tanto son los principales mecanismos para la regulación de la transcripción de genes 1. Metilación del ADN es una modificación epigenética que actúa sobre todo como una marca represivo. A través de la adición covalente de un grupo metilo a las citosinas en dinucleótidos CpG, se puede contratar a otras proteínas de represión y modificaciones de las histonas para iniciar procesos involucrados en la condensación de la cromatina y el silenciamiento de genes 2. Metilación del ADN es esencial para el desarrollo normal, ya que desempeña un papel fundamental en la programación del desarrollo, la diferenciación celular, la represión de elementos retrovirales, la inactivación del cromosoma X y la impronta genómica.
Uno de los métodos más poderosos para el análisis de la metilación del ADN es la mutagénesis bisulfito. Bisulfito de sodio es un mutágeno ADN que desamina citosinas en uracilos. Tras la amplificación por PCR y Seque ncing, estos eventos de conversión se detectan como timinas. Citosinas metiladas están protegidos de la desaminación y por lo tanto permanecen como citosinas, que permita la identificación de la metilación del ADN en el nivel individual de nucleótidos 3. Desarrollo del ensayo mutagénesis bisulfito ha avanzado de las originalmente presentadas 4-6 hacia los que son más sensibles y reproducibles 7. Un avance clave fue incrustar pequeñas cantidades de ADN en un cordón de agarosa, protegiendo así el ADN del tratamiento bisulfito dura 8. Este análisis de metilación habilitado para llevar a cabo en las piscinas de los ovocitos y blastocitos, embriones de 9. El protocolo de mutagénesis bisulfito de los más sofisticados hasta la fecha es de cada etapa de blastocisto, embriones de 10. Sin embargo, puesto que los blastocistos tienen un promedio de 64 células (que contiene 120-720 pg de ADN genómico), este método no es eficaz para los estudios de metilación en oocitos individuales o embriones etapa de escisión.
tienda "> Tomando pistas de la incrustación de agarosa de las cantidades de ADN minutos incluyendo 11 ovocitos, aquí se presenta un método por el cual los ovocitos están directamente incrustado en una solución de agarosa y lisis cordón de recuperación inmediatamente después y la eliminación de la zona pelúcida del ovocito. Esto nos permite pasar por alto los dos principales retos de la mutagénesis sola bisulfito de ovocitos:. la protección de una pequeña cantidad de ADN de la degradación y la pérdida subsecuente durante los pasos del protocolo numerosos importante, ya que los datos se obtienen a partir de ovocitos individuales, el problema del sesgo de PCR en las piscinas se elimina otra. , contaminación inadvertida célula cúmulo es detectable por este método, puesto que cualquier muestra con patrón de metilación más de un pueden ser excluidos de análisis 12. Este protocolo proporciona un método mejorado para el análisis de éxito y reproducible de la metilación del ADN en el nivel de una sola célula y se adapta idealmente de oocitos individuales, así como embriones en estado de división.Este ensayo contiene un solo ovocito muchos pasos con un número que son críticas y requieren un cuidado especial. El primero es el lavado de los ovocitos. Es particularmente importante para lavar cada oocito varias veces en medio fresco cae después del tratamiento hialuronidasa para eliminar las células cumulus como sea posible. Por otra parte, cuando la transferencia de ovocitos a la solución ácida de Tyrode para la zona pelúcida asegurarse de la eliminación medio circundante está libre de células del cumulus…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Western Ontario, el Departamento de Obstetricia y Ginecología, y una donación ER06-02-188 de la Investigación y la Innovación Ministryof, Premio al Investigador temprana. MMD fue apoyada por un programa de capacitación CIHR en la reproducción, el desarrollo temprano y el Impacto en la Salud de Becas de Posgrado (REDIH).
Table of specific reagents and equipment.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Oocyte Collection | |||
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
Proteinase K | Sigma | P5568 | |
10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
Lysis Solution | |||
Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
LiCl | Sigma | L9650 | |
EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
DTT | Invitrogen | P2325 | |
SDS Lysis Buffer | |||
TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
Bisulfite Conversion | |||
Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
M2 Medium | Sigma | M7167 | |
GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
Autoclaved double distilled (dd) water | |||
PCR | |||
Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
Inner and outer nested primers | Sigma | ||
Ligation | |||
Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
TA Cloning | |||
Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
Equipment | |||
Dissecting Microscope | |||
70°C and 90°C Heat Blocks | |||
37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
Rocker | |||
PCR machine |